炮姜炮制過程中6-姜酚的轉化規律及抗氧化活性變化研究

王學芹，卜 超，顧從文，黃保生，韓燕全，洪 燕，吳德玲

1安徽中醫藥大學第一附屬醫院 國家中醫藥管理局中藥制劑三級實驗室，合肥 230031；2安徽中醫藥大學 中藥復方安徽省重點實驗室，合肥 230012

干姜為姜科植物姜ZingiberofficinaleRose.的干燥根莖，味辛，性溫，具有溫中散寒，回陽通脈，溫肺化飲的功效[1]。炮姜是其臨床常用的炮制品，經砂燙炮制后可以緩和干姜的辛辣之性，并增加其溫經止血之功效。研究表明，姜酚類成分是姜中主要的辛辣和活性成分，包括6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚和12-姜酚等數十種，其具有抗氧化、抗炎解熱、神經保護和抗腫瘤等多種藥理活性[2-5]。姜中姜酚類成分以6-姜酚含量最高，也是《中國藥典》2020版中生姜、干姜和炮姜含量測定的指標成分?？寡趸钚允?-姜酚具有的主要藥理活性之一，6-姜酚分子結構中具有β-羥基酮以及酚羥基的結構，因此在清除羥基自由基、超氧自由基以及脂質過氧化物等方面具有很好的效果，還能有效的保護過氧化氫所致的DNA損傷，是一種性質優良的天然抗氧化劑[6,7]。課題組前期對干姜炮制前后的化學成分的定性和定量分析結果表明，干姜在炮制成炮姜后，姜酚類成分含量明顯降低，其中，6-姜酚的含量降低在15%～42%之間；而6-姜烯酚、8-姜烯酚和10-姜烯酚等成分含量則顯著升高，且在炮制過程中會有新成分姜酮的產生[8]。但是，炮制對炮姜姜酚成分轉化的規律及其活性影響等尚不完全明確，值得進一步研究。

干姜炮制成炮姜后，由于其所含姜酚類成分的“質”“量”變化，藥效作用也發生了相應的轉變。為了探討炮姜炮制過程中姜酚類成分的轉化規律以及其成分轉化對活性的影響，本實驗通過測定不同砂燙工藝的炮姜樣品中6-姜酚、6-姜烯酚和姜酮的含量變化，結合6-姜酚單體模擬炮制方法，探討6-姜酚及其轉化產物6-姜烯酚、姜酮隨炮制時間和炮制溫度的變化規律；同時，采用體外抗氧化的方法，初步驗證成分轉化與抗氧化活性的相關性，以期能為揭示炮姜的炮制機理提供依據。

1 材料

1.1 儀器

Waters Acquity UPLC超高效液相色譜儀(美國Waters 公司)；分析天平(1/10萬，上海梅特勒-托利多有限公司，ME55)；超聲波清洗儀(江蘇省昆山超聲儀器有限公司，KQ-300DE)；離心機(科大創新股份有限公司中傳分公司，KDC-16H)；酶標儀(Thermo Fisher Scientific，1510-02261C)。

1.2 試藥

6-姜酚(純度≥ 98.0%，批號13012303)、6-姜烯酚(純度為≥ 98.0%，批號DST190623-030)、姜酮(純度為≥ 98.0%，批號DST190513-032)對照品均購于成都德思特生物技術有限公司；色譜級甲醇(Sigma，批號67-56-1)；色譜級乙腈(Sigma，批號75-05-8)；屈臣氏蒸餾水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司，批號20210302)；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，上海源葉生物科技有限公司，批號TN1121CB14)；2,2′-聯氨雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS，批號HA23)、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ，批號D1417044)均購于上海笛柏生物科技有限公司。

干姜飲片購于銅陵禾田中藥飲片股份有限公司(批號20191012)，經本文通訊作者安徽中醫藥大學第一附屬醫院韓燕全主任中藥師鑒定符合《中國藥典》2020版項下性狀鑒別規定。

