蟾酥抗腫瘤臨床應用及其療效機制的研究進展

劉 娟,童明慧,郭英球,李 娟,3*

1湖南中醫藥大學；2長沙歐邦生物科技有限公司；3湖南省中藥活性物質篩選工程技術研究中心,長沙 410208

惡性腫瘤嚴重地威脅了人類健康及生命，臨床上主要以手術、靶向、藥物及放化療等手段綜合治療。中醫藥在治療惡性腫瘤中，具有一定優勢和特點，中醫認為腫瘤的病機主要是正氣虛弱，外邪入侵，根據惡性腫瘤的病因病機，中藥治療在辨證論治基礎上，分別施以扶正固本、軟堅散結、活血化瘀、理氣行滯、清熱解毒[1]。蟾酥(Bufonis Venenum)為蟾蜍科動物中華大蟾蜍(BufobufogargarizansCantor)或黑眶蟾蜍(BufomelanostictusSchneider)的干燥分泌物。其性味辛，溫，有毒、歸心經，具有解毒、止痛，開竅醒神之功效，用于治療癰疽疔瘡，咽喉腫痛，中暑神昏，痧脹腹痛吐瀉[2]，是一味優良的抗腫瘤中藥。現代藥學研究表明，蟾酥主含蟾蜍內酯類、蟾毒色胺類和甾醇類等化合物，已證明蟾蜍內酯類是蟾酥抗腫瘤的主要藥效物質基礎，目前，已從蟾酥中分離鑒定出142種該類成分[3]。其主要成分蟾毒靈、脂蟾毒配基和華蟾酥毒基在2020年版《中國藥典》蟾酥藥材質量標準中作為含量測定的指標成分，規定這三個化合物的總含量不低于7%。由蟾酥單味藥材開發的華蟾素三種劑型(注射液、膠囊和片劑)和蟾酥注射液，治療中、晚期腫瘤具有較好的臨床療效，尤其是對原發性肝癌、肺癌、食管癌和胃癌作用效果顯著，能增強機體免疫力，減少放化療的毒副反應，并提高患者生存質量、延長壽命等[4]。鑒于蟾酥優良的抗腫瘤作用，本文綜述了近五年蟾酥及其制劑抗腫瘤的作用機理和臨床應用，為蟾酥的深入研究和開發應用提供指導依據。

1 臨床應用

蟾酥始載于《藥性論》，原名蟾蜍眉脂。古籍《醫學入門》記載：“主癰疽疔腫瘰疬，一切惡瘡頑癬”；《本草綱目》載：“治發背疔瘡，一切惡腫”。在古人用治惡瘡腫毒的經驗的啟發之下，現代中醫將其用于各種癌腫，有攻毒抗癌、消腫止痛之效。如《抗癌治驗本草》記載，以之與露蜂房、鴉膽子、玳瑁等配伍，治療肺癌；以之與乳香、沒藥、雄黃等配伍，治療乳腺癌等。基于前人的應用基礎，采用現代藥物制劑技術，將蟾酥開發成多種制劑。目前，已上市銷售的用于治療腫瘤的蟾酥制劑除單味藥的華蟾素三種制劑和蟾酥注射液外，還有復方制劑鶴蟾片和仙蟾片等。近年來，國內外學者多采用隨機對照的臨床試驗方法對蟾酥注射液，華蟾素及仙蟾片等進行臨床評價，研究證實，蟾酥制劑在各種惡性腫瘤的治療中效果顯著。

1.1 單用蟾酥制劑的臨床評價

臨床常單用華蟾素制劑治療多種中、晚期腫瘤，與白介素-2、水飛薊賓葡甲胺片，以及硫酸嗎啡控釋片等相比，作用效果顯著，不良反應少(見表1)。

表1 單用蟾酥制劑抗腫瘤的臨床療效

1.2 聯合應用

蟾酥制劑常與放/化療方案聯用，治療惡性腫瘤，不僅可以增加化療藥的療效，顯著降低腫瘤標志物水平，而且可以明顯緩解臨床癥狀、抑制炎癥反應、減少患者復發與轉移的作用趨勢(見表2)。

