槲皮素調控巨噬細胞膽固醇穩態改善載脂蛋白E敲除小鼠動脈粥樣硬化

羅 綱，向 露，姚 平，肖 琳

(中南大學湘雅公共衛生學院1.衛生毒理學系、2.營養與食品衛生學系，湖南 長沙 410078；3. 華中科技大學同濟醫學院公共衛生學院營養與食品衛生學系，湖北 武漢 430030)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)作為全球“頭號殺手”—心血管疾病的關鍵病理學基礎及急性發作致死、致殘的幕后元兇，長期以來嚴重威脅人類健康。因此，針對AS主要病理生理學特點和關鍵生物學事件，探索新的干預措施，有望為AS的防控提出新的方向。

AS是一種慢性退行性病變，其病變范圍廣，累及各大、中動脈，典型表現為內膜下脂質蓄積、內皮受損、炎性細胞大量浸潤、粥樣斑塊形成及由管腔狹窄，最終引發的靶器官缺血性改變[1]。其中，由巨噬細胞膽固醇代謝穩態失調引發的細胞泡沫化作為斑塊形成的核心機制，在AS進程中扮演著重要角色。泡沫細胞的形成來源于不平衡的巨噬細胞膽固醇攝取與外排，表現為CD36、SRA-1、LOX1等多種清道夫受體表達上調后對氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein ，ox-LDL)的吞噬內化增加，以及由ATP結合盒亞族A1/G1(ATP-binding cassette subfamily A1/G1，ABCA1/G1)膽固醇轉運蛋白介導的膽固醇外排減少[2]。泡沫細胞在受損內皮下空間的形成和積聚是AS斑塊形成的標志性事件。因此，進一步闡明巨噬細胞膽固醇穩態調控機制對抑制細胞泡沫化并改善AS至關重要。

槲皮素(quercetin，Qu)作為一種廣泛存在的黃酮類物質，膳食來源多種多樣，在洋蔥、蘆筍、青椒等蔬菜及蘋果、柑橘、甜瓜等水果中的含量尤為豐富[3]。流行病學研究表明，人群增加槲皮素等膳食黃酮類的日常攝取，可明顯減少心血管疾病的發病幾率[4]。大量體內、外實驗研究表明，槲皮素對AS發生發展的多個關鍵環節均表現出良好的保護效應，如降低斑塊氧化應激水平、拮抗炎癥和恢復血管內皮功能等[5-6]。更重要的是，研究表明槲皮素可特異性靶向富集于AS斑塊巨噬細胞，為其在斑塊微環境中發揮多種生物活性功能奠定了重要的物質基礎[7]。然而，槲皮素對AS保護作用的潛在機制至今尚未完全明確。因此，本研究使用高脂膳食喂養載脂蛋白E敲除(apolipoprotein E knockout，ApoE KO)小鼠建立AS模型，采用ox-LDL孵育RAW264.7巨噬細胞建立體外泡沫細胞模型并使用槲皮素干預，聚焦于巨噬細胞膽固醇穩態調控，探討槲皮素改善AS的潛在分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細胞SPF級成年♀ ApoE KO小鼠購于北京維通利華實驗動物技術有限公司(SCXK【京】2019-0011)。飼料由北京科澳協力飼料有限公司提供。RAW264.7細胞系購于中國科學院細胞庫(貨號：TCM13)。

1.2 試劑血清甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)檢測試劑盒(中生北控生物科技)；細胞總、游離膽固醇檢測試劑盒(普利萊生物科技)；油紅O(Sigma-Aldrich)；ox-LDL、Dil標記的ox-LDL(Dil-labeled-ox-LDL)(奕源生物科技)；25-NBD-cholesterol (Avanti Polar Lipids)；槲皮素(Sigma)；環孢菌素A(Cyclosporin A，Cyc A，CYP27A1抑制劑)(MedChem Express)；細胞色素P450 27羥化酶(cytochrome P450 27-hydroxylase，CYP27A1)抗體(14739-1，proteintech)；清道夫受體B(scavenger receptor B，CD36)抗體(18836-1，proteintech)；肝X受體α(liver receptor Xα，LXRα)(ab176323，Abcam)；ABCA1抗體(NB400-105，Novus Biologicals)；ABCG1抗體(ab52617，Abcam)；GAPDH抗體(2118，CST)；HRP標記抗兔IgG抗體(7074，CST)。

