大豆GmPP2C89基因在鹽脅迫中的功能分析

張 斌

(湖南科技學院 化學與生物工程學院，湖南 永州 425199)

植物在生長過程中經常會受到一些不利的環境因素影響，如干旱、鹽、極端溫度等，這對農作物的產量和品質會產生巨大的威脅[1]。在植物遭受非生物脅迫時，其自身也會進行一系列的調控以響應和適應外界不利的環境[2]。因此，對植物進行耐逆性遺傳改良的基礎就是探究植物響應脅迫的分子機制。大豆是我國重要的糧油作物，為食品加工和動物飼料制造提供原料，但高鹽和干旱嚴重影響大豆的正常生長，導致減產，而關于大豆響應鹽脅迫的分子機制也有較多報道，如ABA信號途徑、SOS信號途徑、轉錄因子調控等[3]。

植物響應非生物脅迫的基因表達調控是一個非常復雜的過程，可以發生在轉錄、翻譯和翻譯后修飾等多個層面，其中轉錄調控最為重要[4]。在轉錄水平上，基因表達的調控主要通過啟動子區的順式作用元件控制[5]。啟動子是基因轉錄起始密碼子上游的DNA序列，包含與轉錄因子相互作用的順式作用元件，是轉錄因子啟動或抑制基因表達的重要元件[4]。順式作用元件作為重要的分子開關，在植物生長發育的各個階段和環境適應方面都發揮著重要的功能。植物啟動子元件在非生物脅迫應答方面的功能也已有較多的報道。擬南芥bZIP轉錄因子AREB1、AREB2和ABF3通過結合DREB2A啟動子中的ABRE元件，激活下游靶基因的表達，進而調控植物對滲透脅迫的響應[6]。Yao等[4]研究發現，楊樹ERF76基因啟動子區含有多種非生物脅迫響應元件，如MYB、MYC和GT-1元件；并且在轉基因擬南芥中ERF76啟動子能夠受鹽脅迫誘導增強GUS報告基因的表達。滿玲娟等[7]克隆了梭梭樹HaFT-3基因啟動子，通過轉基因擬南芥證明HaFT-3基因啟動子受高溫、低溫、ABA、IAA誘導。古袁揚等[8]研究發現，番茄SlNAC1基因啟動子上包含多種生物和非生物脅迫應答元件，并通過構建5′-缺失的SlNAC1啟動子驅動的GUS基因表達載體鑒定到鹽響應關鍵元件—GT1GMSCAM4元件。

已有研究指出，植物PP2C家族成員在植物鹽、干旱等脅迫響應中發揮重要調控作用[9]。擬南芥AtPP2CG1則以 ABA 依賴性方式對植物耐鹽性進行正調控[10]；小麥TaPP2C1過表達可增強轉基因煙草的耐鹽性[11]。Zhang等[12]研究表明，二穗短柄草BdPP2CA6在擬南芥中過表達導致其生長前期對ABA的超敏感，并通過ABA依賴途徑增強擬南芥耐鹽性。Singh 等[13]研究發現，水稻PP2C基因OsPP108受ABA、鹽和干旱脅迫誘導表達上調，過表達OsPP108的擬南芥在種子萌發、根系生長和幼苗生長過程中對ABA高度敏感；但是過表達OsPP108擬南芥植株對鹽、甘露醇和干旱脅迫具有更強的耐受性。前期筆者對大豆進行鹽處理后的轉錄組測序，在差異基因中篩選到一個上調倍數較高的基因GmPP2C89，但是該基因是如何響應鹽脅迫的，其在植物抵抗鹽害過程中的功能和機制仍需進一步探究。

本研究利用生物信息學技術分析了其啟動子區的順式作用元件，克隆不同長度的GmPP2C89啟動子片段融合GUS報告基因，在擬南芥中探究該啟動子的鹽、干旱和滲透脅迫誘導效應，同時對可能的關鍵元件進行分析；并利用轉基因擬南芥對基因的耐鹽功能進行深入解析，旨在為研究大豆和其他物種PP2C家族基因的功能提供參考，也為大豆耐逆性遺傳育種提供重要的候選基因。

1 材料和方法

1.1 植物材料培養

本研究使用的植物材料包括栽培大豆(Glycinemax)和擬南芥(Col-0，Arabidopsisthaliana)。將植物材料種子直接播種于營養土和蛭石混合(1∶1)基質中，用自來水澆灌，在植物生長室培養，條件：長日照(16 h晝/8 h夜)，溫度22～25 ℃，空氣濕度60%～70%。

