造血祖細胞激酶1蛋白激酶在腫瘤中的研究進展

苗 雷，左 銳，季曉君，周秋華，馬昌友，吳 艦，徐 丹

(南京正大天晴制藥有限公司，江蘇 南京 210046)

造血祖細胞激酶1(hematopoietic progenitor kinase 1, HPK1)又稱MAP4K1，是一種造血特異性蛋白絲氨酸-蘇氨酸激酶，是哺乳動物Ste20相關(guān)蛋白激酶MAP4K家族的成員。HPK1由1個N端激酶結(jié)構(gòu)域和4個富含脯氨酸的基序組成，這些基序能夠與含SH3結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)結(jié)合；在C末端也有1個Cirton同源結(jié)構(gòu)域，可能作為調(diào)節(jié)域且可能參與大分子相互作用[1-2]；中央結(jié)構(gòu)域還包含1個caspase-3切割位點。HPK1是一種免疫調(diào)節(jié)抑制激酶，主要在淋巴器官/組織中表達，包括骨髓、淋巴結(jié)、胸腺、脾臟、胎盤、胎肝；在造血室中，HPK1在所有類型的細胞中表達，如造血祖細胞、T細胞、B細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞和肥大細胞[3-4]。作為免疫因子，HPK1在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，能夠?qū)APK家族中的MAP3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至MAP2K，引起c-Jun N末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)的活化，JNK激酶與Th1/Th2分化、細胞增殖與凋亡等多種T細胞反應(yīng)相關(guān)[5]。自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病關(guān)節(jié)炎，患者外周血單核細胞和T細胞中的HPK1表達水平下調(diào)[6-7]，表明HPK1可能通過調(diào)控T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用。本文將主要描述HPK1在多種腫瘤中的研究進展，如乳腺癌[8-9]、肺癌[10]、胰腺癌[11]、膀胱癌[12]、結(jié)腸癌[13]等。

1 HPK1信號通路

HPK1是T細胞受體(T cell receptor, TCR)的負調(diào)控因子[14]。當TCR激活后，HPK1被Gads和Grb2等銜接蛋白募集到TCR復(fù)合物，Lck/Zap70在Tyr381位點磷酸化HPK1，為SLP76(一個分子量76 ku，含有SH2結(jié)構(gòu)域的白細胞磷蛋白)創(chuàng)造一個對接點[15]。HPK1的完全激活需要Ser171和Thr165位點的磷酸化，Ser171可通過PKD1的途徑被磷酸化，而Thr165似乎是一個自磷酸化位點。完全激活的HPK1導(dǎo)致SLP76在Ser376殘基位點被磷酸化，14-3-3蛋白(與磷酸絲氨酸/蘇氨酸結(jié)合的第一信號分子)的募集[16]和TCR復(fù)合物的降解，從而抑制TCR信號傳導(dǎo)。HPK1介導(dǎo)的T細胞信號的負調(diào)控也可通過前列腺素E2受體以PKA依賴的方式交替觸發(fā)。

HPK1可與許多接頭蛋白結(jié)合，如SLP76家族，Gads、HIP-55、GRB2家族，LAT、CRK家族等，活化造血干細胞的SAPK/JNK信號途徑，從而對TCR通路進行負向調(diào)節(jié)。HPK1能負調(diào)控樹突狀細胞的活化和T細胞與B細胞反饋[6,17]；與TCR負反饋調(diào)控類似的機制，B細胞受體(B cell receptor, BCR)也將HPK1作為負反饋機制控制B細胞激活。在腫瘤中，TCR由于HPK1的激活而被抑制，從而造成了免疫逃逸，因此，抑制HPK1可增強T細胞活性，從而提高抗腫瘤免疫。