2 方法與結果

2.1 不同砂燙工藝對干姜中6-姜酚、6-姜烯酚及姜酮含量的影響

2.1.1 樣品的制備

稱取凈干姜飲片每份100 g，共計10份。留取一份備用，其余參考課題組前期的研究方法[9]，于(170 ± 2)、(190 ± 2)、(210 ± 2)℃分別砂燙6、7、8 min，制備成不同工藝的炮姜(見表1)。實驗中測定離鍋底1.0 cm處溫度設定為砂燙溫度，不斷翻炒至試驗設定時間，急出鍋，篩去砂子，放涼，粉碎，過40目篩，即得不同砂燙工藝的炮姜樣品粉末，實驗重復進行兩次，結果取平均值。

表1 干姜和不同砂燙工藝的炮姜樣品

2.1.2 對照品溶液的制備

精密稱取6-姜酚、6-姜烯酚、姜酮對照品適量，加甲醇制成每1 mL含6-姜酚0.831 mg、6-姜烯酚0.434 mg、姜酮0.170 mg的對照品儲備液，精密移取上述對照品儲備液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，得到系列濃度的混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液制備

取干姜和不同砂燙工藝的炮姜樣品粉末(過40目篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，稱定重量，超聲處理(功率150 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.1.4 色譜條件

色譜條件：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(2.1 × 100 mm，1.8 μm)；乙腈(A)-水溶液(B)為流動相，梯度洗脫：0～12 min，10%→75% A；12～17 min，75% A；17～18 min，75%→90% A；18～22 min，90% A；22～23 min，90%→10% A，23～25 min，10% A，檢測波長為280 nm，流速為0.25 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量：2 μL，UPLC圖見圖1。

圖1 干姜(S1)、炮姜(S2)和混合對照品(S3)的UPLC圖

2.1.5 方法學考察

2.1.5.1 檢測限與定量限

分別取6-姜酚、6-姜烯酚、姜酮對照品溶液適量，加入甲醇溶液逐步稀釋，以信噪比 3∶1時對應對照品濃度為檢測限(limit of detection，LOD)，以信噪比10∶1時對應對照品濃度為定量限(limit of quantitation，LOQ)進行測定，結果見表2。

2.1.5.2 線性關系考察

分別精密吸取“2.1.2”項下不同質量濃度的混合對照品溶液，按“2.1.4”項下色譜條件檢測，測定峰面積，以6-姜酚、6-姜烯酚、姜酮的質量濃度為橫坐標(X)，色譜峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程，回歸方程見表2。

表2 6-姜酚、6-姜烯酚和姜酮的線性回歸方程

2.1.5.3 精密度試驗

精密吸取“2.1.2”項下混合對照品溶液2 μL，按“2.1.4”項下色譜條件連續進樣6次，計算6-姜酚、6-姜烯酚、姜酮峰面積的RSD分別為0.96%、0.73%、0.18%，表明儀器精密度良好。

2.1.5.4 穩定性試驗

取10號(J10)供試品溶液，按“2.1.4”項下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、24 h進樣測定，計算6-姜酚、6-姜烯酚、姜酮的峰面積的RSD分別為2.50%、2.26%、3.16%，表明樣品中這三種姜酚類成分在24 h內穩定性良好。

2.1.5.5 重復性試驗

取5號(J5)炮姜樣品粉末，按“2.1.3”項下制備方法制備6份供試品，再按“2.1.4”項下條件測定，計算6-姜酚、6-姜烯酚、姜酮含量的平均值分別為5.02、1.03、0.09 mg/g，RSD分別為1.67%、1.56%、2.58%，表明該方法重復性良好。

2.1.5.6 加樣回收試驗

取6號(J6)炮姜樣品粉末0.25 g左右，精密稱定，共 6 份，加入各對照品母液適量，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.4”項下色譜條件測定，計算加樣回收率和RSD值，結果見表3。

