脫落細胞學檢查聯合HPV-DNA檢測在宮頸癌前病變診斷中的應用

張秀芳

寶坻婦產醫院婦科，天津 301800

宮頸癌是一種常見婦科腫瘤，據統計全球每年因宮頸癌死亡人數超過27.5 萬，特別是在在發展中國家，因宮頸病變的篩查診斷技術的層次不齊，導致早期診斷很難發現，嚴重威脅婦女生命健康［1-3］。宮頸癌在早期無明顯體征和臨床癥狀，隨病情發展可出現陰道排出白色米泔狀液體、陰道流血等［4-5］。研究表明［6-7］，宮頸癌病變病情進展較為緩慢，早期診斷來預防宮頸癌發生癌前病變可明顯降低死亡率。目前，在臨床上主要通過聯合人乳頭瘤病毒（HPV）檢測、液基薄層細胞（TCT）檢測等手段篩查［8］。其中，宮頸刮片脫落細胞學檢查常用于篩查宮頸癌前病變，主要利用宮頸刮板進行宮頸細胞的取樣，是一種無創傷并且有效的檢查方法［9］。宮頸癌前病變的主要致病因子是HPV 的持續感染，并在宮頸癌發生和發展過程中發揮重要作用［10］。檢測HPV-DNA 能夠將篩選感染高危型HPV 女性患者，能夠為及時診治提供依據。本研究選取HPV-DNA檢測和宮頸刮片脫落細胞學檢查進行篩查宮頸癌前病變的100 例患者，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017 年3 月—2018 年3 月寶坻婦產醫院婦科門診收治的100 例采用HPV-DNA 檢測和宮頸刮片脫落細胞學檢查進行篩查宮頸癌前病變的患者作為研究對象，年齡26～64 歲，平均年齡（48.69 ± 6.48）歲。（1）納入標準：患者沒有宮頸手術病史以及子宮切除手術史；患者目前沒有妊娠；沒有細胞學檢查結果異常病史。（2）排除標準：合并其他惡性腫瘤、感染、自身免疫疾病、器質性病變等疾病者；依從性不好，未完成本研究者；哺乳期、妊娠期患者；結蹄組織相關疾病者。本研究經醫院醫學倫理委員會通過。

1.2 實驗方法

宮頸刮片脫落細胞學檢查：避開經期，檢查前2 d未進行性生活、陰道沖洗或者上藥等，患者取膀胱截石，暴露宮頸；采用液基薄層細胞試劑盒中的子宮頸刷采集子宮頸脫落細胞樣本置入裝有細胞保存液的小瓶進行漂洗，采用全自動制片機處理，分離標本中的黏液、上皮細胞、血液及炎性細胞。細胞通過膜式過濾器負壓吸轉到膜上，將其轉移到經靜電處理的載玻片上，混勻細胞制定到的薄層細胞涂片（直徑2 cm 左右）2 張，并采用95%濃乙醇進行固定，采用巴氏染色，之后在雙盲下讓兩名病理師采用光學顯微鏡進行閱片檢查，細胞學診斷采用國際癌癥協會分級系統分為良性炎癥改變、正常細胞、意義不明確的低度鱗狀上皮內病變、非典型鱗狀細胞、鱗狀細胞癌及高度鱗狀上皮內病變。TCT檢測異常指的是ASCUS及以上病變。

HPV-DAN檢測：采用美國ABI公司生產的7500型核酸擴增儀實施PCR 擴增、雜交、洗膜及顯色，采用原裝的配套試劑HR-HPV 核酸定量檢測試劑盒檢測HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83、MM4 共18 個亞型。用無菌棉簽蘸取無菌生理鹽水，插入女性的宮頸口，沿內壁旋轉5圈，以獲取足量的脫落細胞和分泌物，然后將其放入裝有洗脫液（1 mL）的洗脫管中待測。將宮頸刷放在洗脫管內漂洗，將洗脫液轉移到微量離心管（1.5 mL），10 000 rpm/min 離心10 mim，丟棄上清液，留下管底全部的細胞塊。向其中加入50 μL左右裂解液懸浮沉淀，100℃的水浴加熱10 min，10 000 rpm/min 離心10 min，保留上清液待用。HPV 的基因擴增：取1 μL 的DNA 抽提液，向其中加入HPV 的PCR 擴增體系，用試劑盒的擴增程序進行擴增反應；最后給予72℃延伸5 min。之后采用導流雜交法HPV 的基因給與分型：將20 μL 有生物素標記的PCR 產物通過變性，和1 mL 預熱到45 ℃的雜交緩沖液混合，放置于導流雜交儀上經過5 min孵育然后實施導流雜交。雜交結束再用0.8 mL 雜交緩沖液3 次沖洗。在25 ℃下用封阻液封阻5 min 孵育。封阻結束之后加入0.5 mL 酶標液孵育3.5 min。用沖洗緩沖液A 沖洗雜交膜，去除沒有結合的酶標液，顯色期間加入0.5 mL 的四唑硝基藍/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸底物在36 ℃條件下保持5 min 或顯色完成結束。在顯色后1 h內察看分析結果。