近期有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，HPK1通過NF-κB-Blimp1信號軸來調(diào)控T細胞的功能[18]。RNA-Seq分析發(fā)現(xiàn)，在HPK1敲除的T細胞中，PRDM1(Blimp1基因編碼的蛋白)和GATA3表達顯著降低，TBX21表達增加。在B16-F10小鼠移植瘤模型中，PRDM1在HPK1敲除的T細胞中表達顯著降低，而GATA3的表達水平則與野生型T細胞無明顯差別。因此，HPK1是一種關(guān)鍵的TCR近端激酶，在T細胞活化時通過促進Blimp1的表達來調(diào)節(jié)腫瘤浸潤性T細胞的功能障礙(例如T細胞衰竭，Th1細胞無力，激活誘導(dǎo)T細胞死亡等)，而HPK1基因敲除能促進小鼠T細胞的抗腫瘤反應(yīng)，從而抑制腫瘤生長。

2 HPK1與腫瘤

HPK1會影響Fas介導(dǎo)的細胞凋亡，caspase-3介導(dǎo)HPK1在Asp385位點被切割，將HPK1從NF-κB的激活因子轉(zhuǎn)變?yōu)镹F-κB的抑制劑，從而有利于細胞的凋亡[1]。在不同癌癥患者中，HPK1與多種T細胞衰竭信號(CD3E、TIGIT、PDCD1、CTLA4、HAVCR2及LAG3)呈正相關(guān)。同時，HPK1的表達水平與多種腫瘤患者的生存時間呈負相關(guān)，如腦低級別膠質(zhì)瘤、腎透明細胞癌、胰腺癌以及浸潤性乳腺癌等，HPK1低表達的患者具有更長的生存期[18]。此外，研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)HPK1的轉(zhuǎn)錄可抑制人結(jié)腸癌細胞中的腫瘤進展[13]。

HPK1的過表達和敲除研究發(fā)現(xiàn)，HPK1負調(diào)控T細胞中MAP激酶信號通路和AP-1的轉(zhuǎn)錄[1]。多項研究表明，HPK1在減弱T細胞、B細胞和樹突狀細胞的免疫應(yīng)答中發(fā)揮非冗余作用，使得HPK1成為一個有吸引力的腫瘤免疫治療靶點[2]。

2.1 HPK1與乳腺癌2020年，全球乳腺癌的新發(fā)病例數(shù)超過肺癌位列第一，占比達11.7%[19]。乳腺癌是全球癌癥死亡的第5大原因之一，約占女性癌癥病例的1/4和死亡病例的1/6。已證實乳腺癌與BRCA1、BRCA2、PTEN、p53等基因相關(guān)[20]，HPK1在乳腺癌中的研究亦有報道。

在乳腺癌中，HPK1的功能與其他腫瘤似乎存在差異，HPK1的過表達能夠抑制腫瘤細胞的增殖與遷移。都闖等[8]通過檢測102例乳腺癌患者的癌組織和癌旁組織(距癌邊緣>5 cm)中p-Akt和HPK1的蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中p-Akt和HPK1表達水平呈負相關(guān)。因此，p-Akt的高表達可提高癌細胞下游p16蛋白的表達，增強癌細胞的浸潤和黏附能力；HPK1表達缺失則導(dǎo)致殺傷性T淋巴細胞活力不足，導(dǎo)致乳腺癌的進展。王磊等[9]通過對91例乳腺癌組織和85例乳腺腺瘤組織中Kif2a和HPK1的表達研究，發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中Kif2a表達量高于乳腺腺瘤組織，而HPK1表達量低于乳腺腺瘤組織；進一步相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中Kif2a表達量與多種癌基因(DEK、iASPP-SV、Stat3、MDM2、Fra-1)和耐藥基因(ESR1、MDR1、P-gp、MRP1、GST-π)呈正相關(guān)，而HPK1表達量與上述癌基因和耐藥基因呈負相關(guān)。因此認為乳腺癌組織中Kif2a基因的異常高表達和HPK1基因的異常低表達會影響癌基因和耐藥基因的表達，影響乳腺癌的惡性進展。