1.3 儀器ELX800型酶標儀(美國BIOTEK)；熒光倒置顯微鏡(日本OLYMPUS)；7900HT熒光定量PCR儀(美國ABI)；凝膠成像系統(英國SYNGENE)。

1.4 動物模型[6]將45只成年♀ApoE KO小鼠適應性喂養1周后，隨機分為3組，即普通飼料組(normal diet，ND)、高脂飼料組(high fat diet，HFD，21%脂肪和0.15%膽固醇)、高脂飼料+槲皮素組(HFD+Qu，100 mg·kg-1體質量)。根據體質量確定HFD+Qu組小鼠每日槲皮素灌胃量，每周記錄小鼠進食量與體質量。持續喂養16周后，2%戊巴比妥鈉進行麻醉，經眼眶內眥動脈叢取血，并迅速分離其主動脈，采用4%多聚甲醛固定或-80 ℃冰箱凍存。

1.5細胞培養[6，8]將RAW264.7巨噬細胞接種于DMEM培養基(含10%FBS)，置于37 ℃、5% CO2條件下培養。待細胞融合度近70%時采取如下處理，對照組(Con，DMEM培養基培養)、ox-LDL干預組(50 mg·L-1ox-LDL孵育)、ox-LDL+Qu干預組(50 mg·L-1ox-LDL和100 μmol·L-1槲皮素共同孵育)、Qu干預組(100 μml·L-1槲皮素孵育)、ox-LDL+Qu+Cyc A干預組(50 mg·L-1ox-LDL、100 μmol·L-1槲皮素和20 μmol·L-1Cyc A共同孵育)、Cyc A干預組(20 μmol·L-1Cyc A孵育)。

1.6 主動脈弓橫截面油紅O及HE染色取長約2 mm的各組小鼠主動脈弓組織，經固定、脫水、透明、浸蠟后進行OCT包埋并切片，每只小鼠收集10～15張切片，行油紅O及HE染色。在顯微鏡下隨機挑選視野，采集圖像。

1.7 生化指標測定采用相應試劑盒，根據操作說明檢測各組小鼠血清TC、TG、LDL-C及HDL-C水平。

1.8 PCR采用TRIzol法提取各組小鼠主動脈組織總RNA，嚴格按照說明書逆轉錄為cDNA，隨后采用SYBR-Green擴增cDNA并獲得Ct值。引物序列見Tab 1。β-actin為內參基因，利用2-△△Ct法得到各基因表達水平。

1.9 細胞油紅O染色分別使用4%多聚甲醛和60%異丙醇對經過干預處理的各組細胞進行固定和浸洗，隨后加入適量油紅工作液，37 ℃孵育1 h后，在光學顯微鏡下觀察染色情況并采集圖像。

1.10 細胞Dil-ox-LDL攝取實驗用含Dil-ox-LDL(5 mg·L-1)的無酚紅培養基培養已干預處理后各組細胞2 h后，利用熒光顯微鏡采集目標圖像。

1.11 細胞總膽固醇及游離膽固醇水平測定根據試劑盒說明書所述操作方法與步驟測定經干預處理的各組細胞的總膽固醇及游離膽固醇(free cholesterol，FC)水平。

1.12 膽固醇外流試驗含熒光標記膽固醇NBD-cholesterol(5 μmol·L-1)的無酚紅培養基孵育細胞4 h后，棄去上清并清洗，隨后分別添加含apoA-I(50 mg·L-1)或HDL(50 mg·L-1)培養基繼續培養4 h。依次收集培養上清，并0.1%Triton溶液充分裂解細胞。檢測上清培養液及細胞裂解液熒光強度數值。計算公式：膽固醇外流率/%=上清熒光值/(上清熒光值+細胞裂解液熒光值)×100%。