1.2 RNA提取和熒光定量PCR分析

用20% PEG、300 mmol/L甘露醇溶液分別處理生長10 d的大豆幼苗，分別在0，6，12，24 h取葉片提取總RNA。利用反轉錄試劑盒SuperScript Ⅲ First-Strand Synthesis SuperMix(ThermoFisher scientific)合成cDNA，使用熒光定量PCR儀(CFX96，Bio-Rad，美國)進行熒光定量PCR檢測。利用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。大豆UBI3基因和擬南芥ACTIN基因作為內參，本研究所用引物如表1所示。

1.3 啟動子順式作用元件分析及GUS載體構建

根據大豆基因組數據庫(https：//soykb.org/)中啟動子參考序列設計引物，以大豆DNA為模板克隆啟動子片段，并對其進行測序。將啟動子序列提交到在線數據庫PlantCARE(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)進行順式作用元件預測，統計非生物脅迫相關的元件位置和數量。克隆截斷的啟動子序列，將全長和截斷的啟動子片段插入PBI101載體的GUS基因上游，構建GUS載體，引物如表1所示。

表1 本研究所用引物Tab.1 Primers used in this study

1.4 擬南芥遺傳轉化

將野生型擬南芥種子均勻播種于營養土和蛭石混合(1∶1)基質中，在植物生長室培養28～35 d，利用農桿菌介導的浸花法轉化擬南芥，收獲T0種子后，用卡那霉素或草銨膦篩選，并進行PCR鑒定，最終獲得轉基因擬南芥材料。

1.5 GUS染色

將擬南芥幼苗浸沒到GUS染色液(1.44 mL 1 mol/L Na2HPO4、1.06 mL 1 mol/L NaH2PO4、1 mL 100 mmol/L K4Fe(CN)6·3H2O、1 mL 100 mmol/L K3Fe(CN)6、500 μL 500 mmol/L EDTA、50 μL TritonX-100、20 mg X-Gluc，用去離子水定容至50 mL)，用真空泵抽真空約5 min，然后置于37 ℃，避光12 h。將GUS染液回收后，加入75%乙醇脫色(除去葉綠素)，然后拍照觀察GUS染色情況。

1.6 轉基因擬南芥耐鹽性分析

克隆GmPP2C89的CDS序列，構建過表達載體35S∷GmPP2C89，利用農桿菌介導的浸花法轉化野生型擬南芥。擬南芥種子經75%酒精消毒后于MS培養基和含有100 mmol/L NaCl的MS培養基上，在生長室垂直放置培養7 d，統計根長。培養室條件：溫度25 ℃，長日照(晝16 h/夜8 h)，50%～70%相對濕度。擬南芥材料在營養土中正常生長28 d后，用150 mmol/L NaCl水溶液處理10 d，利用Zang等[14]報道的方法測定MDA含量和電解質滲透率。此外，提取擬南芥葉片RNA，利用熒光定量PCR檢測抗氧化酶基因(SOD、POD和CAT)和ABA途徑關鍵基因(RD26、RD29A和RD29B)的表達水平。

2 結果與分析

2.1 GmPP2C89基因的非生物脅迫誘導表達模式

前期對正常生長和鹽處理的栽培大豆進行了轉錄組測序，數據已上傳NCBI數據庫(登錄號：PRJNA741583)。在轉錄組數據中篩選到一個上調倍數較高的基因GmPP2C89(NaCl處理組該基因的平均FPKM值較對照組約上調42倍)(圖1-A)。本研究又用20% PEG和300 mmol/L 甘露醇溶液處理栽培大豆幼苗，利用GmPP2C89基因的表達模式。結果顯示，PEG和甘露醇處理均導致GmPP2C89基因表達水平顯著上調，PEG處理后12 h表達水平上調倍數最高(25倍)(圖1-B)，甘露醇處理6 h表達水平上調倍數最高(28倍)(圖1-C)。

A.鹽處理的大豆轉錄組數據中GmPP2C89基因的FPKM值；B.20%PEG處理的大豆中GmPP2C89基因的表達水平； C.300 mmol/L甘露醇處理的大豆中GmPP2C89基因的表達水平。不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖5，6同。 A.FPKM value of GmPP2C89 gene in soybean transcriptome data treated with salt；B.Expression level of GmPP2C89 gene in soybean treated with 20% PEG； C.Expression level of GmPP2C89 gene in soybean treated with 300 mmol/L mannitol.；Different letters indicate significant differences(P<0.05).The same as Fig.5，6.

