陰虛型原發性干燥綜合征患者調節性B淋巴細胞、IL-17水平與血液系統受累情況的相關性分析*

梅寒穎 劉炬 湯曾耀 胡玲 江敏 石春紅

陰虛型原發性干燥綜合征（PSS）是一種慢性自身免疫性疾病，在中醫學上導致的主要原因是燥邪損傷津液，同時五臟六腑失去濡潤，所以陰虛是其主要的發病機制[1]。唾液腺、淚腺等外分泌腺存在淋巴細胞浸潤，同時血清中存在著自身抗體是本病的主要特點。其臨床表現是口眼干燥、肢體疼痛及疲勞等，同時患者還會出現系統受累情況，尤其是血液系統出現受累[2]。根據李婭等[3]的統計，對PSS 患者進行調查，血液系統受累率達到35.1%，其中青年患者血液系統受累率更高。有研究顯示，調節性B 淋巴細胞（Breg）及白細胞介素-17（IL-17）與PSS 的發展有著密切的關系。IgG 是一種抗體蛋白，其水平可以表明血液系統受累情況。本研究通過檢測Breg、IL-17 水平，分析兩者水平與血液系統受累情況的相關性，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取九江市第一人民醫院風濕免疫科2020 年1 月-2021 年4 月收治的PSS 患者62 例為研究對象。納入標準：（1）符合文獻[4]陰虛型原發性干燥綜合征診斷標準；（2）均為初治；（3）年齡>18 歲；（4）入院前未接受任何治療。排除標準：（1）合并內分泌系統疾病；（2）合并其他風濕性疾病；（3）多臟器功能衰竭；（4）既往有卵巢手術史；（5）存在精神障礙；（6）合并其他需要服用長期藥物治療的疾病。根據患者是否發生血液系統受累，將患者分為血液系統受累組（22 例）和無血液系統受累組（40 例）。本研究以通過本院醫學倫理委員會審核批準，患者及家屬積極配合，簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 Breg 細胞水平 于清晨抽取兩組患者2 mL的肘靜脈血，經過抗凝處理后在流式細管中加入肘靜脈血100 μL，編碼后去送檢；在流式細管分別加入APC-CD19 單抗、FITC-CD24 單抗、PE-CD38 單抗各20 μL，混合均勻后在室溫下避光放置30 min，然后加入150 μL 的紅細胞裂解液，震蕩混勻后在冰箱中冷藏30 min，在2 000 r/min 的離心機上離心10 min，棄上清液，用PBS 液將白細胞沉淀清洗3 次，然后在2 000 r/min 的離心機上離心10 min，循環2 次，在沉淀中加入PBS 液500 mL 制成單細胞懸液，再用濾網過濾，最后使用流式細胞儀進行檢測。

1.2.2 IL-17 水平 ELISA 法檢測，于入院第2 天清晨抽取兩組患者空腹的外周靜脈血取5 mL，在室溫中放置2 h，在1 000 r/min 的離心機中離心20 min，將上清液血清放在-80 ℃中儲存。在檢測前將標準品震蕩混勻，洗滌緩沖液是由洗滌液按照1︰20 稀釋的，然后分別往預先包被IL-1A 抗體的包被孔中依次加入標準品和樣本，加入50 μL 不同濃度的標準品在孔板中，在樣本孔中加50 μL 待測樣本，在空白孔中加50 μL 樣本稀釋液。加完后在每孔中加入100 μL 辣根過氧化物酶標記的檢測抗體，將反應孔用封板膜封住，用37 ℃水浴鍋溫育60 min 后棄液體，將吸水紙上排干，每孔再加350 μL 洗滌液，靜置1 min。將洗滌液甩去，拍干吸水紙，反復此動作4 次，在每孔中加入100 μL 的底物，在37 ℃避光孵育15 min，每孔加入50 μL 終止液，最后用酶標儀在150 nm 波長處檢測IL-17水平。

1.2.3 IgG 水平 操作步驟嚴格按照試劑盒說明書要求進行，采集所有患者空腹外周靜脈血，分離血清待測。采用酶聯免疫吸附實驗（ELISA），根據每孔吸光度及標準曲線計算IgG 水平。

1.2.4 血液系統受累診斷標準 結合山東省各地市級醫院標準制定，（1）貧血診斷標準：男性血紅蛋白<120 g/L，女性血紅蛋白<110 g/L；（2）白細胞受累診斷標準：白細胞計數<3.5×109/L；（3）血小板受累診斷標準：血小板及時<100×109/L；（4）紅細胞受累診斷標準：男性紅細胞<4.0×1012/L；女性紅細胞<3.5×1012/L[5]。依據IgG 水平分為輕中重，輕度組：13.0 g/L≤IgG≤15.0 g/L；中度組：15.0 g/L20 g/L。

1.2.5 相關性分析 采用Pearson 相關性分析陰虛型原發性干燥綜合征患者Breg、IL-17 水平與IgG的相關性。

1.3 觀察指標（1）比較兩組一般資料，包括年齡、性別、病程、體重指數、吸煙史、飲酒史、高血壓史、糖尿病史。（2）比較各組患者Breg 細胞水平、IL-17 水平及IgG 水平。（3）分析Breg、IL-17 水平與IgG 水平的相關性。

