棉花黃萎病抗性相關基因GhTIFY9的克隆與功能分析

李秀青 胡子曜 雷建峰代培紅 劉超 鄧嘉輝 劉敏 孫玲 劉曉東李月

（1. 新疆農業大學農學院，烏魯木齊 830052；2. 新疆農業大學生命科學學院，烏魯木齊 830052）

棉花是一種在世界范圍內普遍種植的經濟作物，同時也是天然纖維和油料的主要來源［1］。黃萎病是一種主要由大麗輪枝菌（Verticillium dahliaeKleb）引起的土傳維管束真菌病害；大麗輪枝菌寄主范圍廣泛，可以侵染包括棉花在內的200多個雙子葉植物品種；此外它還可以在棉花的整個生命周期內發生，造成棉花產量的大幅損失，嚴重影響其纖維品質［2］。由于目前還沒有針對性的殺菌劑及其他有效的防御措施，因此，選育抗病品種是控制該病原菌危害的最有效途徑，而發掘棉花抗病相關基因是棉花抗病育種的關鍵和基礎［3］。

轉錄因子（transcription factors，TF）在植物抗逆中發揮著不可或缺的作用，已逐漸成為植物抗逆育種的關鍵。TIFY家族是一類包含TIFY結構域的轉錄因子，只存在于植物中，在植物的生長發育和抗逆反應中發揮著重要的調控作用［4］。根據保守結構域組成的不同，TIFY家族可分為TIFY、JAZ、ZML和PPD四個亞家族，均包含一個高度保守的TIFY結構域。然而，JAZ亞家族蛋白在C端還存在一個保守的Jas結構域；ZML亞家族蛋白還含有一個GATA鋅指結構域和一個CCT基序；PPD亞家族蛋白則還存在一個N端PPD結構域和一個PY基序缺失的Jas結構域；TIFY亞家族則只含有一個TIFY結構域［5］。最早由Nishii等［6］在擬南芥中鑒定出了一個TIFY家族基因ZIM，此后TIFY家族基因陸續在水稻、玉米、小麥、丹參、柳枝稷、毛竹、番茄、大豆、香蕉、蘋果、沙梨、西瓜、葡萄、牽牛花及雷蒙德氏棉等多種植物中鑒定出來［7］，對TIFY家族基因的功能分析也逐漸成為研究熱點。JAZ亞家族基因作為茉莉酸（JA）信號通路的負調控因子和激素網絡的調控樞紐，近年來對其功能的研究報道較多，且主要集中在調控植物抗逆反應。Meng等［8］研究發現，擬南芥JAZ7基因參與了植物的光合作用、氧化還原反應、氨基酸、植物激素和防御代謝物的調控，進而正向調節擬南芥的耐旱性。Ebel等［9］研究發現，小麥JAZ亞家族基因TdTIFY11a響應鹽脅迫誘導，過表達該基因后顯著降低了轉基因植株對干旱的敏感性。Zhu等［10］通過敲除2個JAZ亞家族基因AtTIFY10a和AtTIFY10b后顯著增強了植株對堿脅迫的敏感性，而過表達苜蓿JAZ亞家族基因GsTIFY10a后顯著增強了轉基因植株的耐堿性，推測TIFY10蛋白在植物對堿脅迫的響應中起正向調控的作用。Zhao等［11］過表達大豆GsJAZ2后，顯著降低了轉基因植株對堿脅迫的敏感性。Seo等［12］研究發現OsJAZ1通過調控JA信號通路繼而參與水稻的抗旱反應。Yang等［13］利用RT-qPCR分析了西瓜TIFY基因在不同脅迫下的表達模式，發現部分TIFY基因對不同脅迫均有所響應，其中ClJAZ1和ClJAZ7最為顯著。Zhang等［14］研究發現，玉米ZmJAZ響應莖腐病和炭疽病等真菌病害的誘導。Yu等［15］在擬南芥中過表達葡萄VvTIFY9后顯著增強了轉基因植株的白粉病抗性，且相關抗病基因的表達量顯著上調。劉嘉鵬等［16］利用RT-qPCR分析了香蕉JAZ亞家族基因MaTIFY9在不同脅迫誘導下的表達模式，發現該基因響應低溫、高溫、脫落酸（ABA）、水楊酸（SA）及枯萎病菌的誘導。

