腎移植患者血清miR-338-5p水平表達及其臨床意義研究

陳 輝，何 偉，崔 勇，遲 凱，王鎖剛

河南中醫藥大學第一附屬醫院泌尿外腎移植科，河南 鄭州 450000

終末期腎臟病（ESRD）病死率較高，其可導致患者出現水腫、貧血、電解質酸堿平衡紊亂等情況。臨床上針對ESRD 患者可采取腎移植治療，可以有效提高患者的短期存活率，但隨著移植時間的延長，部分患者移植腎功能會逐漸喪失，降低了患者的長期存活率，影響預后［1-2］。臨床認為移植腎功能喪失的原因包含兩方面，即免疫與非免疫兩種因素，其中影響腎移植患者長期存活率的主要因素為免疫因素介導的腎移植排斥。免疫介導的腎移植排斥反應在急性、慢性排斥反應中均有重要作用，可溶性B 細胞活化因子（sBAFF）主要由單核細胞、T 細胞、樹突狀細胞產生，其可促進B 細胞成熟、分化，在機體免疫應答中發揮著重要作用。sBAFF 參與了多種免疫疾病的發生、發展過程，sBAFF 參與了腎移植患者術后排斥反應的發生過程，與患者的長期存活率具有密切關聯，sBAFF 異常時，表明患者已經存在異常的免疫應答，其對腎移植患者的排斥反應并沒有良好的預警作用［3］。miR-338-5p 是一種長為22個核苷酸的微小RNA，其具有608個靶基因，其中TRAF3、NF-kB1 就是miR-338-5p 靶基因中的一種，而TRAF3 是sBAFF 信號傳導的重要轉接蛋白、NF-kB1 途徑是重要的sBAFF 信號之一。且有研究表明，血清miR-338-5p水平與sBAFF之間存在一定的關聯性［4］。但臨床上關于該類型的研究報道相對較少，故本研究旨在探討腎移植患者血清miR-338-5p 水平表達及其臨床意義，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017 年7 月—2019 年8 月河南中醫藥大學第一附屬醫院收治的100 例接受腎移植手術患者，依據腎移植術后是否出現排斥反應進行分組，將出現排斥反應的36例患者的臨床資料歸為觀察組，將未出現排斥反應的64例患者的臨床資料歸為對照組。觀察組男25 例，女11 例，年齡20～78 歲，平均年齡（49.23±7.62） 歲，身體質量指數（BMI）18.5～28 kg/m2，平均BMI（23.25±1.36）kg/m2。對照組男39 例，女25 例，年齡男21～78 歲，平均年齡（49.75±7.59） 歲，BMI 19～28 kg/m2，平 均BMI （23.50±1.28）kg/m2。兩組患者一般資料具有可比性（P＞0.05）。

1.2 入選標準

納入標準：均符合腎移植指征，如各種原因所致的不可逆ESRD 患者、心肺功能良好，精神、認知功能正常，凝血功能正常，臨床資料完整。排除標準：合并惡性腫瘤且已發生轉移，活動性肝炎，術前早期腎功能不全，活動性慢性感染病灶、活動性消化性潰瘍病。

1.3 血清miR-338-5p水平及sBAFF水平測定方法

術后3 d采集所有患者的肘靜脈血4 mL，以3 500r/min的離心速率，15 cm 離心半徑離心10 min 后取血清，按照miRNeaySerum/PlasmaKit 試劑盒提取血清中總RNA，應用分光光度計（青島市三凱醫學科技有限公司，魯械注準20152220266，型號SK6880） 測定RNA 的純度、濃度，RNA 溶液無雜質后可行下一步逆轉錄過程。逆轉錄應用SYBR-PrimerScript-miRNA RTPCR kit 試 劑 盒，U6n 為 內參，PCR 反應應用實時熒光定量PCR 儀[卡尤迪生物科技（北京）有限公司，國械注準20163401400，型號Mini8 Plus]進行。逆轉錄過程：37 ℃逆轉錄60 min，85 ℃5 s滅活逆轉錄酶。miR-338-5p反應體系：95℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃34 s，40 個循環。血清sBAFF 水平應用酶聯免疫吸附法測定。每例標本重復兩次，取其平均值。

