農業轉基因核酸標準物質研究進展

林鷹 楊文莉 周玲艷 姜大剛

（1. 仲愷農業工程學院農業與生物學院，廣州 510225；2. 華南農業大學生命科學學院，廣州 510642）

近年來，轉基因作物發展迅猛，種植面積不斷擴大。轉基因農作物能滿足人類對于農產品產量和質量不斷增長的要求，為消費者提供更多選擇［1］。我國已經批準轉基因棉花和轉基因番木瓜的商業化生產，創造了巨大的經濟效益和生態效益。轉基因技術產生以來，國際食品法典委員會（Codex Alimentarius Commission，CAC）、聯合國糧農組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）、世界衛生組織（World Health Organization，WHO）等針對轉基因技術產品安全問題制定了一系列轉基因生物安全評價標準，我國也建立了比較完善的農業轉基因生物安全標準體系［2］。為保障轉基因產品成分的檢測結果準確一致，需要設置標準物質對照樣品［3］。

標準物質（reference material，RM）是一種已經確定了具有高度均勻性、良好穩定性和量值準確性等特性值的物質或材料。其均勻性和穩定性的特性，有利于在特性檢測或測量中進行使用評估［4］。因此，農業轉基因檢測標準物質的研制和使用，可以保證農業轉基因產品檢測結果的有效性和可比性，為農業轉基因產品定性和定量檢測提供保障，也是解決轉基因產品準確檢測的基礎［5］。鑒于農業轉基因檢測標準物質的重要性，本文對轉基因農作物標準物質的研究進展進行了總結，并對幾種主要類型的標準物質進行比較，同時，梳理了轉基因檢測標準物質研制中所存在的問題，并就研究現狀和存在問題提出建議與對策，以期為我國農業轉基因檢測標準物質研制和相關研究提供參考。

1 國內外農業轉基因檢測標準物質研究概況

轉基因作物商業化應用已經25年，各國農業轉基因檢測標準物質的研制也在不斷增加，主要有美國油脂化學家學會（American Oil Chemists’ Society，AOCS）和歐盟聯合研究中心（Joint Research Center，JRC），除此之外，還包括日本國立食品綜合研究所（National Food Research Institute，NFRI）和 墨西哥國家計量院（The National Center of Metrology，CENAM）等［6］。美國AOCS的農業轉基因檢測標準物質在售的類型包括油菜、棉花、玉米、水稻和大豆這五類，有證標準物質共63個，包括60個轉化體。歐盟JRC在售的轉基因農作物標準物質包括油菜、棉花、玉米、馬鈴薯、大豆和甜菜這六類，有證標準物質有37個轉化體，包括146個農業轉基因檢測標準物質（圖1、2）。歐盟JRC有二十幾個轉化體具有一套不同含量的轉基因檢測標準物質，例如，“Bt-176 MAIZE”基因組DNA標準物質具有0、0.1%、0.5%、1%、2%、5%、100%含量的7個轉基因檢測標準物質，“Bt11 MAIZE”基因組DNA標準物質具有0、0.1%、1%、10%、100%含量的5個轉基因檢測標準物質。

圖1 三大經濟體轉基因作物有證標準物質數量及包含的轉化體個數Fig.1 Number of certified reference materials and involved transgenic crop events of three major economies

圖2 三大經濟體主要轉基因農作物的有證標準物質數量Fig.2 Number of certified reference materials of genetically modified crops in three major economies

2008年起，我國開始進行轉基因檢測標準物質的研制，并且成功研制出一批農業轉基因檢測標準物質［7］，研制單位主要有中國計量科學研究院、中國農業科學院以及農業農村部科技發展中心等。目前，在我國國家標準物質資源共享平臺（National Sharing Platform for Reference Materials，China）上，可以查詢到農業轉基因標準物質有27個轉化體（圖1）。在這些標準物質中，有7種轉化體具有不同含量的轉基因檢測標準物質，如“轉基因BT63水稻種子粉末”和“轉基因克螟稻2號水稻種子粉末”都具有0.5%、1.0%、2.0%、5.0%含量的4個轉基因檢測標準物質。

在已經商業化或具有商業化前景的轉基因作物中，抗蟲和耐除草劑性狀占據絕大部分比例。我國已經獲批的轉基因檢測標準物質與美國AOCS和歐盟JRC的情況類似，主要是抗蟲和耐除草劑性狀（表1，2）。我國的研制對象主要是油菜、棉花、玉米、水稻和大豆這5種轉基因作物，例如轉基因棉花［8］、轉基因玉米NK603［9］、轉基因水稻［10］、轉基因大豆pMON87712［11］等。美國AOCS和歐盟JRC的研制對象也主要是水稻、玉米、大豆、棉花等農作物。標準物質研究類型方面，我國與美國AOCS以及歐盟JRC有所區別，美國AOCS的轉基因檢測標準物質種類主要有基體和基因組DNA轉基因檢測標準物質，其中基體類型達到了40種；歐盟JRC主要研制基因組DNA轉基因檢測標準物質，數量達到了30種，也有少量的質粒和基體轉基因檢測標準物質；我國農業轉基因檢測標準物質主要以質粒和基體轉基因檢測標準物質類型為主，也有部分基因組DNA轉基因檢測標準物質（圖3）。