1.4 統計學處理 采用SPSS 22.0 統計學軟件處理數據。計量資料用（）表示，組間比較采用t 檢驗，多組間比較采用方差分析，計數資料用率（%）表示，比較采用χ2檢驗，相關性用Pearson 相關性分析，以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般資料比較 兩組一般資料比較，差異均無統計學意義（P>0.05），具有可比性，見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 兩組Breg、IL-17、IgG 水平比較 血液系統受累組患者Breg、IL-17、IgG 水平均高于無血液系統受累組，差異均有統計學意義（P<0.05），見表2。

表2 兩組Breg、IL-17、IgG水平比較（）

表2 兩組Breg、IL-17、IgG水平比較（）

2.3 不同程度血液系統受累患者Breg、IL-17、IgG水平比較 與輕度組相比，中度組和重度組患者Breg、IL-17 水平均升高；與中度組相比，重度組患者Breg、IL-17 水平均升高（P<0.05），見表3。

表3 不同程度血液系統受累患者Breg、IL-17、IgG水平比較（）

表3 不同程度血液系統受累患者Breg、IL-17、IgG水平比較（）

2.4 陰虛型原發性干燥綜合征患者Breg、IL-17 水平與血液系統受累情況的相關性 陰虛型原發性干燥綜合征患者Breg、IL-17 水平均與患者血液系統受累（IgG 水平）情況呈正相關（r=0.798，0.811，P<0.05），見表4、圖1。

表4 陰虛型原發性干燥綜合征患者Breg、IL-17水平與IgG的相關性

圖1 陰虛型原發性干燥綜合征患者Breg、IL-17水平與IgG的相關性

3 討論

陰虛型原發性干燥綜合征是一種慢性自身免疫性疾病，有著較高的發病率，其發病因素與遺傳、環境、多種細胞及相關因子等因素有關[6]。同時，這個疾病科可及腺體以外的多種臟器，其中以血液系統受累最為常見[7]。而血液系統受累已經不容忽視，嚴重時會掩蓋患者干燥綜合征的癥狀從而延誤陰虛型原發性干燥綜合征患者的診斷和治療[8]。血液系統損害和免疫有關，其發病機制和調節性B 淋巴細胞和白細胞介素-17 有關[9]。因此，探究陰虛型原發性干燥綜合征患者Breg、IL-17 水平與血液系統受累情況的相關性具有重要意義，為臨床診斷和治療提供合理的依據。

目前對于Breg 細胞與PSS 關系的研究僅有少量文獻報道。研究顯示，在多種自身免疫性疾病中Breg 表達水平表現出異常[10]。雖然Breg 在B 細胞中比例僅占0.2%～0.6%，但有著非常明顯的免疫調節作用[11]。多種免疫復合物、多克隆免疫球蛋白及自身抗體是由機體中的B 淋巴細胞介導的體液免疫產生的，損害患者的血液系統[12]。有研究發現，Breg 在干燥綜合征患者中具有減輕CD4+T 細胞所介導的炎癥反應的作用，同時Breg 可以通過分泌多種細胞因子，直接或者間接地作用于其他免疫細胞，進而發揮抑制炎癥反應的作用[13]。在本研究中，血液系統受累組患者Breg 水平顯著高于無血液系統受累組（P<0.05），這與文獻[14]研究結果一致，說明Breg 不僅與陰虛型原發性干燥綜合征的發病過程相關，還與患者血液系統受累的程度有關，所以進一步分析了陰虛型原發性干燥綜合征患者Breg 水平與血液系統受累情況的相關性，結果發現，陰虛型原發性干燥綜合征患者Breg 水平與血液系統受累情況呈正相關（r=0.798，P=0.005），說明患者Breg 水平越高，血液系統受累情況就越嚴重。

IL-17主要是由近期新發現的Th17細胞分泌的，目前作為新發現的細胞因子，可以促進白細胞的遷移和活化，導致炎癥反應加重[15-16]。一些研究表明，IL-17 因子與陰虛型原發性干燥綜合征疾病有著很大的關系[17-18]。結果顯示，血液系統受累組患者IL-17 水平顯著高于無血液系統受累組（P<0.05），這與國外研究結果一致[19-20]。這說明IL-17 不僅參與了陰虛型原發性干燥綜合征的發病過程，還與患者血液系統受累的程度有關，所以進一步分析了陰虛型原發性干燥綜合征患者IL-17 水平與血液系統受累情況的相關性，結果發現，陰虛型原發性干燥綜合征患者IL-17 水平與血液系統受累情況呈正相關（r=0.811，P=0.016），說明患者IL-17 水平越高，患者血液系統受累情況就越嚴重。

綜上所述，因陰虛型原發性干燥綜合征發生血液系統受累的患者病情比較嚴重，可以用Breg、IL-17 水平來判斷陰虛型原發性干燥綜合征患者血液系統受累的嚴重情況，為后續臨床治療提供合理的依據。