目前，對于TIFY、ZML和PPD亞家族基因功能的研究鮮見報道，對于TIFY亞家族基因參與棉花抗黃萎病反應的相關研究更是未見報道。

本研究通過前期轉錄組數據篩選得到一個響應黃萎病菌誘導表達的TIFY亞家族基因GhTIFY9，利用病毒誘導的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）技術對該基因在棉花抗黃萎病中的功能進行了初步探究，為進一步研究該基因的抗病分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為陸地棉遺傳標準系TM-1，種子由新疆農業大學農學院農業生物技術重點實驗室繁存；農桿菌菌株GV3101為新疆農業大學農學院農業生物技術重點實驗室保存；TRV病毒載體、陽性對照TRV：GhCLA1載體和大麗輪枝菌菌株V991（Verticillium dahliaKleb）均由新疆農業科學院黃全生研究員惠贈。EcoR I和KpnI等限制性內切酶均購于賽默飛（Thermo）世爾科技有限公司，FastPfu Fly DNA聚合酶、Trans-T1大腸桿菌感受態細胞、pEASY Blunt-Zero克隆載體、T4 DNA Ligase和DNA分子量Marker均購于北京全式金生物技術有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒和RNase A購于南京諾維贊生物科技有限公司，植物總RNA提取試劑盒購于杭州博日生物科技有限公司；熒光定量試劑盒和反轉錄試劑盒購于加拿大ABM生物科技有限公司；試驗所用卡那霉素、慶大霉素、MES、乙酰丁香酮、MgCl2及培養基配制等化學試劑均為國產分析純；PCR所用引物的合成和DNA測序均由上海杰李生物技術有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 棉花的培育及種植 選取經硫酸脫絨后大小一致且顆粒飽滿的種子，參照胡子曜等［17］方法進行培育及種植。

1.2.2 黃萎病菌的培養及誘導處理 參照Li等［18］方法將-80℃保存的大麗輪枝菌V991取出進行活化培養及接菌處理，對照組（MOCK）用Czapek’s培養基處理，分別在0、6、12、24、48和72 h取棉株根部組織；每個時間點均取3-4個生物學重復，取樣后立即置于液氮中速凍，后轉移至-80℃冰箱保存，用于后續試驗。

1.2.3 棉花總RNA的提取及cDNA的合成 參照植物總RNA提取試劑盒的說明書進行棉花根部樣品總RNA的提取，經1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性后，用反轉錄試劑盒合成cDNA。

1.2.4 棉花GhTIFY9的克隆及序列分析 通過轉錄組數據分析獲得GhTIFY9序列并在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫中進行檢索，獲得其登錄號：XM_016837092。根據該基因的ORF（open reading frame）序列設計引物GhTIFY9-F：5'-ATGTCGAGAGCTAGCGTCGA-3'和GhTIFY9-R：5'-CTAGCAAGCATATGGAGATGC-3'，參照胡子曜等［17］方法，以陸地棉TM-1的cDNA為模板，使用FastPfu Fly DNA聚合酶（北京，全式金）進行PCR擴增，擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收目的條帶，并連接pEASY Blunt-Zero克隆載體，轉化大腸桿菌Trans-T1感受態細胞，挑取陽性單克隆質粒進行測序。

使 用（http://web.expasy.org/protparam/）在 線程序計算GhTIFY9編碼蛋白質的理化參數；使用SignalP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）在線程序對該蛋白質進行信號肽預測分析；使用在線軟件TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預測其跨膜結構域；使用ProtComp-Version9.0（http://linux1.softberry.com/）在線軟件對該蛋白質的亞細胞定位進行分析；使用在線網站SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）對其蛋白結構域進行預測。