1.4 評價指標

（1）比較兩組患者的血清miR-338-5p 及sBAFF 水平。（2）分析血清miR-338-5p水平與sBAFF水平的相關性。

1.5 統計學方法

采用SPSS 25.0 軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗。采用Pearson分析miR-338-5p 水平與sBAFF 水平的相關性，r＞0 為正相關，r＜0為負相關。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者血清miR-338-5p及sBAFF水平情況

觀察組患者血清miR-338-5p 水平低于對照組患者，sBAFF 水平高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組患者血清miR-338-5p及sBAFF水平情況（±s）

表1 兩組患者血清miR-338-5p及sBAFF水平情況（±s）

組別對照組（n=64）觀察組（n=36）t值P值miR-338-5p 3.78±1.62 0.17±0.05 13.337 0 sBAFF（pg/mL）764.28±96.72 1 749.43±127.64 43.472 0

2.2 兩組患者miR-338-5p 水平與sBAFF 水平的相關性分析情況

經Pearson 分析，miR-338-5p 與sBAFF 呈負相關，差異有統計學意義（r=-0.677，P=0）。

3 討論

腎移植患者術后的排斥反應的發生機制主要與患者體內的抗同種供體人類白細胞抗原（HLA）分子、ABO 同種凝集素或抗內皮細胞抗體介導的免疫排斥有關。腎移植排斥反應不僅加重了患者的痛苦，對患者的腎移植后的長期存活率也造成了嚴重的影響［4-5］。臨床上將腎移植的排斥反應分為急性排斥反應與慢性排斥反應兩種，其中急性排斥反應是由高效價的抗體所致補體系統激活及移植物內皮細胞的溶解性損傷有關，患者具有臨床癥狀加重、大劑量激素沖擊治療無效、治療難度較大、預后差等特點，臨床上常給予免疫抑制劑進行治療［6-7］。而慢性排斥反應的發生機制尚未明確，患者多出現蛋白尿、貧血、腎功能逐漸惡化等癥狀，臨床上目前暫無有效的治療方法［7-8］。因此，探討腎移植患者免疫介導的排斥反應的發生機制具有不可忽視的重要性。