表2 蟾酥制劑聯合放/化療方案抗腫瘤作用的臨床療效

1.3 不良反應

華蟾素注射液中吲哚類生物堿，主要成分5-羥色胺對血管有強烈的刺激和收縮作用，靜脈炎是發生率最高的不良反應[22]。少數患者在治療過程中還會出現皮疹、發熱、寒戰、過敏性休克等癥狀，在接受對癥處理后所有癥狀都得以緩解[23]。目前沒有華蟾素注射液致死的病例報告[24]。另報道，華蟾素口服制劑給藥期間，患者會出現腹痛，腹瀉等胃腸道不適，但隨著時間延長，這種情況多可耐受[25]。上述研究結果提示，蟾酥制劑在臨床應用存在一定的不良反應，但嚴格遵循說明書用藥，加強用藥監測，能有效保障其用藥的安全性。

華蟾素是臨床應用最多的蟾酥制劑，自20世紀80年代投入臨床應用以來，已廣泛應用于各種中、晚期惡性腫瘤以及癌癥疼痛的治療，為二類中藥保護品種，被收錄于《國家基本醫療保險、工傷保險和生育保險藥品目錄》和《國家基本藥物目錄》中。華蟾素制劑單用時，可有效控制腹水量、改善機體凝血功能、降低肝細胞炎癥指標以及緩解疼痛，提高患者的生活質量；與化療藥物或其他治療手段聯用時，不僅可提升化療藥物的抗腫瘤作用，而且可減輕化療藥物引起的惡心嘔吐、骨髓抑制、脂質代謝異常、腸胃粘膜損傷等一系列不良反應。蟾酥注射液作為一種腫瘤輔助治療藥物，常與化療藥物聯合使用，與單用化療藥物相比，患者血清中CA125、CA199等癌癥標志物的含量顯著降低，并能有效糾正患者T淋巴細胞亞群比例失調，減輕免疫功能的損害。

2 作用機理研究

藥學工作者對蟾酥中單體化合物及其制劑的抗腫瘤作用進行了深入研究。單體化合物主要集中在蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基、蟾毒它靈、沙蟾毒精等蟾蜍內酯類成分，其制劑主要研究華蟾素三種制劑和蟾酥注射液，華蟾素是由中華大蟾蜍干燥皮經水提醇沉和不同工藝制備而成的制劑，主要含有蟾蜍內酯類、生物堿類、多肽類、膽固醇類等成分；蟾酥注射液是由從中華大蟾蜍耳后腺和皮膚腺的干燥分泌物中提取的有效成分精制而成的滅菌水溶液，主含蟾毒內酯類、生物堿類成分。研究發現其主要通過抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移，促進腫瘤細胞凋亡、誘導腫瘤細胞自噬，逆轉腫瘤多藥耐藥等方面發揮抗腫瘤的作用。

2.1 誘導腫瘤細胞周期阻滯

細胞周期主要分為DNA合成期(G1期、S期，G2期)和細胞分裂期(M期)，蟾酥可以通過調控周期蛋白依賴性激酶、細胞周期蛋白，以及一系列原癌基因的表達將細胞阻滯于不同時期(見表3)。

表3 蟾酥對腫瘤細胞周期的阻滯作用

2.2 誘導細胞凋亡

凋亡是一種基因控制的自殺程序，誘導癌細胞凋亡已被確定為治療癌癥的有效方法之一。目前對凋亡機制的研究主要匯集在三個方面：內源性途徑、外源性途徑、內質網應激介導凋亡途徑。