1.2.5 黃萎病菌誘導下GhTIFY9的表達模式分析 以反轉錄cDNA為模板，以棉花管家基因GhUBQ7［19］為內參基因，參照熒光定量試劑盒說明書（加拿大，ABM）進行RT-qPCR反應，每個樣本進行3個技術重復。內參基因GhUBQ7的引物序列為q-GhUBQ7-F：5'-GAAGGCATTCCACCTGACCAAC-3'，q-GhUBQ7-R：5'-CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG-3'；GhTIFY9的熒光定量引物序列為q-GhTIFY9-F：5'-CCGTTTTTAATGTACCTCGAG-3'，q-GhTIFY9-R：5'-TGTCGATCGCTAGGAGGAC-3'。反應結束后，根據目的基因和內參基因Ct值，使用2-ΔΔCt方法［20］計算目的基因的表達量。

1.2.6GhTIFY9的VIGS載體構建 根據GhTIFY9的ORF（594 bp）序列，利用SGN-VIGS在線軟件設計抑制目的基因表達的靶序列（550 bp），手動設計特異性擴增引物并在其上、下游5'端分別加入EcoR I和KpnI的 酶 切 位 點（CM-GhTIFY9-F：5'-GAATTCCGTCGAGCTTGATTTCTTTG-3'，CM-GhTIFY9-R：5'-GGTACCCCTCTCTTTGCGCTTTTCC-3'），以cDNA為模板進行目標片段的PCR擴增，回收、檢驗、測序方法同1.2.4。將測序結果與目標序列完全匹配的質粒和VIGS載體TRV2用EcoR I和KpnI進行雙酶切并回收目的片段，用T4 DNA Ligase連接3-4 h后轉化大腸桿菌Trans-T1感受態細胞，用EcoR I和KpnI進行雙酶切鑒定，正確的質粒取10-15 μL使用凍融法轉化農桿菌GV3101感受態細胞，28℃倒置培養1-2 d，用于后續試驗。

1.2.7 農桿菌介導的VIGS侵染棉花及沉默效率檢測 將重組載體TRV:RNA1、TRV:RNA2、TRV:GhCLA1和TRV:GhTIFY9轉化農桿菌后，待棉苗生長至兩片子葉完全展開且真葉未露出時，選取生長較為一致的棉花幼苗，參照Li等［18］方法，進行菌體的活化、重懸及VIGS侵染棉花。將包含TRV:GhTIFY9和TRV:RNA1、TRV:GhCLA1和TRV:RNA1、TRV:RNA2和TRV:RNA1的 重 懸 菌 液所侵染的棉花植株分別作為試驗組及陽性、陰性對照。侵染大約3周后，當陽性對照植株的葉片出現明顯的白化表型時，對試驗組和陰性、陽性對照的第二片真葉及根部進行取樣，每個樣本3-4個技術重復。將所取樣本進行RNA提取及cDNA合成，利用RT-qPCR技術進行沉默效率檢測。陽性對照GhCLA1的熒光定量引物為q-GhCLA1-F：5'-GCCCTTTGTGCATCTTC-3'；q-GhCLA1-R：5'-CTCTAGGGGCATTGAAG-3'。

1.2.8 棉苗的接種處理 參照Li等［18］方法，選取生長狀況一致的GhTIFY9沉默植株和陰性對照植株進行黃萎病菌的接種處理。

1.2.9GhTIFY9的黃萎病抗性鑒定 在接種黃萎病菌15 d后拍照記錄GhTIFY9沉默植株和陰性對照植株的表型差異，并采用葉片分級法統計病情指數［18］，同時對GhTIFY9沉默植株和陰性對照植株進行剖稈檢測及莖段恢復培養試驗［21］。

2 結果

2.1 GhTIFY9的克隆與序列分析

以陸地棉TM-1的葉片cDNA為模板進行PCR擴增（圖1），大小符合預期，表明GhTIFY9基因的ORF序列克隆成功。利用在線軟件對GhTIFY9進行生物學分析（表1），GhTIFY9的ORF為594 bp，編碼197個氨基酸，相對分子質量為21.65 kD，脂肪系數為76.63，理論等電點為9.08，平均疏水性為負值，表明該蛋白為堿性、親水性蛋白；信號肽預測結果顯示GhTIFY9蛋白無信號肽；亞細胞定位預測結果顯示其定位于細胞核，符合轉錄因子的特征；跨膜結構域預測結果顯示該蛋白為非跨膜蛋白；蛋白結構域預測顯示，該蛋白只含有一個TIFY結構域（圖2），屬于TIFY亞家族。

