錦鯉維氏氣單胞菌的分離鑒定

王燦良，任顯鋒，陳傳剛，韋良震，王飛翔，王雪鵬

(1.山東農業大學動物科技學院，山東 泰安 271018；2.泰安市水產研究所，山東 泰安 271411；3.曲阜漁豐現代農業發展有限公司，山東 曲阜 273100；4.濟寧南陽湖農業發展有限公司，山東 濟寧 272100)

錦鯉(Cyprinus carpio)在動物分類系統上屬于鯉科(Cyprinidae)，在我國屬于知名度較高的觀賞魚種類，有“水中活寶石”“會游泳的藝術品”等美譽，具有較高的經濟價值(許品章，2004)。近年來，隨著人們對觀賞魚需求量逐漸增大，錦鯉養殖集約化程度越來越高，隨之而來的錦鯉病害給錦鯉產業的發展造成了阻礙(宋東鎣等，2015)。

為探明造成2021年山東省濟寧市某錦鯉養殖場錦鯉暴發性死亡的致病菌，本研究對采集的錦鯉發病樣本進行了細菌分離、質譜分析和分子鑒定、回歸感染、藥物敏感性等，為錦鯉養殖中病害防控提供了科學依據。

一、材料與方法

1.材料

發病錦鯉和用于回歸感染試驗的健康錦鯉均來自濟寧某錦鯉養殖場。發病錦鯉體表有鱗片脫落、出血斑等病變現象，鰓部顏色淡紅。

2.菌株分離、純化與病理切片制備

無菌操作法在病魚肝胰臟、脾、腎臟取菌，劃線于LB瓊脂培養基上，30℃溫箱培養24小時，再次劃線LB瓊脂培養基兩次得到純培養菌株，保存備用。取瀕死發病魚內臟團，按常規方法制作石蠟切片：4%甲醛溶液4℃固定3天，經過各級乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，每尾魚各制備10張，蘇木素－伊紅染色，貼片，固封(王雪鵬等，2011)。用顯微鏡觀察，并完成圖像捕獲和處理。

3.分子鑒定

利用本實驗室保存的細菌16S r DNA通用引物(上游引物序列為5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′；下游引物序列為5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行PCR擴增。PCR反應條件為95℃5分鐘；95℃30秒、52℃40秒、72℃1分鐘，30個循環；72℃5分鐘。所得產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

4.質譜分析

取上述分離、純化的優勢菌標記好，涂布于色譜柱上，而后滴加2微升甲酸、2微升基質溶液，在超凈臺內自然風干后，掃描色譜柱條碼錄入信息后打開軟件進行質譜測定(Sascha S等，2017)。

5.菌液濃度測定

為方便計算菌液細菌含量以及確定回歸實驗接種細菌數量，計算半數致死量等。取吸光度OD(600納米)值為2.0時的菌液，10倍比吸收稀釋，設計了兩組平行平板組A1、A2、A3、B1、B2、B3，分別取稀釋了107、108、109倍的菌，100微升涂平板A1、A2、A3、B1、B2、B3；經20小時、30℃恒溫培養后，取出計算單菌落，平板涂菌計數，確定吸光度與細菌數的關系。

6.藥敏試驗

利用紙片擴散法進行本次藥敏試驗。將上述稀釋OD(600納米)值為2.0的菌液100微升涂布于LB瓊脂培養基上，貼上藥敏紙片，共14種藥物，30℃倒置培養20小時后測量抑菌圈直徑。

7.致病性與回歸感染試驗

為探究該分離菌的致病性，筆者準備了一批體質健康、體重在50～200克的錦鯉，事先在控溫水循環水箱中靜養5天，靜養期間保持溫度28℃左右且不喂飼料。5天后，挑選30尾體重在(100±10)克的錦鯉進行本次試驗，試驗設5個試驗組與1個對照組，每組各5尾。采用上述原液(標記為W0)、稀釋10倍(標記為W1)、100倍(標記為W2)、1000倍(標記為W3)、10000倍(標記為W4)和PBS溶液(陰性對照，標記為W5)進行腹腔注射感染。每尾健康錦鯉注射0.1毫升。水溫為28℃左右，正常飼養。每天觀察、記錄魚的發病癥狀、死亡數量等，連續觀察1周。對上述人工回歸感染出現明顯癥狀的病魚再次進行菌株分離后進行質譜分析和分子鑒定，并取瀕死錦鯉肝臟、脾臟、腎臟做病理觀察。