病理學檢測：將以上異常結果的患者進行病理學活檢，并以病理學結果為標準。在受檢者月經干凈后1周由經驗豐富的陰道鏡專業醫師進行檢查，把陰道窺器放入陰道后將宮頸表面分泌物擦凈，然后用3%冰醋酸棉球將宮頸浸濕，采用陰道鏡對可疑部位多點取材，組織標本常用1%甲醛溶液固定，然后進行病理學檢測。觀察柱狀上皮、鱗狀上皮及轉化區的形態及顏色變化，當發現異常陰道鏡圖像后，用盧戈碘液涂抹宮頸，多點活檢點狀血管、白色上皮等組織。結果分別為宮頸上皮內瘤變（CIN）及炎癥反應，根據病變程度分為Ⅰ～Ⅲ級及浸潤癌3類。

1.3 分析方法

以組織活檢診斷為標準，HPV-DNA 檢測和宮頸刮片脫落細胞學檢查結果與組織活檢診斷結果進行對照，計算出兩者聯用篩查宮頸癌前病變的敏感度和準確性以及陽性和陰性預測值。

2 結果

2.1 宮頸刮片脫落細胞學、HPV-DNA 檢測和活組織病理檢查結果

宮頸刮片脫落細胞學檢查結果：正常范圍者71 例，未明確意義的不典型鱗狀上皮細胞者14 例（14.00%）。低度鱗上皮內病變者10 例（10.00%），低度鱗狀上皮內病變者4例（4.00%），鱗狀上皮浸潤癌者1 例（1.00%）。高危型HPV-DNA 檢測結果：陽性29 例，陽性率29.00%。病理檢查確診為宮頸病變的患者高危型HPV DNA 陽性率：CIN I 44.44%（12/27），CINⅡ88.46%（23/26），CIN III 91.67%（22/24），官頸浸潤癌90.48%（19/21）。

2.2 宮頸刮片脫落細胞學檢查聯合HPV-DNA 檢測的特異度、敏感度以及陽性預測值

以組織活檢診斷為確診標準，分別計算了宮頸刮片脫落細胞學檢查聯合HPV-DNA檢測的敏感度和準確性以及陽性和陰性預測值。兩組方法聯合檢查組的特異度和敏感度顯著高于宮頸刮片脫落細胞學檢查組和HPV-DNA 檢測組，差異有統計學意義（P＜0.05）；兩組方法聯合檢查組的陽性預測值顯著高于宮頸刮片脫落細胞學檢查組和HPV-DNA檢測組差異有統計學意義（P＜0.05），并且聯用組陰性預測值比顯著低，見表1。表明聯用組的確診能力和排除疾病能力均強于單用組。

表1 宮頸刮片脫落細胞學檢查聯合HPV-DNA檢測的特異度、敏感度以及陽性預測值 %

3 討論

宮頸癌婦科常見的惡性腫瘤之一，經過醫學干預可以有效降低其發病率和病死率，而及時預防和控制宮頸癌的發生發展是提高宮頸癌患者存活幾率的關鍵［11］。上世紀80年代有學者提出HPV 有可能與宮頸癌的發生有關，基于此進行了相關研究［12］。收集宮頸脫落細胞進行相關檢查也是宮頸癌早期篩查的重要手段［13］。目前臨床上常采用宮頸脫落細胞行TCT 檢測，認為優于宮頸刮片取材［14］。在TCT檢測時，用軟刷使宮頸脫落的細胞粘附在刷毛，然后放在保存液中振蕩漂洗，使大部分細胞溶在保存液［15］。因為TCT 技術可用于檢出滴蟲、念珠菌等，其細胞取材較為廣泛，并且在癌前病變及宮頸癌的檢測中具有較高的檢出率［16-17］。但是TCT 檢測具有價格較高及步驟復雜等，在HPV感染診斷中易漏診［18］。

宮頸癌前病變的重要病因是HPV 感染，特別是年輕患者的病毒自然清除期需8～10個月，不易引起病變，而宮頸病變的前提條件是持續性HPV 感染［19］。目前，HPV 的感染與宮頸癌的直接關聯已被證實，并且HPV 與宮頸癌癌前病變密切相關，并且高于99%的宮頸癌患者體內均可檢出HPV，而在健康人群中這一比例僅為4%，因此HPV 的檢測在評估子宮頸病變的進展中具有重要地位［20］。

相關研究表明［21］，宮頸癌的發生與HPV 聯系密切，病毒對機體侵染階段，HPV 病毒對機體的感染可能會導致機體炎性反應及免疫微環境發生改變，從而間接促進腫瘤細胞發生進展和增殖。在侵染早期，機體能夠通過對病毒的免疫抑制將病毒消除，少數者因為病毒發生持續性增殖，可能會導致宮頸上皮細胞發生癌變［22］。本研究中，100 例樣本行宮頸刮片脫落細胞學檢查，結果表明，兩種檢查方法聯合檢查的特異度和敏感度顯著高于宮頸刮片脫落細胞學檢查組和HPV-DNA檢測組，兩組方法聯合檢查組的陽性預測值顯著高于宮頸刮片脫落細胞學檢查組和HPV-DNA檢測組，并且聯用組陰性預測值比顯著低。表明聯用組的確診能力和排除疾病能力均強于單用組。但針對不同級別的患者的檢出率不一致，因此，針對特殊患者應進一步進行病理檢測，不應抱有僥幸心理，如細胞學診斷為高度鱗狀上皮內病變和鱗狀上皮浸潤癌級別以上的患者應進一步進行HPV-DNA的檢測，陽性者應進一步行陰道鏡檢測，有必要時進行病理活檢［23］。

綜上所述，宮頸脫落細胞學檢查聯合HPV-DNA檢測對宮頸癌前病變的篩查和診斷有積極的臨床價值。