2.2 GmPP2C89基因啟動子區的順式作用元件預測

利用PlantCARE數據庫對GmPP2C89基因轉錄起始密碼子ATG上游的2 000 bp序列進行順式作用元件分析，結果發現，該啟動子區含有較多參與非生物脅迫響應的元件，包括ABRE、DRE、G-box、MBS、MYB、MYC和TC-rich repeats等元件。其中ABRE元件數量最多，共4個；MYC元件3個；G-box、MBS、MYB和TC-rich repeats元件各2個；DRE元件1個(圖2)。

圖2 GmPP2C89基因啟動子區非生物脅迫響應元件的分布Fig.2 Distribution of abiotic stress response cis-elements in the promoter of GmPP2C89 gene

2.3 不同長度的GmPP2C89基因啟動子克隆及GUS融合載體構建

在克隆出2 000 bp的啟動子片段基礎上，根據順式作用元件的功能和分布區域，將啟動子片段分成3個不同長度的缺失片段，即本研究共包含4個啟動子片段：啟動子全長片段(P1)、3個5′端缺失片段(P2、P3和P4)。相比全長啟動子，P2片段缺失了MYB、MYC和ABRE元件各1個；P3片段缺失了MYB、MYC和ABRE元件各2個，DRE和TC-rich repeats元件各1個；而P4片段缺失了全部的非生物脅迫響應元件，僅保留了核心啟動子區(圖3-A)。以大豆DNA為模板，使用高保真DNA聚合酶克隆得到長度分別為2 000，1 370，980，240 bp的啟動子片段(圖3-B)。利用同源重組技術將啟動子片段插入PBI101載體以構建重組載體，并進行酶切驗證，證明GUS融合載體構建成功(圖3-C)。

A.不同長度的啟動子及順式作用元件位置；B.啟動子片段克隆電泳；C.載體構建成功酶切電泳。 A.Promoters of different lengths and cis-element positions；B.Promoter fragment cloning electrophoresis diagram； C.Vector construction successful digestion electrophoresis diagram.

2.4 轉基因擬南芥的獲得及GUS染色分析

通過浸花法將GUS融合載體轉化野生型擬南芥。利用卡那霉素篩選初步獲得抗性植株，并進一步進行PCR鑒定獲得轉基因植株(圖4-A—D)，分別用P1∷GUS、P2∷GUS、P3∷GUS、P4∷GUS表示。GUS染色結果如圖4-E所示，正常培養的擬南芥P1∷GUS、P2∷GUS、P3∷GUS和P4∷GUS葉片都有

A～D.不同長度的啟動子融合GUS載體轉化的擬南芥篩選和PCR鑒定；E.150 mmol/L NaCl、20%PEG和300 mmol/L甘露醇處理后的GUS染色。

較淺的藍色，說明截斷的啟動子序列也能在正常條件下啟動基因的表達。在NaCl處理后，P1∷GUS和P2∷GUS植株葉片的GUS染色明顯變深，P3∷GUS葉片次之，P4∷GUS葉片GUS表達則未被鹽處理誘導。PEG模擬干旱處理也導致P1∷GUS和P2∷GUS葉片的GUS染色變深，P3∷GUS和P4∷GUS葉片中GUS都未被誘導。甘露醇處理則表現出與鹽處理類似的現象，但是GUS染色相對較淺。說明GmPP2C89基因啟動子區的非生物脅迫響應元件在鹽、干旱和滲透脅迫中發揮特定功能。

2.5 GmPP2C89基因過表達增強轉基因擬南芥耐鹽性

本研究獲得了GmPP2C89基因過表達的轉基因擬南芥GmPP2C89-OX。根長試驗表明，在正常MS培養基上，WT和GmPP2C89-OX擬南芥根長無顯著差異，而在含100 mmol/L NaCl的MS上GmPP2C89-OXX根長顯著高于WT(圖5-A、B)。對生長28 d的擬南芥植株進行鹽處理，結果顯示，WT和GmPP2C89-OX的生長都受到抑制，但GmPP2C89-OX的長勢明顯優于WT(圖5-C)。測定正常和鹽處理條件下擬南芥葉片中的MDA含量(以鮮質量計)和電解質滲透率，發現鹽處理條件下擬南芥GmPP2C89-OX葉片MDA含量(以鮮質量計)和電解質滲透率顯著低于WT(圖4-D、E)，說明擬南芥GmPP2C89-OX在鹽脅迫條件下受傷害較輕、其耐鹽性增強。

2.6 GmPP2C89過表達植株中脅迫相關基因表達發生改變

為了探究GmPP2C89介導的信號途徑，利用熒光定量PCR技術檢測了參與脅迫響應的抗氧化酶基因(SOD、POD和CAT)和ABA途徑關鍵基因(RD26、RD29A和RD29B)的表達水平，結果顯示，鹽處理后這些基因在WT和GmPP2C89-OX中都顯著上調；其中SOD、POD和RD29B在GmPP2C89-OX中的表達水平顯著高于WT；而CAT、RD26和RD29A在WT和GmPP2C89-OX間無顯著差異(圖6)。這些結果初步證實，GmPP2C89通過調控脅迫相關基因的表達，增強擬南芥對鹽脅迫的適應能力。

A～B.MS培養基和含100 mmol/L NaCl的MS培養基上的根長表型和統計；C～E.28 d的擬南芥經150 mmol/L NaCl處理10 d的表型和MDA含量、電解質滲透率。 A—B.Root length phenotype and statistics on MS medium and MS medium with 100 mmol/L NaCl；C—E.Phenotype and MDA content， electrolytic leakage of Arabidopsis thaliana treated with 150 mmol/L NaCl for 10 d.