圖2 GhTIFY9蛋白結構域預測Fig.2 Protein domain prediction of GhTIFY9

表1 GhTIFY9的生物信息學分析Table 1 Bioinformatics analysis of GhTIFY9

圖1 GhTIFY9的克隆Fig. 1 Cloning of GhTIFY9 gene

2.2 黃萎病菌誘導下GhTIFY9的表達模式分析

黃萎病菌誘導處理后（圖3），與對照組相比，GhTIFY9表達量在12和72 h顯著上調，在24和48 h顯著下調，6 h無明顯變化。表明GhTIFY9響應黃萎病菌誘導處理，可能在棉花抗黃萎病反應中發揮一定的作用。

圖3 黃萎病誘導下GhTIFY9的表達模式分析Fig.3 Analysis of the expression patterns of GhTIFY9 under the treatment of Verticillium dahliae

2.3 GhTIFY9的VIGS載體構建

利用PCR方法擴增抑制GhTIFY9表達的靶序列（CM-GhTIFY9），電泳檢測產物大小符合預期（圖4-A）。將產物進行回收、克隆并測序，所得結果與目標序列完全匹配。陽性質粒經EcoR I和KpnI酶切后與VIGS載體TRV2連接、轉化，并用上述2個酶進行雙酶切鑒定（圖4-B），結果呈2條帶（TRV:GhTIFY9），一條大于8 000 bp的載體條帶和大小為500-750 bp的目標條帶，表明GhTIFY9的VIGS載體構建成功。

圖4 GhTIFY9的VIGS載體構建Fig. 4 VIGS vector construction of GhTIFY9

2.4 GhTIFY9的沉默效率檢測

將TRV:GhTIFY9、TRV:GhCLA1和TRV:RNA2分別與TRV:RNA1混合，分別侵染棉花子葉。大約3周后進行表型觀察，與陰性對照TRV:00相比，陽性對照TRV:GhCLA1的葉片出現明顯的白化現象（圖5-A）；利用RT-qPCR技術檢測陽性對照GhCLA1和目的基因GhTIFY9在根部和真葉中的表達量，結果（圖5-B，C）顯示，與陰性對照相比，目的基因的表達量均顯著性下調表明VIGS沉默載體能夠在植株體內正常工作，成功獲得GhTIFY9的沉默植株。

圖5 GhTIFY9的沉默效率檢測Fig. 5 Silencing efficiency detection of GhTIFY9 gene

2.5 GhTIFY9沉默植株的黃萎病抗性鑒定

選取生長狀況一致的GhTIFY9沉默植株和TRV:00陰性對照植株進行黃萎病菌侵染處理，15 d后拍照記錄其表型差異并進行病情指數的統計及剖稈檢測和莖段恢復培養試驗。結果（圖6-A）顯示，GhTIFY9沉默棉株的葉片黃化和植株萎蔫程度高于陰性對照植株，與陰性對照植株相比其整體健康狀況更差；病情指數統計結果（圖6-B）顯示，GhTIFY9沉默植株病情指數顯著高于陰性對照植株；剖稈檢測結果（圖6-C）顯示，與陰性對照植株相比，GhTIFY9沉默植株莖稈的褐變程度更加嚴重；莖段恢復培養結果（圖6-D）顯示，與陰性對照植株相比，GhTIFY9沉默植株的莖段在培養基上長出的真菌菌絲數量更多。以上結果表明，GhTIFY9是棉花抗黃萎病反應的一個正調控因子，干涉GhTIFY9表達后顯著增強了棉花對黃萎病菌的敏感性。

圖6 GhTIFY9沉默植株的抗病性鑒定Fig. 6 Disease resistance identification of GhTIFY9 genesilenced plants