研究表明[21]，HPK1在乳腺癌組織和細胞中均低表達，而HPK1過表達則可抑制乳腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-231的細胞增殖和遷移，并誘導(dǎo)凋亡，可使MCF-7乳腺癌細胞周期阻斷在G0/G1期。動物實驗證實，HPK1過表達可抑制人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231裸鼠移植瘤的生長，提高其生存率。機制研究發(fā)現(xiàn)，HPK1過表達會引起JNK、p53、caspase-3、PTEN蛋白的表達上調(diào)，MMP-9、MMP-2和Ki-67蛋白的表達下調(diào)。

2.2 HPK1與肺癌肺癌是2020年全球第二大最常見的癌癥，也是癌癥死亡的主要原因，新發(fā)病例數(shù)占比達11.4%，死亡數(shù)達18.0%[19]。

非小細胞肺癌具有免疫原性差的特點，可能與腫瘤環(huán)境中存在前列腺素2(prostaglandin E 2,PGE2)等免疫抑制因子相關(guān)。PGE2被證實能激活HPK1，而在HPK1基因缺失的小鼠模型中，PGE2誘導(dǎo)的Lewis肺癌細胞的生長明顯受到抑制。研究人員將3LL細胞靜脈注射到野生型或HPK1-/-小鼠中，免疫組化發(fā)現(xiàn)HPK1-/-小鼠的腫瘤灶中存在CD3+淋巴細胞浸潤，野生型小鼠腫瘤灶中未檢測到，進一步發(fā)現(xiàn)CD4+和CD8+T細胞均有浸潤；再將野生型或HPK1-/-的T細胞與3LL細胞一起轉(zhuǎn)移到T細胞缺陷的RAG-/-宿主中，發(fā)現(xiàn)接受HPK1-/-T細胞的小鼠肺部腫瘤病灶數(shù)量和大小均顯著減少。腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocyte, TILs)的存在以及T細胞轉(zhuǎn)移到T細胞缺陷小鼠體內(nèi)的實驗結(jié)果表明腫瘤排斥反應(yīng)是T細胞介導(dǎo)的。進一步分析表明可能是由于HPK1敲除的T細胞能夠耐受PGE2介導(dǎo)的對T細胞增殖、IL-2產(chǎn)生和凋亡的抑制。因此得出結(jié)論，PGE2通過HPK1抑制T細胞介導(dǎo)的抗腫瘤反應(yīng)[10]。

55 ku的HPK1相互作用蛋白(HPK1-interaction protein of 55 ku, HIP-55)，又稱DBNL、SH3P7和mAbp1，是一種多域結(jié)合蛋白，對器官發(fā)育和免疫反應(yīng)至關(guān)重要，能夠調(diào)控心血管功能、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)元形態(tài)等[22]。HIP-55是適當?shù)募毎L控制所必需的，有研究顯示，HIP-55在肺癌細胞系和肺癌患者的腫瘤組織中上調(diào)，增強HIP-55的表達可促進肺癌細胞的增殖、集落形成、遷移和侵襲，而沉默HIP-55可逆轉(zhuǎn)這些效應(yīng)。實驗證明，14-3-3蛋白參與HIP-55對HPK1-JNK信號通路的調(diào)節(jié)。機制上，HIP-55調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生的機制可能是通過其與HPK1的相互作用，HIP-55介導(dǎo)的腫瘤發(fā)生活性似乎部分通過拮抗HPK1的功能介導(dǎo)。HIP-55與HPK1的相互作用可成為一種針對HIP-55介導(dǎo)的癌癥的新策略，比如抑制HIP-55或破壞HIP-55與HPK1的相互作用[23]。

2.3 HPK1與胰腺癌胰腺癌惡性程度高，通常預(yù)后不良，5年生存率不足10%，被稱為“癌中之王”，2020年全球新發(fā)病例占比為2.6%，死亡人數(shù)與新發(fā)病例數(shù)幾乎一樣，是男女癌癥死亡的第7大原因[19]。