內源性途徑又稱為線粒體途徑，Bcl-2家族蛋白是控制該途徑的主要調節分子。Bcl-2家族蛋白可分為抗凋亡因子(Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-x、BAG等)和促凋亡因子(Bax、Bid、Bak、Bad、Bcl-10、Bim等)，通過調控Bcl-2家族蛋白引起線粒體膜的通透性增強，細胞色素(cytochrome，Cyto)C的釋放，從而誘導細胞凋亡。Han等[36]證實異沙蟾毒精可上調結直腸癌細胞SW620和HCT116中促凋亡蛋白Bax表達，并協同線粒體內膜轉運蛋白腺苷酸轉運體(adenine nucleotide transporter，ANT)共同增強線粒體的膜通透性，降低線粒體跨膜電位，從而誘導細胞SW620和HCT116通過線粒體途徑實現凋亡。活性氧(reactive oxygen，ROS)在細胞的凋亡中起著重要作用，華蟾酥毒基刺激人骨肉瘤細胞U2OS和143B細胞產生過量ROS，誘導線粒體雙層膜通透孔開放，進而引起線粒體損傷，最終導致細胞凋亡[37]。Wu等[38]證明蟾毒靈可通過增加人結直腸癌細胞HCT-116和SW620中ROS的蓄積，激活線粒體介導的半胱天冬酶(caspase，Casp)級聯凋亡途徑，促進凋亡。除上述ROS介導的凋亡，線粒體凋亡信號通路還涉及諸多促凋亡蛋白基因、抑癌基因的表達。蟾毒靈可破壞人惡性膠質瘤細胞U87線粒體膜的完整性，觸發氧化應激，進而催化U87細胞DNA雙鍵斷裂，誘導下游腫瘤抑制基因p53核轉錄增加、促使聚ADP-核糖聚合酶(poly-ADP-ribose polymerase，PARP)裂解，上調凋亡相關蛋白Bax、Casp-9的表達，從線粒體途徑發揮誘導腫瘤細胞凋亡的作用[39]。

外源性途徑又稱為死亡受體途徑，是一條主要的細胞凋亡調控途徑。細胞表面的死亡受體與特定的死亡配體結合后通過信號級聯反應激活Casps，導致不同蛋白質的剪切，進而啟動細胞凋亡。蟾毒靈能夠誘導人膀胱癌細胞T24外源性凋亡，即上調死亡受體(death receptor，DR)-5蛋白水平，激活Casp-8，活化下游效應分子Casp-3、7，并使PARP裂解，從而促使細胞凋亡[40]。Yang等[41]報道不同濃度華蟾素溶液可上調自殺相關因子(factor associated suicide，Fas)及其配體FasL、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-αR、DR-4的蛋白水平誘導人膀胱癌細胞T24和EJ外源性凋亡，并上調Bax/Bcl-2蛋白比例，促使線粒體釋放Cyto C激活線粒體途徑，放大凋亡信號，促進腫瘤細胞凋亡，從而抑制T24裸鼠異位移植瘤的生長。

內質網是細胞內Ca2+含量最多的細胞器，Ca2+穩態失衡時，細胞內環境被擾亂，引起內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，并進一步激發未折疊蛋白反應，誘導下游轉錄因子C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)表達，激活c-Jun氨基末端激酶(c-JunN-terminal kinase，JNK)信號通路，并活化Casp-12啟動凋亡程序。蟾毒它靈誘導CHOP表達以及蛋白激酶R樣內質網激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)和跨膜蛋白肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme 1，IRE1)磷酸化，促使Casp-12激活，觸發ERS誘導人骨肉瘤骨細胞MG-63凋亡[42]。蟾毒靈可活化肝癌細胞HepG-2和Huh-7，白血病細胞K562和K562/A02中內質網跨膜蛋白IRE1α，增加JNK蛋白磷酸化，通過作用于IRE-JNK通路誘導ERS，致使細胞凋亡[43，44]。