表3 6-姜酚、6-姜烯酚和姜酮的加樣回收率實驗結果

2.1.6 樣品含量測定

取“2.1.3”項下的供試品溶液，按“2.1.4”項下色譜條件測定，進樣量為2 μL，根據外標法計算6-姜酚、6-姜烯酚、姜酮的含量，結果見表4。

表4 不同砂燙溫度和時間對干姜中6-姜酚、6-姜烯酚及姜酮含量的影響(n=2)

結果表明，隨著砂燙時間的延長和溫度的升高，6-姜酚含量逐漸降低，6-姜烯酚和姜酮的含量逐漸升高。其中，干姜樣品和(170±2)℃砂燙6 min的炮姜樣品中均未檢測到姜酮，在溫度和時間達到一定程度，即(170±2)℃砂燙7 min和(190±2)℃砂燙6 min時才檢測到姜酮的產生，說明姜酮為干姜經炮制后新生成的成分。

2.2 模擬炮制對6-姜酚及其轉化產物6-姜烯酚、姜酮含量的影響

2.2.1 6-姜酚模擬炮制供試品的制備

精密稱定6-姜酚對照品 5 mg左右，共21份，置于10 mL容量瓶中，留取一份備用，其余于170、190、210、230 ℃下，分別油浴4、6、8、10、12 min，放冷，加甲醇溶解定容，即得6-姜酚模擬炮制的供試品溶液。

2.2.2 6-姜酚模擬炮制產物的含量測定

取“2.2.1”項下的供試品溶液，按“2.1.4”的色譜條件進樣，6-姜酚和其模擬炮制品的代表性UPLC圖見圖2，S2～S5分別為6-姜酚170、190、210、230 ℃油浴8 min的模擬炮制品。

圖2 6-姜酚(S1)和模擬炮制品(S2～S5)的代表性UPLC圖

通過計算6-姜酚模擬炮制品中6-姜酚及其轉化產物6-姜烯酚和姜酮的含量，以含量對炮制溫度和時間作圖，得三種成分含量隨炮制時間、溫度的變化趨勢圖，結果見圖3。

圖3 6-姜酚、6-姜烯酚和姜酮含量變化趨勢(n=2)

圖3結果顯示，6-姜酚、6-姜烯酚和姜酮的含量隨油浴時間和油浴溫度的變化呈現一定的量變規律。圖3A可見，6-姜酚在油浴溫度為170 ℃時，隨著油浴時間的延長，含量呈現緩慢下降的趨勢；油浴溫度達到190 ℃、6 min時下降趨勢開始加快，當溫度達到230 ℃以上時，6-姜酚含量呈現加快下降趨勢，但6 min之后降低幅度較平緩。

由圖3B可見，6-姜烯酚含量在190 ℃以內時，隨著油浴時間的延長逐漸上升，在10 min時達到平臺期，當溫度在210 ℃以上時，上升趨勢進一步加快，但在6 min左右時開始呈現下降趨勢；姜酮的量變規律如圖3C所見，當油浴溫度在190 ℃以內時，隨著油浴時間的延長呈現緩慢上升的趨勢，當溫度在210 ℃以上時，姜酮的上升速率開始加快，且210 ℃和230 ℃均在10 min 時開始下降。

2.2.3 6-姜酚模擬炮制結果分析

根據文獻報道，姜烯酚類成分尤其是6-姜烯酚主要存在于干姜中，生姜中含量較少[10,11]。這可能與生姜在干燥過程中姜酚類成分發生脫水反應生成姜烯酚類有關，而姜酮只有在加工成炮姜過程中才出現，表明姜酮的產生需要達到一定的溫度和時間。本實驗模擬炮制的結果證實了6-姜酚在油浴加熱后生成了6-姜烯酚和姜酮，如圖2和圖3可見，其主要機理是6-姜酚在一定溫度下會發生脫水反應而生成6-姜烯酚，而在溫度達到210 ℃左右時，可引發逆羥醛縮合反應生成姜酮和己醛[12]。6-姜酚的轉化機理見圖4。