1.13 蛋白免疫印跡(Western blot)收集待測細胞，RIPA裂解液于冰上充分裂解并提取細胞總蛋白。采用BCA法測定樣品蛋白濃度后，進行蛋白變性。上樣后電泳完成蛋白分離，將蛋白濕轉于PVDF膜上，并用5%脫脂牛奶于室溫下封閉2 h。隨后相繼進行一抗、二抗孵育及洗膜后，加入顯影試劑并使用凝膠成像儀采集條帶圖像，利用Quantity one軟件檢測蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 槲皮素減少ApoE KO小鼠AS斑塊面積如Fig 1所示，ND組的主動脈內膜呈增生狀，并存在泡沫細胞聚集及炎性細胞浸潤；與之相較，HFD組的主動脈結構明顯異常，管腔狹窄，內膜增厚并附著斑塊，其內泡沫細胞和無結構壞死物大量存在。與HFD組相比，槲皮素干預組AS斑塊損傷明顯改善，以內膜增厚伴泡沫細胞浸潤為主要表現，無明顯斑塊附著。

Fig 1 Quercetin ameliorated atherosclerotic lesion formation in ApoE KO mice

2.2 槲皮素降低ApoE KO小鼠血脂水平如Tab 2所示，相比于ND組，血TG、TC及LDL-C水平在HFD組均明顯增高(P<0.01)，HDL-C水平則明顯下降(P<0.05)。相反，相比于HFD組，槲皮素干預組的TG、TC和LDL-C水平明顯降低，分別降低了約34%、26%和45%(P<0.05)，HDL-C水平則增高了約30%(P<0.05)。血脂水平變化與前述各組小鼠AS斑塊形成情況相一致。

2.3 槲皮素改善ox-LDL誘導的巨噬細胞脂質蓄積細胞油紅O染色結果顯示，與對照組相比，經ox-LDL處理的巨噬細胞內紅染脂滴數量(Fig 2A)及Dil-ox-LDL的熒光強度(Fig 2B)明顯增加，由HDL與載脂蛋白A-I(apolipoprotein A-I，apoA-I)介導的膽固醇流出率較對照組分別增加了近30%和48%(Fig 2C)，此外，細胞內TC和FC水平明顯升高(Fig 2D)。經槲皮素干預后，巨噬細胞內脂質蓄積較ox-LDL組明顯減少，Dil-ox-LDL熒光強度明顯降低，膽固醇流出率進一步上升。

Fig 2 Quercetin reduced ox-LDL-induced lipid accumulation in RAW264.7 macrophages

2.4 槲皮素對膽固醇穩態調節相關蛋白表達的影響如Tab 3所示，與ND組相比，HFD組小鼠主動脈LXRα、CD36、ABCA1及ABCG1的mRNA表達水平均明顯上升(P<0.05)。HFD組小鼠主動脈CYP27A1的mRNA表達水平雖高于ND組，但無統計學差異。相比于HFD組，在槲皮素干預后，小鼠主動脈組織中CYP27A1、LXRα及ABCA1的mRNA表達水平明顯上調(P<0.05)；而CD36的mRNA表達水平呈明顯性下降(P<0.01)。如Fig 3所示，RAW264.7巨噬細胞經ox-LDL誘導后，CD36及ABCG1蛋白水平明顯升高(P<0.05)；CYP27A1、LXRα及ABCA1蛋白水平雖高于對照組，但差異無統計學意義。而槲皮素干預不僅使靜息狀態下的CYP27A1、LXRα及ABCA1/G1蛋白水平明顯升高，同時進一步明顯上調由ox-LDL誘導的CYP27A1、LXRα和ABCA1/G1蛋白表達(P<0.05)。相反，槲皮素對靜息狀態及ox-LDL誘導的CD36蛋白表達均存在明顯的抑制作用(P<0.05)。

Fig 3 Effects of quercetin on cholesterol homeostasis-related protein expressions in RAW264.7 macrophages