2.3 抑制腫瘤細胞侵襲和遷移

當腫瘤細胞具備高侵襲、高遷移能力時，可從原發部位，經淋巴道，血管或體腔等途徑到達其他部位繼續生長。這一轉移過程涉及細胞外基質(extracellular matrix，ECM)屏障被破壞、原部位腫瘤血管新生、上皮細胞-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)后細胞侵入體循環，從循環系統再植入新的器官組織并隨之增殖。華蟾素注射液可抑制人肝癌細胞HepG2中血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factors，VEGFs)、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)-2、9蛋白過度表達，避免ECM屏障被破壞，使腫瘤細胞的侵襲和轉移受阻[45]。內皮細胞HUVEC的分裂和增殖是腫瘤血管生成的重要條件，華蟾酥毒基劑量依賴性誘導BALB/c裸鼠結腸腫瘤組織中HUVEC內皮細胞ROS聚積，下調HUVEC細胞中Bcl-2和低氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor，HIF-1α)蛋白水平，使蛋白激酶 B(protein kinase B，PKB/Akt)/哺乳動物類雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)磷酸化減少，阻礙內皮細胞Akt/mTOR/HIF-1α通路，顯著減少血管生成數目，抑制裸鼠瘤體生長[46]。蟾毒靈可通過抑制人肝癌細胞BEL-7402糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)Ser9位點的磷酸化和β-catenin的核轉位，下調Wnt/β-catenin信號通路下游分子MMP-7、環氧化酶(cyclooxygenase，COX)-2和Cyc D1蛋白表達，增加細胞膜上腫瘤抑制因子E-鈣黏蛋白(E-cadherin，E-Cad)和β-catenin的表達，從而增加E-Cad/β-catenin復合物數量，以阻斷EMT[47]。沙蟾毒精(8 nM)顯著增加人前列腺癌細胞PC3細胞中E-Cad和胞質緊密粘連蛋白1(zonula occludens-1，ZO-1)表達，降低E-Cad轉錄抑制因子E盒結合鋅指蛋白1(zinc finger E-box binding homeobox 1，ZEB1)和波形蛋白(vimentin，Vim)表達，抑制EMT的發生[48]。

2.4 誘導腫瘤細胞自噬

華蟾素可上調自噬標志分子微管相關蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain 3，LC3)以及p62蛋白表達，提高Bax/Bcl-2的比例，同時觸發人膀胱癌細胞T24的凋亡和自噬[49]。蟾毒靈使人結直腸癌細胞LoVo中自噬相關基因(autophagy-related gene，Atg)-5、7，12和Beclin-1蛋白表達增加，同時，LC3-I轉化為LC3-II，通過自噬途徑發揮抗腫瘤作用[50]。研究表明，ROS-JNK 通路的激活與細胞自噬的關系密切。蟾毒靈在人結直腸癌細胞 HT-29 和 Caco-2 中可促進 ROS 的形成和積累，進而激活 JNK 信號通路，上調細胞中 LC3-II、Beclin-1、Atg-5 蛋白表達，應用 ROS、JNK 抑制劑后，可削弱蟾毒靈誘導自噬的能力，提示蟾毒靈誘導人結直腸癌細胞自噬與 ROS-JNK途徑相關[51]。同時，華蟾酥毒基可通過ROS/JNK/p38途徑誘導人骨肉瘤細胞U2OS發生自噬[52]。蟾蜍硫堇下調H22肝癌荷瘤小鼠血清中白介素(interleukin，IL)-6水平，抑制腫瘤組織中轉錄激活因子(signal transducers and activators of transcription，STAT)3和蛋白酪氨酸激酶(janus kinase，JAK)-2的過度激活，發揮抗炎活性，并上調自噬相關蛋白LC3-II、Atg-5、7和Beclin-1表達水平，通過抑制IL-6/JAK/STAT3通路誘導細胞自噬的發生[53]。