圖4 6-姜酚轉化機理圖

2.3 抗氧化活性測定

2.3.1 供試品溶液的制備

按照“2.1.3”方法制備不同砂燙工藝的炮姜樣品供試品溶液，按照“2.2.1”的方法制備6-姜酚模擬炮制產物供試品溶液，再用甲醇分別稀釋至1 mg/mL和30 μg/mL。

2.3.2 DPPH自由基清除活性

參考文獻的方法，稍加改進[13]。在96孔板中分別加入100 μL 0.1 mmol/L的DPPH-甲醇溶液和100 μL“2.3.1”項下供試品溶液，充分混勻，置酶標儀中避光孵育30 min，在517 nm 測定反應溶液的吸光度值(A)，以100 μL甲醇和100 μL供試品溶液為對照組(A1)。以100 μL DPPH溶液和100 μL甲醇為空白組(A0)。每組平行設置三個復孔，按清除率公式計算各樣品的清除率：DPPH清除率=[1-(A-A1)/A0]×100%，結果見圖5。

圖5 不同砂燙工藝的炮姜樣品和6-姜酚模擬炮制產物對DPPH的清除作用

炮姜樣品和6-姜酚模擬炮制產物的DPPH清除率均隨炮制時間的延長和溫度的升高逐漸降低。由圖5A所示，當砂溫度在190 ℃、時間7 min以內時，炮姜樣品的DPPH清除率會緩慢降低，當溫度在210 ℃、時間8 min以上時，DPPH清除率則會顯著降低；由圖5B所示，6-姜酚模擬炮制產物比炮姜樣品更易受溫度和時間的影響，其DPPH清除率在油浴190 ℃、4 min時即出現顯著下降變化。

2.3.3 ABTS 自由基清除活性

參考文獻的方法，稍加改進[14]。將7.4 mmol/L ABTS溶液與2.6 mmol/L過硫酸鉀溶液混合，置于暗處孵育12 h，得ABTS儲備液。使用前將ABTS儲備液用蒸餾水稀釋至ABTS工作液。在96孔板中分別加入20 μL供試品溶液和180 μL的ABTS工作液，于室溫孵育6 min后，在734 nm處測量反應溶液的吸光度值(A)，以20 μL供試品溶液和180 μL蒸餾水為對照組(A1)，以20 μL ABTS和180 μL蒸餾水為空白組(A0)，按清除率公式計算各樣品的清除率：ABTS清除率=[1-(A-A1)/A0]×100%，結果見圖6。

圖6 不同砂燙工藝的炮姜樣品和6-姜酚模擬炮制產物對ABTS的清除作用

由圖6A所示，炮姜樣品的ABTS清除率變化趨勢與DPPH清除率結果相似，其中下降最顯著的為210 ℃砂燙8 min的炮姜樣品，下降了16.32%，相同時間下，溫度越高，ABTS清除率下降越顯著；由圖6B可見，6-姜酚模擬炮制產物的ABTS清除率變化趨勢總體呈逐漸下降的趨勢，并隨著油浴時間的延長和溫度的升高逐漸顯著。

2.3.4 總還原能力測定(FRAP法)

參考文獻的方法，稍加改進[15]。將100 mL 300 mmol/L乙酸鹽緩沖液，10 mL 10 mmol/L TPTZ工作液，10 mL 20 mmol/L FeCl3溶液混合，避光保存，得FRAP工作液，于96孔板中分別加入20 μL供試品溶液和180 μL的FRAP工作液，振搖混勻，在室溫下反應30 min，于593 nm處測定吸光度值(A樣)；以甲醇為空白組記(A0)。

以不同濃度FeSO4溶液的吸光度值為縱坐標，質量濃度為橫坐標，繪標準曲線，FeSO4的回歸方程為A= 0.837 5X+ 0.057 3(r= 0.999 1)，在質量濃度為0.239～1.217范圍內線性關系良好。以公式A=A樣-A0計算，代入上述標準曲線，計算FeSO4當量，結果見圖7。