有研究表明，HPK1在胰腺癌組織中丟失，HPK1蛋白表達的缺失與胰腺上皮內(nèi)瘤變(pancreatic intraepithelial neoplasia, PanIN)的進展和侵襲性胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinomas, PDA)的發(fā)展顯著相關(guān)，可能有助于胰腺癌的腫瘤發(fā)生[24]。該研究同時表明，PDA中的HPK1蛋白表達缺失是通過蛋白酶體途徑實現(xiàn)的，這需要HPK1激酶活性來降解。HPK1在胰腺癌中穩(wěn)定p21和p27并導(dǎo)致細胞周期停滯，進一步證明HPK1可能在PDA中作為腫瘤抑制基因發(fā)揮作用。

Song等[11]研究發(fā)現(xiàn)，HPK1是一種腫瘤抑制因子，通過靶向Axl進行內(nèi)吞轉(zhuǎn)運和溶酶體降解下調(diào)AXL蛋白表達及其下游信號通路。HPK1優(yōu)先通過其C端結(jié)構(gòu)域與Axl相互作用，并導(dǎo)致Axl的下調(diào)，HPK1介導(dǎo)的Axl降解依賴于HPK1激酶活性。此外，還發(fā)現(xiàn)HPK1增加了Axl與原癌基因c-Cbl的結(jié)合，促進Axl泛素化并加速Axl內(nèi)化，通過內(nèi)體運輸?shù)饺苊阁w進行降解。在人類PanIN病變中，Axl蛋白表達與HPK1表達呈負相關(guān)，HPK1的低表達和AXL的高表達與胰腺導(dǎo)管腺癌患者的低生存率顯著相關(guān)。

一項使用HPK1-M46轉(zhuǎn)基因小鼠的研究表明，HPK1的免疫抑制功能需要HPK1激酶活性，激酶結(jié)構(gòu)域的失活增強了抗腫瘤免疫反應(yīng)和抗PD-L1功效。說明使用選擇性小分子抑制劑結(jié)合免疫檢查點抑制劑治療，靶向免疫細胞中的HPK1激酶活性可能是有效癌癥治療的替代策略[2]。然而，HPK1激酶活性是胰腺癌中HPK1介導(dǎo)的致癌酪氨酸受體AXL降解及其下游信號通路抑制所必需的，因此，HPK1在腫瘤細胞中與腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的相互作用和激活中的作用還有待研究[11]。

2.4 HPK1與膀胱癌膀胱癌是全球第10大常見的癌癥，2020年大約有57.3萬新發(fā)病例，占所有癌癥新發(fā)病例數(shù)的3.0%，約21.3萬人死亡。男性中更為常見，發(fā)病率和死亡率約為全球女性的4倍，是男性第6大常見癌癥和第9大癌癥死亡原因[19]。

Hsa-miR-96位于人類7號染色體上，長度22nt。Hsa-miR-96的靶基因，包括IRS1和HPK1。Wang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在膀胱尿路上皮癌中，hsa-miR-96的表達水平高于正常組織，且無性別差異。hsa-miR-96的下調(diào)顯著影響膀胱癌T24細胞的表型，抑制細胞的增殖與遷移并促進細胞的凋亡。與對照相比，hsa-miR-96的下調(diào)會導(dǎo)致T24細胞中IRS1和HPK1的mRNA水平和蛋白水平顯著降低，MAP2K2的表達無差異，表明hsa-miR-96可能通過上調(diào)IRS1和HPK1水平來影響膀胱癌T24細胞的生長。