表1 美國與歐盟部分農業轉基因檢測標準物質Table 1 Certified reference materials of agricultural genetically modified crops in United States and European Union

圖3 三大經濟體農業轉基因有證標準物質的種類Fig.3 Certified reference materials types of agricultural genetically modified crops in three major economies

2 我國農業轉基因檢測標準物質技術規范

近年來，越來越多的轉基因檢測標準發布執行，其中多個檢測方法和技術規范與標準物質相關（表3）。2012年，農業農村部發布的轉基因植物的檢測方法及技術規范第1782號中有2項標準物質研制相關技術規范，分別為《轉基因植物及其產品成分檢測基體標準物質制備技術規范》和《轉基因植物及其產品成分檢測標準物質試用評價技術規范》。2015年，中華人民共和國農業部公告第2259號中有3項標準物質相關技術規范，包括《轉基因植物及其產品成分檢測基體標準物質定值技術規范》《轉基因植物及其產品成分檢測玉米標準物質候選物繁殖與鑒定技術規范》《轉基因植物及其產品成分檢測棉花標準物質候選物繁殖與鑒定技術規范》。2018年，中華人民共和國農業農村部公告第111號中有2項標準物質相關技術規范，包括《轉基因植物及其產品成分檢測基因組DNA標準物質制備技術規范》和《轉基因植物及其產品成分檢測基因組DNA標準物質定值技術規范》。2020年，中華人民共和國農業農村部公告第323號中有4項標準物質相關技術規范，包括《轉基因植物及其產品成分檢測油菜標準物質原材料繁殖與鑒定技術規范》《轉基因植物及其產品成分檢測大豆標準物質原材料繁殖與鑒定技術規范》《轉基因植物及其產品成分檢測質粒DNA標準物質制備技術規范》《轉基因植物及其產品成分檢測水稻標準物質原材料繁殖與鑒定技術規范》。以上標準物質有關的標準涉及了標準物質的基本概念、候選物的繁殖、制備技術流程等。相關規范的不斷出臺，促進和規范了我國農業轉基因檢測標準物質的快速研制。

表3 我國部分農業轉基因檢測標準物質技術規范Table 3 Some technical specifications of agricultural genetically modified testing reference materials in China

3 農業轉基因檢測標準物質種類與研制

目前，已經獲批的農業轉基因檢測標準物質種類主要有基體標準物質［12-13］、質粒標準物質［14］、基因組DNA標準物質［15］三類。由于其原料選擇不同，標準物質研制的方法和過程也不同，具有不同的優缺點（表4）。

表4 3種農業轉基因檢測標準物質的區別Table 4 Comparison of three agricultural genetically modified testing reference materials

農業轉基因基體標準物質是由純合的非轉基因作物種子與純合的轉基因作物種子，按照一定的質量比例混合制備而成。與待測樣品具有相同或者相似的特性，檢測結果不需要矯正，結果穩定可靠。基體標準物質量值范圍廣，在實際檢測中可在0-100%之間，其適用性也較廣，可以進行核酸或蛋白質檢測，但由于原料的特殊性，在制備基體標準物質時需要測定種子的顆粒大小、含水量和基體粉末質量分數等［16］。多個研究課題組報道了基體標準物質的研制，如轉基因玉米MIR604［17］和轉基因大豆MON89788［18］等。基體標準物質有其突出優點，但也存在不足，比如成本較高，對原料要求與鑒別高于其他兩種標準物質種類，且一種基體標準物質只能用于一種作物的檢驗。

農業轉基因質粒標準物質是通過構建一個具有外源目的片段和內源標準基因片段的重組質粒DNA分子，以用于檢測轉基因DNA的標準物質。質粒標準物質可用于檢測多個靶標的轉化體［19］，且比基體標準物質更方便［20］；在制備質粒標準物質時，可以通過細菌的大量培養達到大量繁殖的效果，從而有效解決陽性標準品制備困難的問題，且成本低廉，操作簡便［21］；另外，由于構建的質粒是含有目的片段的重組質粒分子，因此轉基因質粒標準物質純度高，均勻性好，可以進行高通量檢測，不依賴轉基因原材料限制。已有多個質粒標準物質制備的報道，如轉基因油菜［22］、轉基因棉花［23］、轉基因大豆質粒標準物質［24］、轉基因水稻克螟稻2號［25］。在質粒標準物質研制過程中，需要對質粒進行DNA抽提、純度鑒定、適應性鑒定等，在定值時需測定外源與內源參考基因的拷貝比值和拷貝數濃度。這與待測樣品的基因組DNA抽提過程和獲得的DNA結構并不是完全一致的；同時，質粒標準物質分子較小，在使用中容易造成實驗室污染，質粒分子的定值誤差也較大，對結果的影響較大［26］。