3 討論

我國作為棉花種植大國，超過40%的棉花正遭受著黃萎病菌的嚴重威脅，黃萎病菌通過根部侵染棉花，隨后蔓延至根皮層并侵入木質部導管，形成菌絲和分生孢子造成維管組織的功能損傷，導致棉花出現葉片萎蔫、變色、脫落甚至死亡，最終導致棉花產量大幅下降繼而造成嚴重的經濟損失［22］。為保護自身免受病原體的攻擊，植物已進化出一系列的防御機制，包括復雜的信號感知、轉導和交換；植物抗病反應是由一系列復雜的信號分子調控的信號轉導網絡，轉錄因子作為一種多功能蛋白，可以同時參與包括對脅迫信號的感知和相應基因的表達在內的多種信號途徑的調控，在信號轉導網絡中發揮著重要作用［23］。近年來，許多研究顯示，轉錄因子參與棉花抗黃萎病反應的相關調控，其調控方式及參與的調控機制也各不相同。Yu等［24］過表達棉花GhWRKY15后顯著增強了轉基因煙草的黃萎病抗性，推測該基因正向調控棉花抗黃萎病反應。Ma等［25］利用VIGS技術干涉BEL1-Like轉錄因子GhBLH7-D06表達后顯著降低了沉默植株對黃萎病菌的敏感性，同時沉默植株中木質素合成和JA信號通路基因表達顯著上調，表明該基因可能通過抑制木質素的生物合成和JA信號傳導途徑從而負調控棉花對黃萎病的抗性。Hu等［26］研究發現，GhWAKY1通過正向調控木質素的生物合成繼而增強了棉花對于黃萎病的抗性。而相反的是，Xiao等［27］研究發現GhMYB4下調木質素的生物合成卻正向調控棉花的黃萎病抗性，推測該基因還參與了別的抗病相關通路的調控，最終表現出的抗性是多種抗病途徑效果總和抵消后的結果。He等［28］過表達HD-ZIP轉錄因子GhHB12后抑制了JA響應基因GhJAZ2和GhPR3的表達，增強了棉花對大麗輪枝菌的敏感性。此外還有一些轉錄調控基因如GhMYB36［29］、GhWRKY70D13［30］、GhATAF1［31］、GhMYB108［32］、GbVIP1［33］、GbERF1［34］、GhWIN2［35］等通過調控不同的信號通路，參與了棉花對黃萎病的抗性反應。

TIFY家族是植物特有的一類轉錄因子，在植物的生長發育及抗逆反應中發揮著重要的調控作用。目前對于該家族基因在棉花抗病反應中的研究主要集中在JAZ亞家族基因，例如He等［36］研究發現，GhJAZ2通過負調控JA信號通路并抑制GhbHLH171的轉錄活性，在棉花抗病反應中扮演一個負調控因子。張祥瑞［37］利用VIGS技術結合過表達轉基因技術研究發現，GhJAZ4同樣參與JA信號通路的調控，繼而在棉花抗黃萎病反應中作為一個負調節因子。此外Song等［38］研究發現，BIN2可以與JAZ亞家族蛋白發生互作，繼而負調控棉花對大麗輪枝菌的防御反應。但目前對于TIFY亞家族基因參與棉花抗黃萎病反應的相關研究還未見報道。本研究通過前期轉錄組數據篩選并克隆出一個TIFY家族基因GhTIFY9。該基因的ORF長度為594 bp，編碼197個氨基酸，相對分子質量為21.65 kD，定位于細胞核，所編碼蛋白為堿性、親水性、非跨膜蛋白，只含有一個TIFY結構域，屬于TIFY亞家族。RT-qPCR分析表明該基因響應黃萎病菌誘導處理，推測其可能在棉花抗病反應中發揮一定的作用。利用VIGS技術抑制該基因表達后，沉默植株對黃萎病菌的抗性顯著降低，其病情指數顯著高于陰性對照植株。剖稈檢測實驗發現，與陰性對照植株相比，GhTIFY9沉默植株維管束的褐變程度更加嚴重。莖段恢復培養試驗結果顯示，GhTIFY9沉默植株莖段的真菌菌絲數量明顯多于陰性對照植株。以上結果初步表明GhTIFY9正向調控了棉花抗黃萎病反應，但該基因的抗病分子機制及可能參與的抗病信號通路仍需進一步探究。

4 結論

克隆獲得一個TIFY轉錄因子GhTIFY9，其ORF為594 bp，編碼197個氨基酸，相對分子質量為21.65 kD，定位于細胞核，編碼蛋白為堿性、親水性、非跨膜蛋白，屬于TIFY亞家族。抑制GhTIFY9的表達可以顯著降低棉花對黃萎病的抗性。