2.5 HPK1與其他腫瘤據(jù)報道，HPK1還與其他幾種腫瘤相關(guān)。HPK1高拷貝數(shù)與接受奧沙利鉑為基礎(chǔ)化療的III期結(jié)直腸癌患者的復(fù)發(fā)和生存一致相關(guān)，強調(diào)HPK1在調(diào)節(jié)奧沙利鉑反應(yīng)中的重要作用及其作為以奧沙利鉑為基礎(chǔ)的化療療效的生物標志物的潛力[25]。

HPK1在高三尖杉酯堿(homoharringtonine，HHT)誘導(dǎo)的抗性AML細胞系中高度表達。HPK1在AML細胞中的過表達誘導(dǎo)了AML細胞對HHT的抵抗。HPK1的過度表達是預(yù)測AML預(yù)后不良的獨立風險因素。體外研究顯示，HPK1通過MAPK和DNA損傷/修復(fù)途徑調(diào)控細胞周期，揭示HPK1是開發(fā)AML治療方法的一個潛在目標[26]。

3 靶向HPK1的藥物研發(fā)現(xiàn)狀

腫瘤免疫逃逸有兩種機制[27]，其一是腫瘤細胞下調(diào)其抗原加工/遞呈機制，如主要組織相容性復(fù)合體(MHC)I、蛋白酶體亞基潛伏膜蛋白(LMP)2和LMP7、抗原加工相關(guān)的轉(zhuǎn)運蛋白(TAP)和tapasin，以阻止被T細胞識別，造成腫瘤免疫逃逸；另一機制是腫瘤細胞向腫瘤微環(huán)境分泌免疫抑制因子，如TGF-β、IL-8、IL-10、VEGF、ROS等，抑制T細胞功能和/或樹突細胞的成熟，導(dǎo)致腫瘤抗原向T細胞交叉遞呈缺陷。

腫瘤細胞通過促進其PD-L1和B7-1/2分別與T細胞上的免疫檢查點蛋白PD-1和CTLA-4結(jié)合，或者增加PD-L1和PD-1的表達，均可導(dǎo)致T細胞衰竭[28]。HPK1誘導(dǎo)腫瘤浸潤性T細胞障礙，減弱T細胞、B細胞和樹突狀細胞的免疫應(yīng)答，是一個潛在的腫瘤免疫治療靶點，且可與PD1/PD-L1聯(lián)用。但截至目前，尚無HPK1相關(guān)藥物上市，進展較快的在研藥物處于臨床Ⅰ或Ⅰ/Ⅱ期，均為腫瘤免疫治療。

2021年3月，百濟神州宣布其開發(fā)的高活性、高選擇性HPK1小分子抑制劑BGB-15025 的Ⅰ期臨床試驗(NCT04649385)，已完成首例患者給藥。該臨床試驗采取BGB-15025單用和與PD-1單克隆抗體替雷利珠單抗聯(lián)用，治療晚期實體瘤患者。根據(jù)開發(fā)公司公布的臨床前數(shù)據(jù)，BGB-15025可增加PMBC中IL-2的產(chǎn)生；CT26WT同源模型中聯(lián)用PD-1抗體，低至1 mg·kg-1也可表現(xiàn)出顯著的聯(lián)用效果：68%的腫瘤體積小于100 mm3，28%達到無瘤狀態(tài)；初步毒理研究還表明BGB-15025治療窗較寬，約20～50倍。

2020年9月，由Treadwell Therapeutics公司開發(fā)的新型、口服強效HPK1激酶抑制劑CFI-420411的Ⅰ/Ⅱ期臨床研究(NCT04521413)，將進行首次患者給藥，擬采取單用或聯(lián)合帕博利珠單抗在實體瘤患者中的療效。專利中(WO2016205942)示例性化合物A1對HPK1的IC50小于0.05 μmol·L-1。CT26結(jié)腸癌細胞系異種移植模型研究顯示，每日給藥一次劑量為75 mg·kg-1和150 mg·kg-1g的A1分別使腫瘤生長抑制44%和64%，21 d存活率分別為25%和37.5%；抗PD-1抗體單用TGI為34%，21 d存活率為12.5%，與150 mg·kg-1的A1聯(lián)用可使TGI增至86%，21 d存活率提高至87.5%，顯示出良好的體內(nèi)抗腫瘤活性。以上兩種藥物的臨床前實驗數(shù)據(jù)均提示，HPK1抑制劑與抗PD-1抗體聯(lián)用可能是一個較好的方案。