農業轉基因基因組DNA標準物質是以提取農作物的基因組DNA而制備。已經報道的轉基因基因組DNA標準物質有轉基因水稻科豐6號［27］、轉基因水稻KMD［28］、轉基因水稻G6H1、轉基因玉米雙抗12-5等（表2）。在標準物質制備時，需要進行轉基因農作物基因組DNA抽提以及基因組DNA質量評價。基因組DNA的制備過程決定了其具有質量高、結構穩定的特點。但基因組DNA標準物質不能用于蛋白質的檢測，且制備時需要抽提大量的DNA，同時對制備DNA的原料要求也比較高。

表2 我國的部分農業轉基因作物有證標準物質Table 2 Some certified reference materials of agricultural genetically modified crops in China

以上3種類型的轉基因檢測標準物質的研制均包括原料提取純化、性質的初步表征、分裝、適應性驗證、均勻性和穩定性檢驗、不確定度測算［29］、定值以及申報等過程。其中，性質的初步表征主要是對轉基因農產品的基因型、性質、轉基因片段以及純度進行測定，同時需要對已知標準物質的不確定度進行測算等［30］。在研制農業轉基因檢測標準物質時，定值方法非常重要，其不僅在定值過程中發揮重要作用，同時，在性質的初步表征、均勻性和穩定性檢驗、不確定度評估中同樣發揮重要作用。因此，研發者需要對定值方法進行優化，也需要有方法學參數等校準系統作為支撐，從而通過方法重復性、重現性、靈敏度等方面的數據驗證，以保證定值方法的可靠性以及研制定值結果的說服力［31］。在評估不確定度時，應考慮到各種檢測定值方法引起的不確定度，以保證標準物質的準確性和可追溯性［32-33］。

目前，對農業轉基因檢測標準物質的定值方法主要包括實時熒光定量PCR和數字PCR方法兩種，其中數字PCR由于其具有的絕對定量的優越性，得到越來越多的應用。數字PCR是將單個DNA樣品反應液分別進行數以萬計的反應和擴增檢測，是一種基于PCR的單分子絕對定量技術［34］。與實時熒光PCR不同，數字PCR在農業轉基因檢測標準物質定值中，不需要依賴對照樣品和標準曲線，即可直接對核酸拷貝數的絕對量值進行檢測，具有靈敏度和準確性更高的特點，成為目前主要的定值技術［35］。但是，數字PCR技術也存在著成本高、自動化和集成度水平低、分析通量低、兼容性差等問題［36］，并且作為一種新型技術，標準體系還需要進一步的完善。因此，完善數字PCR標準體系建設和積極推動數字PCR標準的國際化，對農業轉基因檢測標準物質的研制具有重要意義。

4 我國農業轉基因檢測標準物質研制中存在的問題

我國農業轉基因檢測標準物質的研制起始時間滯后于歐美發達國家，近些年來奮起直追，取得了巨大的進步。但我國轉基因檢測標準物質的研制尚存在以下幾個主要問題：

首先，獲得批準的轉基因檢測標準物質數量較少。至2019年，我國已經批準5種轉基因作物用于進口加工原料，同時，還有批準種植的農作物如棉花等，但在國家標準物質資源共享平臺上可查詢到的、獲批的轉基因檢測標準物質數量只有46個。因此，加快對轉基因檢測標準物質的研制和申報迫在眉睫。

其次，獲批的標準物質大部分以基體或者質粒類型為主，如轉基因馬鈴薯標準物質［37］。同時，標準物質以水稻為主，而大量進口的轉基因玉米和大豆轉化體則相對較少。因此，應通過多種形式拓寬標準物質的研制種類和范圍，以滿足轉基因產品的檢測需求，保證轉基因農產品安全使用。

最后，轉基因檢測標準物質由于價格問題，在實際的檢測工作中應用不夠廣泛，作用發揮不夠到位。因此，需要政府管理部門主導農業轉基因檢測標準物質的研制，并與國際接軌，通過國際比對和各國協同定值，進一步發揮轉基因檢測標準物質作為分析檢測轉基因農產品的物質基礎和質量管理工具，保障貿易安全，保護經濟利益［38］。

5 展望

農業轉基因檢測標準物質的研制，是農業轉基因產品定性與定量檢測中不可或缺的評量物質，為轉基因農作物檢測提供保障，其制備技術和應用程度能夠直接反應轉基因農產品檢測技術體系的水平以及轉基因農產品檢測準確度的可靠性。隨著國家對轉基因檢測標準物質研制的重視，以及轉基因檢測標準物質在檢測工作中的推廣使用，轉基因檢測標準物質的作用也將得到更好的發揮，更好的為我國生物育種發揮保障作用。因此，更準確、方便實用的轉基因檢測標準物質，必將更加有利于促進農業轉基因產業的更優發展。