二、結果

1.細菌分離、純化

發病魚肝胰臟、脾臟、腎臟充血發紅、出血(圖1)。從內臟各器官所分菌株菌落特征較為一致，得到一株菌落呈乳白色、圓點狀、邊緣平滑的優勢菌(圖2)，該菌革蘭氏染色為陰性(圖3)。病理組織學檢查以肝臟水腫變性，肝細胞萎縮、壞死，脾臟和腎臟充血、水腫等病變為主(圖4～圖6)。

圖1 病死魚剖檢

圖2 菌株分離純化

圖3 純化菌株革蘭氏染色

圖4 剖檢魚肝臟切片

圖5 剖檢魚脾臟切片

圖6 剖檢魚腎臟切片

2.細菌鑒定

所擴增的PCR產物長度約為1500bp(圖7)，對瓊脂糖電泳為1500bp的條帶進行測序，得到16SrDNA序列。該序列經BLAST對比，結果與維氏氣單胞菌序列相似性達99.93%以上，與其他維氏氣單胞菌的距離比例(系統發育樹)見圖8。質譜分析結果進一步證實，該菌為維氏氣單胞菌，命名為Aeromonasveronii-1。

圖7 PCR產物電泳結果

圖8 分離菌株系統發育樹

3.藥敏試驗

藥敏試驗結果顯示，四環素類、頭孢類、β-內酰胺類抗生素在本次藥敏試驗中展現了極好的抗菌效果，磺胺類、氨基糖苷類抗革蘭氏陰性菌抗生素亦有較好的療效，而抗革蘭氏陽性菌的青霉素類則基本沒效果，詳見表1。

表1 分離菌株藥敏試驗結果

4.OD值為2.0時菌液濃度測定、LD50測定及回歸感染

當OD(600納米)值為2.0時，測定該分離株維氏氣單胞菌的濃度為1.159×1011CFU/毫升。人工感染健康錦鯉后，不同接種濃度呈現不同的死亡情況，W0、W1、W2、W3、W4、W5組死亡數分別為4、5、3、2、1、0尾。根據Reed-Muench法計算，該菌株的LD50測定為5.383×107CFU/尾。人工回歸感染病死魚只在內臟中再次分離鑒定出了維氏氣單胞菌。

三、討論

近年來，細菌、病毒類疾病給錦鯉養殖業帶來較大沖擊，其中嗜水氣單胞菌、黃桿菌、錦鯉皰疹病毒、車輪蟲、小瓜蟲等較為常見。目前，細菌鑒定的最經典方法是生化鑒定，但存在工作量大、耗時長、敏感度低等缺點。隨著分子生物學和分子遺傳學的飛速發展，16SrRNA基因檢測技術因其快速簡便、特異性較高等優點，被廣泛用于細菌的種屬鑒定，但也存在對親緣關系較近的細菌鑒別率不高等缺點。近年來，隨著質譜檢測技術(MALDI-TOFMS)的不斷完善和發展，該技術已經成功應用于微生物的鑒定。MALDI-TOFMS大大縮短了細菌鑒定的時間，而且成本也較常規鑒定方法低，被廣泛應用。本研究結合分子遺傳學和質譜技術，兩者相互輔證、互為補充，使鑒定結果更為準確可靠。

本試驗結果與楊求華等(2012)、高金偉等(2016)的結果不一致。但是，本試驗所用的國標藥物氟苯尼考和恩諾沙星具有良好的抗菌效果，可在實際生產中應用。