B細胞活化因子（BAFF）是一種Ⅱ型三聚體跨膜糖蛋白，可被Furin 樣蛋白酶裂解呈sBAFF，進而重組為包含20 個三聚體的有序衣殼樣結構，利于受體結合。BAFF 主要有免疫細胞、活化的T 細胞及部分B 細胞分泌合成，在腎移植患者中，其在γ 干擾素、白細胞介素-10 等激活下，T細胞和活化的B細胞會上調BAFF水平，致使其出現異常高表達情況，而高水平的BAFF 會導致B 細胞持續存活，進而導致患者sBAFF 水平增長，致使患者發生免疫介導的排斥反應［9-10］。miRNA是長度約為22個核苷酸的非編碼小分子RNA，其可通過與靶基因非編碼小分子結合來起到調控靶基因表達的作用，其參與了機體正常發育的調節等過程。其中miR-338-5p 是miRNA 家族中的一種，且有研究表明，miR-338-5p 在BAFF 高表達的腎移植患者中呈明顯的低表達情況，且移植腎中的miRNA表達與mRNA存在明顯的相關性，miRNA水平的表達情況可有效反應出腎移植患者的急性排斥反應及腎功能狀態，故臨床上可通過miRNA表達情況來預測患者發生排斥反應的風險性［11-12］。正常情況下，成熟microRNA 是以microRNA 核糖核蛋白復合體形式來發揮作用，其可與靶mRNA 的3’-非編碼區（3’-UTR）堿基互補、配對來起到降解mRNA、抑制蛋白質翻譯等作用，又或者讓靶mRNA 以miRNA 依賴方式聚集至P小體中，來讓其逃避翻譯，進而介導基因的轉錄后調控，達到使特定基因沉默的作用［13］。TRAF3 基因可與多種受體結合，其除了可以調節B 淋巴細胞信號，還對B 淋巴細胞轉化期至成熟期的各個階段均有影響，TRAF3基因在B 淋巴細胞自穩中發揮著重要的調節作用［14］。在B 淋巴細胞中，TRAF3 可以對CD40 誘導的NF-κB2 信號途徑具有負調節作用，對EB 病毒編碼的CD40 模擬物低分子量蛋白1（LMP1）誘導的非經典NF-κB2 信號起正向調節作用。當TRAF3過表達時，可對未受刺激的B 淋巴細胞瘤細胞株NF-κB 報告基因活性具有抑制性。且相關研究表明，TRAF3 可以對BAFF-BAFF-R 介導的NF-κB 激活具有負調節作用。這或許可間接反映TRAF3 可能通過調節BAFF 信號而參與機體免疫耐受的調節過程［15］。NF-KB 信號通路可控制轉錄的DNA、細胞因子產生及細胞存活，其與sBAFF 具有一定的關聯性。當sBAFF 與其受體TACI、BCMA 結合時，對經典NF-KB 信號通路激活具有誘導作用，而激活后的NF-KB 轉位入核與靶基因啟動子/增強子上的KB 位點進行結合，進而起到調控多種靶基因表達的作用。NF-KB 信號通路在感染、免疫反應、細胞凋亡等多種生理、病理過程中均發揮著重要作用［16］。miR-338-5p 具有較多的靶基因，其中包含了TRAF3、NF-KB1 兩種基因，miR-338-5p可以通過調控基因TRAF3、NF-KB1參與腎移植患者的排斥反應過程，而NF-KB1 是BAFF 信號的重要途徑之一，而TRAF3 參與了BAFF 下路信號傳導過程，且NF-KB1對TRAF3具有靶向調控作用，miR-338-5p通過直接作用于TRAF3、NF-KB1，對BAFF信號起到間接調控作用。miR-338-5p 通過調節TRAF3mRNA 水平，活化BAFF信號，進而刺激B 淋巴細胞分泌免疫球蛋白G，從而導致腎移植患者出現排斥反應。本研究結果顯示，觀察組血清miR-338-5p 水平低于對照組，sBAFF 水平高于對照組，經Pearson 分析，miR-338-5p 與sBAFF 呈負相關。這表明在出現排斥反應的腎移植患者血清中miR-338-5p 呈明顯低表達情況，且其水平與sBAFF水平呈明顯負相關，miR-338-5p 對BAFF 信號具有調節作用，對腎移植患者術后排斥反應發生具有一定的預測價值。

對本研究結果進行分析后認為，BAFF 因子與TACI、BCMA 受體結合后可激活miR-338-5p的靶分子NF-KB1信號通路，致使NF-KB1 與靶基因上的KB 位點結合，進而起到調節多種靶基因的表達，而NF-KB1 信號通路參與了機體的免疫反應、炎癥等多種病理過程，其對細胞周期的調控及分化具有一定作用，進而引發了腎移植患者出現免疫介導的排斥反應。本研究結果仍然存在一定的局限性，本研究中的樣本量有限，這可能會在一定程度上影響研究結果的準確性，且本研究尚未觀察腎移植手術對患者血清miR-338-5p 的影響，關于血清miR-338-5p 水平與腎移植手術治療之間的因果關系仍需今后進一步研究證實。此外，本研究所選的研究對象均為隨訪的腎移植患者，該研究并未取得所有腎移植患者的腎活檢組織，因此，對于血清miR-338-5p 水平表達與腎移植患者病理的相關性尚未明確。

綜上所述，血清miR-338-5p 水平與sBAFF 水平呈明顯負相關，臨床上可通過檢測miR-338-5p 水平來預測腎移植患者術后發生排斥反應的風險性。