西安宇繁的XYF-19 CAR-T細胞，正在開展在復(fù)發(fā)或難治性CD19+血液系統(tǒng)惡性腫瘤的安全性研究，利用慢病毒載體向T細胞插入CD19特異性嵌合抗原受體，用CRISPR基因編輯消除內(nèi)源性HPK1，目前也處于Ⅰ期臨床(NCT04037566)。開發(fā)人員的研究報道，HPK1敲除的CD19 CRA-T細胞能降低瘤內(nèi)T細胞衰竭標志物PD-1、TIM-3和LAG-3表達水平，促進細胞因子IL-13、IL-2的分泌，從而提高抗腫瘤作用[18]。

此外，還有一些對HPK1有較好抑制活性的化合物被報道。GNE-1858是一種ATP競爭性抑制劑，能夠以劑量依賴性方式抑制HPK激酶結(jié)構(gòu)域的所有3種變異。在SLP76磷酸化實驗中，對野生型HPK1和活性模擬突變體HPK1-TSEE的抑制作用相同，IC50均為1.9 nmol·L-1，對HPK1-SA的殘余激酶活性的IC50為4.5 nmol·L-1[14]。選擇性小分子抑制劑CompK，能夠顯著改善人類T細胞的功能，增強TCR識別病毒和腫瘤相關(guān)抗原的能力以及CD8+T細胞對腫瘤的溶解活性，與抗PD-1有顯著協(xié)同作用；動物研究顯示，CompK聯(lián)合PD-1抗體治療表現(xiàn)出免疫應(yīng)答的提高和極好的抗腫瘤療效；該研究還發(fā)現(xiàn)HPK1激酶的抑制可通過調(diào)節(jié)人類樹突狀細胞及其相關(guān)網(wǎng)絡(luò)來促進抗腫瘤免疫[29]。

4 小結(jié)

相較于傳統(tǒng)的手術(shù)、放療和常規(guī)化療，尋找合適的靶點來實現(xiàn)抗腫瘤免疫治療成為具有前景的手段之一。HPK1作為一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，負調(diào)控TCR/BCR信號以及樹突狀細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，已被證實與多種癌癥的發(fā)生、進展相關(guān)聯(lián)，是一個適合腫瘤治療干預(yù)的靶點。但在不同癌癥中，HPK1所發(fā)揮的作用似乎有所差別，如在乳腺癌、胰腺癌中，其可能發(fā)揮抑癌作用，而在已開展臨床試驗的藥物中，除XYF-19 CAR-T細胞治療明確表示適應(yīng)癥為血液瘤外，另兩項針對實體瘤的適應(yīng)癥尚不知曉，因此，在開發(fā)靶向HPK1藥物過程中需注意篩選相應(yīng)的腫瘤適應(yīng)癥。

MAP4K家族中除HPK1(MAP4K1)外，還有MAP4K2、MAP4K3、MAP4K4、MAP4K5和MAP4K6五個成員。其中，MAP4K3又稱為GLK激酶，它和HPK1都與SLP-76結(jié)合，但在TCR信號通路中作用相反[30]：SLP-76介導(dǎo)GLK激酶的激活，活化的GLK與PKCθ相互作用并激活PKCθ，導(dǎo)致T細胞活化；而HPK1磷酸化SLP-76的Ser-376，誘導(dǎo)激活的SLP-76的蛋白酶體降解，導(dǎo)致TCR信號的衰減。因此，在藥物開發(fā)中要注意篩選出對GLK激酶具有選擇性的HPK1抑制劑。