2.5 槲皮素通過CYP27A1/LXRα信號通路調控膽固醇穩態如Fig 4所示，由ox-LDL干預的巨噬細胞，預孵CYP27A1抑制劑Cyc A可明顯下調由槲皮素誘導的CYP27A1、LXRα及ABCA1/G1蛋白表達；并有效拮抗槲皮素對CD36蛋白表達的抑制作用(P<0.05)，細胞內TC和FC水平均明顯升高(P<0.05)。此外，Cyc A干預可明顯降低靜息狀態下的CYP27A1和LXRα蛋白表達，并誘導CD36蛋白表達(P<0.05)，細胞內TC水平較對照組明顯升高(P<0.05)。

Fig 4 Cyc A antagonized protective effects of quercetin on ox-LDL-induced macrophage cholesterol disequilibrium

3 討論

巨噬細胞作為構成AS斑塊最主要的細胞成分之一，在AS進程的各個環節均發揮重要作用。研究表明槲皮素可特異性靶向富集于AS斑塊巨噬細胞，為其在斑塊微環境中發揮多種生物活性功能奠定了重要的物質基礎[7]。本研究表明，槲皮素干預可顯著改善HFD喂養的ApoE KO小鼠AS主動脈斑塊損傷。由ox-LDL誘發的巨噬細胞泡沫化是AS斑塊形成的核心事件，本研究以50 mg·L-1ox-LDL孵育RAW264.7巨噬細胞24 h建立泡沫細胞模型，經槲皮素干預后，巨噬細胞TC、FC水平明顯降低，泡沫化程度有效減輕。

巨噬細胞泡沫化源于膽固醇攝取與外排過程的顯著不平衡，主要表現為清道夫受體增加對ox-LDL的攝取，而膜膽固醇轉運體減少對膽固醇的外排。CD36是巨噬細胞內極為重要的清道夫受體[9]；而ABCA1/G1作為介導巨噬細胞膽固醇外流的主要轉運體，其在荷脂巨噬細胞膽固醇外流過程中發揮不可替代的作用[10]。已有研究報道，LXRα可在轉錄水平上調控ABCA1/G1的蛋白表達[11]。本研究表明，槲皮素可明顯拮抗由ox-LDL干預RAW264.7細胞上調的CD36蛋白，減少巨噬細胞對ox-LDL的攝取，這一結果與Choi等[12]的報道相一致。與此同時，槲皮素干預可有效拮抗由ox-LDL誘導激活的巨噬細胞LXRα-ABCA1/G1信號通路，明顯增加巨噬細胞膽固醇流出率，這一現象與Jia等[13]報道相一致。然而槲皮素對CD36及LXRα-ABCA1/G1信號通路的潛在調控機制尚待進一步闡明。

CYP27A1是一種功能多樣的細胞色素P450羥化酶，主要存在于細胞線粒體，可羥基化膽固醇的第27位碳基位點生成27-羥基膽固醇(27HC)。27HC作為LXRα的高親和度內源性配體，在膽固醇代謝穩態調控中扮演了重要角色[14]。研究表明，CYP27A1可通過介導27HC生成，激活LXRα-ABCA1/G1信號通路以促進膽固醇外流[15]；此外，巨噬細胞在27HC干預后，其清道夫受體CD36蛋白水平卻明顯下調[16]。由此表明，CYP27A1對巨噬細胞膽固醇攝取和外流過程具有雙向調控作用，是維持細胞膽固醇穩態并由此改善AS的關鍵蛋白。本研究表明，槲皮素干預明顯上調CYP27A1蛋白水平，誘導下游LXRα-ABCA1/G1蛋白表達，并抑制CD36蛋白表達，有效降低巨噬細胞內膽固醇水平；而使用CYP27A1特異性抑制劑Cyc A可有效拮抗槲皮素的上述保護作用，表明由CYP27A1調控的CD36與LXRα-ABCA1/G1信號通路在槲皮素調控巨噬細胞膽固醇穩態過程中發揮重要作用。

綜上所述，槲皮素可通過上調CYP27A1蛋白表達，抑制由CD36介導的膽固醇攝取，并增加由LXRα-ABCA1/G1信號通路介導的膽固醇輸出，有效降低巨噬細胞泡沫化水平而發揮AS保護作用。槲皮素調控CYP27A1表達的潛在分子機制有待進一步深入研究。