圖6 擬南芥植株WT和GmPP2C89-OX中脅迫相關基因的表達模式Fig.6 Expression pattern of stress-related genes in WT and GmPP2C89-OX seedlings

3 討論

轉錄調控是植物應對不利環境因素的重要機制，通常由轉錄因子控制脅迫相關基因的表達來緩解逆境對植物造成的傷害，而在這一過程中，基因啟動子上的順式作用元件(即轉錄因子的結合位點)發揮主要作用[15]。徐金龍等[16]指出，非生物脅迫相關基因(RD29A、RD29B、RD22、ERD1等)啟動子區的E-box(G-box)、ABRE、DRE、MYB、MYC、GT-1、W-box等元件可以與特定的轉錄因子結合參與脅迫反應，此外，MBS、TC-rich repeats等元件也參與植物非生物脅迫應答。PlantCARE是植物順式作用調控元件數據庫[17]，該工具被廣泛地應用在植物啟動子區順式作用元件的預測研究中[4，7，18]。本研究利用PlantCARE數據庫分析了GmPP2C89基因啟動子上的順式作用元件，發現包含ABRE、DRE、G-box、MBS、MYB、MYC和TC-rich repeats等元件，說明GmPP2C89基因表達水平受鹽、干旱和滲透脅迫誘導上調很可能是由某個或多個特定轉錄因子調控。

陳雨倩等[18]根據順式作用元件的位置分別克隆了不同長度的麻瘋樹JcGAST1基因啟動子片段，通過煙草葉片瞬時表達和GUS染色確定了啟動子的核心區域。本研究根據GmPP2C89啟動子上非生物脅迫相關順式作用元件的分布區域，克隆了啟動子全長片段和3個不同長度的5′缺失片段，構建了啟動子融合GUS的報告載體。可穩定遺傳的轉基因擬南芥可能是進行啟動子響應非生物脅迫特性研究更好的材料，任麗等[19]克隆了白樺BpTCP7基因啟動子，并利用啟動子融合GUS載體轉化擬南芥，分析了該基因的時空表達特異性，并證明NaCl、PEG 脅迫誘導處理后BpTCP7基因表達量上調(以擬南芥GUS染色深淺代表)。因此，將啟動子融合GUS載體轉化野生型擬南芥，獲得純合后代進行GUS染色分析。GUS染色顯示，全長啟動子能夠被這3種脅迫誘導驅動GUS報告基因的表達；而不包含任何非生物應答元件的P4片段則不受誘導，但是其包含核心啟動子元件，能夠啟動基因的正常水平表達。P3啟動子在PEG處理后未驅動GUS基因的高表達，說明其缺失了干旱/脫水響應元件，P3相對于P2缺失了ABRE、MYB、MYC、DRE和TC-rich repeats，其中DRE被普遍認為是一個干旱/低溫/高溫/鹽應答元件[8]，推測DRE元件在GmPP2C89應答干旱脅迫中起關鍵作用。

本研究利用轉基因擬南芥對GmPP2C89基因的功能做了進一步探究，發現過表達GmPP2C89的擬南芥的耐鹽性顯著增強。丙二醛(MDA)作為膜脂過氧化的產物，其含量反映了植物細胞因非生物脅迫(包括鹽脅迫)而受損的程度[20]，發現鹽脅迫下GmPP2C89-OX植株中的MDA含量顯著低于WT，證明GmPP2C89-OX植株受鹽害較輕。抗氧化酶的活性增強有助于植物減少氧化損傷[21]，因此，檢測了抗氧化酶編碼基因SOD、POD和CAT的表達水平，發現鹽脅迫下GmPP2C89-OX植株中SOD和POD的表達量顯著高于WT，說明GmPP2C89在此過程中直接或間接激活了抗氧化系統，進而調節植株對鹽脅迫的適應能力。前期報道明確指出，PP2C基因可通過ABA依賴途徑參與植物鹽脅迫調節網絡[12-13]。ABA途徑中的關鍵基因RD26、RD29A和RD29B被多種非生物脅迫和ABA處理誘導上調，被認為是脅迫響應的標記基因[22]。檢測RD26、RD29A和RD29B基因的表達水平，結果發現鹽脅迫下GmPP2C89-OX植株中RD29B的表達水平顯著高于WT，說明GmPP2C89可能通過ABA依賴途徑正調控植株耐鹽性。