2.5 逆轉腫瘤多藥耐藥

多藥耐藥是腫瘤臨床治療中導致治療失敗和疾病復發的主要原因之一，多藥耐藥的誘發機制復雜，蟾酥因其多靶點的優勢在逆轉腫瘤多藥耐藥應用中有巨大的潛力。華蟾毒它靈可促進鼻咽癌細胞5-8F中抑癌基因FOXO1的表達，進而抑制5-8F細胞相互蛋白非肌性肌球蛋白重鏈-9(non-muscle myosin heavy chain 9，MYH9)基因的表達，增加順鉑化療的敏感性，協同抑制鼻咽癌細胞侵襲[54]。華蟾毒它靈與吉非替尼聯用，抑制肺癌細胞A549中Cyc A、Cyc D、CDK-2、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)的蛋白表達，阻礙肝細胞生長因子受體c-Met進一步擴增，靶向HGF/c-Met通路降低細胞的活力，加速細胞的凋亡進程[55]。腫瘤干細胞具有極強的DNA損傷耐受能力，易對化療藥物產生耐藥性。蟾毒靈顯著抑制結直腸癌細胞HCT116和LoVo的干性，降低干性標記物跨膜糖蛋白CD133、CD44，八聚體結合轉錄因子4(octamer-binding transcription factor 4，OCT4)以及耐藥蛋白ABCG2的表達，在體內外均可逆轉結直腸癌細胞對順鉑的耐藥[56]。

綜上所述，蟾酥抗腫瘤作用涉及細胞增殖、侵襲、轉移、凋亡及自噬等多個方面，從細胞水平研究蟾酥抗腫瘤機理，以蟾酥中蟾蜍內酯類成分為主，蟾毒靈是其中研究最多的化合物，它可以通過促進抑癌基因的表達、調節ROS水平、誘導DNA損傷、阻斷EMT的發生，上調自噬基因的表達以及逆轉腫瘤細胞對順鉑的耐藥性等，在腫瘤發生發展的各個階段發揮作用。除蟾毒靈外，華蟾酥毒基、蟾毒它靈、沙蟾毒精等亦具有良好的抗腫瘤活性。

3 結語

臨床應用中，蟾酥制劑除抗腫瘤作用外，還有顯著的機體免疫調節作用，對比機制研究，并未檢索到與免疫直接相關的報道，可能與主以蟾蜍內酯類單體化合物研究為主，這類成分無免疫調節作用。蟾酥制劑發揮免疫調節作用可能與華蟾素和蟾酥注射液的制備工藝中保留了大量活性多肽等水溶性物質有關，但相關研究報道極少[57，58]。蟾酥抗腫瘤作用機制的研究報道較多，并涉及腫瘤發生發展的各個過程，但研究大部分集中在體外細胞實驗，機制研究缺乏機體完整統一的內環境和神經體液調節。同時，多篇文獻報道，蟾蜍內酯類成分在一定濃度范圍內，對正常細胞有細胞毒作用，如，華蟾酥毒基對腦神經元細胞HCN-2的IC50值42.5 μmol/L，其抑制作用主要與細胞中ROS以及Ca2+失衡有關[59]，并對人肺上皮細胞BEAS-2B的IC50值22.3 μmol/L[60]；蟾毒靈和沙蟾毒精對人食管上皮細胞Het-1A的IC50值分別為10.1和11.8 μmol/L[61]；脂蟾毒配基抑制胰腺導管上皮細胞HPDE的活力，IC50值58.12 μmol/L[62]。由此分析蟾蜍內酯類既是抗腫瘤的藥效物質，又是毒性成分，但毒性是相對的，通過控制安全用藥劑量，可降低對正常細胞的毒性作用。因此，在細胞水平的研究基礎上，開展動物體內機制研究，明確蟾蜍內酯類成分的治療劑量和毒性劑量，為指導臨床安全、有效用藥，是極其必要的。此外，在蟾蜍內酯類成分研究基礎上，開展蟾酥多肽和蟾毒色胺類等藥效物質和機理研究，進一步研究蟾酥抗腫瘤的量-效-毒作用規律及作用機理，以充分發揮蟾酥扶正固本和清熱解毒的治療優勢，為蟾酥抗腫瘤的安全、合理用藥，擴大臨床適應癥提供重要的科學依據。