圖7 不同砂燙工藝的炮姜樣品和6-姜酚模擬炮制產物的總還原能力

由圖7A所示，炮姜樣品的總還原能力的變化趨勢與DPPH和ABTS清除率變化趨勢一致，210 ℃的炮姜樣品的總還原能力隨砂燙時間的延長逐漸降低后趨于穩定；在圖7B中，模擬炮制產物的總還原能力在油浴時間較短時，沒有明顯的變化規律，當油浴時間延長至10、12 min時，總還原能力才呈現逐漸降低的趨勢。

2.4 6-姜酚含量與抗氧化性相關性分析

為了排除干姜和炮姜樣品中其他成分對抗氧化活性的影響，實驗以6-姜酚及其模擬炮制產物作為研究對象，采用SPSS 23.0軟件對模擬炮制產物中6-姜酚含量與DPPH清除率、ABTS清除率和總還原能力等抗氧化性指標進行相關性分析，Prism graphpad 8.0.1繪圖，結果見表5和圖8。

表5 6-姜酚含量與抗氧化性相關性分析

圖8 6-姜酚含量與抗氧化性相關性分析熱圖

由表5和圖8可知，6-姜酚含量與ABTS清除率在0.01水平極顯著正相關，6-姜酚含量與DPPH清除率、FRAP 清除率在0.05水平顯著正相關，因此6-姜酚含量與抗氧化性之間存在相關性。

3 討論與結論

課題組前期在炮制溫度180～200 ℃，炮制時間6、7、8 min中優選炮姜的炮制工藝，本實驗在此基礎上選取了170±2、190±2、210±2 ℃分別炮制6、7、8 min的工藝，制備不同砂燙工藝的炮姜樣品。預實驗對6-姜酚模擬炮制的溫度和時間進行了考察，發現油浴溫度在170 ℃以下時，6-姜酚模擬炮制產物中未能檢測到姜酮，當油浴溫度在250 ℃，油浴時間15 min時，6-姜酚模擬炮制產物已出現碳化現象，因此我們選取油浴溫度170、190、210、230 ℃，時間4、6、8、10、12 min 來作為6-姜酚模擬炮制的條件考察。

通過不同砂燙工藝炮姜樣品中6-姜酚含量及抗氧化活性結果分析，可以看出當砂燙溫度在(190±2)℃、時間7 min以內時，炮姜樣品的外觀符合炮制品質量要求，其6-姜酚的含量也滿足炮姜的質量控制要求，對抗氧化活性的影響也較小。因此，在確定炮姜的炮制工藝時，砂燙溫度應選擇在190 ℃左右，砂燙時間7 min為宜，這與課題組前期優選的炮姜炮制工藝195 ℃，7 min相近。6-姜酚模擬炮制結合體外抗氧化實驗的結果表明，其含量與抗氧化活性之間存在顯著正相關，即隨著炮制時間的延長和炮制溫度的升高，6-姜酚部分轉化為6-姜烯酚和姜酮，使得炮姜的抗氧化活性也逐漸降低減弱，這表明炮制加工會在一定程度上減弱炮姜樣品的抗氧化活性。

本文對6-姜酚模擬炮制產物中6-姜酚及其轉化產物6-姜烯酚和姜酮的量變規律及對抗氧化活性的影響進行了初步研究，因6-姜酚含有酚羥基和β-羥基酮，有較明確的抗氧化活性，因此選擇了體外抗氧化這一指標，能夠初步體現其活性變化。由于干姜炮制成炮姜，主要增強了其溫經止血功效，我們后續將更有針對性地選擇與炮姜功效相關的指標如凝血、止血等，通過細胞實驗和整體動物實驗綜合評價炮制過程中姜酚類成分轉化對炮姜功效的影響。