大豆孢囊線蟲侵染對(duì)乙烯合成及信號(hào)傳導(dǎo)基因表達(dá)調(diào)控的研究

郭賓會(huì) 宋麗

（1. 揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)科技發(fā)展研究院 教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009；2. 揚(yáng)州大學(xué)生命科學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，揚(yáng)州 225009）

大 豆 孢 囊 線 蟲（Heterodera glycines，soybean cyst nematode，SCN）是一種土傳的定居型內(nèi)寄生線蟲，在我國(guó)東北和黃淮海大豆產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，受害大豆一般減產(chǎn)30%-50%，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致絕產(chǎn)［1］。乙烯（ethylene）是植物的一種重要內(nèi)源激素，廣泛參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育及防御反應(yīng)［2-3］。研究表明線蟲危害能夠強(qiáng)烈誘導(dǎo)植物釋放乙烯［4］。根結(jié)線蟲（root-knot nematode，RKN）感染番茄期間乙烯合成增加，并且向根環(huán)境中添加乙烯會(huì)增加根上成熟的線蟲數(shù)量［5］；SCN侵染的根中乙烯合成水平略低，但是根尖中ACC的含量則較高［6］；使用乙烯合成抑制劑處理后的擬南芥或大豆的根均可顯著吸引更多的線蟲［7-8］；產(chǎn)生過(guò)量乙烯的擬南芥遺傳突變體對(duì)甜菜胞囊線蟲高度敏感［9-10］。此外，乙烯的響應(yīng)途徑也參與調(diào)控線蟲定殖，如ERF-E2基因（ethylene response factor gene）下調(diào)的番茄轉(zhuǎn)基因根的分泌物對(duì)南方根結(jié)線蟲的吸引力顯著增強(qiáng)［3］；在乙烯不敏感的擬南芥突變體根中甜菜胞囊線蟲定殖比野生型顯著減少［9-10］；對(duì)乙烯敏感性降低的大豆品系也顯著減少了SCN在根中的定殖。因此，乙烯的合成及信號(hào)傳導(dǎo)途徑在線蟲吸引過(guò)程中均發(fā)揮關(guān)鍵作用［11-12］。

近年來(lái)，諸多研究人員對(duì)SCN侵染后大豆根的基因表達(dá)變化進(jìn)行了深入研究。在大豆Williams82中接種SCN 3號(hào)生理小種8-16 d后，根中乙烯響應(yīng)普遍降低［13］。Tucker等［6］研究表明ACC合成酶（1-aminoacyclopropane 1-carboxylate synthase，ACS）基因的表達(dá)隨著侵染時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)量增加。Wan等［14］通過(guò)對(duì)比2個(gè)大豆抗性品種（PI 437654 and PI 567516C）接種大豆孢囊線蟲3 d和8 d后與未接種對(duì)比發(fā)現(xiàn)乙烯代謝相關(guān)的基因被顯著調(diào)控。此外，擬南芥接種甜菜胞囊線蟲J2幼蟲后24-48 h，EIN2基因先誘導(dǎo)后抑制［12］。乙烯響應(yīng)成分結(jié)合蛋白基因（ethylene-responsive element-binding protein）在SCN侵染大豆抗性品種過(guò)程中亦受到顯著誘導(dǎo)［15-16］。

ACS基因催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）生成氨基環(huán)丙烷羧酸（ACC）進(jìn)而合成乙烯，是乙烯合成途徑的重要限速酶［17］。ACS的活性調(diào)節(jié)主要包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白降解及磷酸化激活，其中轉(zhuǎn)錄調(diào)控是ACS普遍存在的調(diào)節(jié)方式之一。研究表明，生物脅迫及非生物脅迫均能夠廣泛誘導(dǎo)ACS基因表達(dá)［17］。乙烯受體EIN2（ethylene-in-sensitive，EIN）和轉(zhuǎn)錄因子EIN3是位于乙烯信號(hào)傳導(dǎo)途徑的下游重要組分，正調(diào)控乙烯應(yīng)答基因的表達(dá)［18］。

盡管乙烯合成及信號(hào)傳導(dǎo)途徑參與線蟲侵染及定殖在近年來(lái)取得了較多進(jìn)展，但至今為止，對(duì)于乙烯合成基因ACS及信號(hào)途徑EIN基因如何參與誘導(dǎo)大豆孢囊線蟲抗性的分子機(jī)理仍所知甚少，尤其是在大豆不同抗性品種中上述基因響應(yīng)孢囊線蟲侵染時(shí)表達(dá)水平有何不同尚無(wú)報(bào)道。本研究對(duì)8個(gè)大豆抗病材料和2個(gè)感病材料在SCN 3號(hào)生理小種侵染10 d后的乙烯相關(guān)基因（ACS和EIN基因家族）的表達(dá)水平與未接種材料進(jìn)行了比對(duì)，為進(jìn)一步了解大豆抗性品種的抗性分子機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究用到的大豆抗病品種為Forrest、Peking、PI 437654、PI 89772、PI 90763、PI88788、PI548316、PI567516C和PI 438489B，感病品種為Magellan和Essex。以上品種由美國(guó)密蘇里大學(xué)大豆研究室保存。材料種植在美國(guó)密蘇里大學(xué)（哥倫比亞校區(qū)）植物系溫室中。

1.2 方法

1.2.1 蟲卵采集及大豆胞囊線蟲卵懸液制備 將種植在溫室盤中（17 cm ×28 cm×17 cm）含有3號(hào)生理小種的病土中生長(zhǎng)1個(gè)月左右的感病品種Lee68從土中取出，通過(guò)高壓水槍沖洗根收集孢囊，依次在不同孔隙度（孔徑250、105、75和25 μm）的篩子上研磨，最終將胞囊破碎后釋放出來(lái)的卵沖洗入燒杯內(nèi)。終濃度為13%的蔗糖溶液密度梯度離心后收集蟲卵，取10 μL進(jìn)行梯度稀釋，然后在顯微鏡下計(jì)數(shù)蟲卵密度，備用接種。

1.2.2 大豆幼苗培養(yǎng)及接種 上述11個(gè)大豆品種材料首先在萌發(fā)紙袋中室溫萌發(fā)3-5 d，然后選取生長(zhǎng)一致的幼苗移至溫室盆中的無(wú)菌沙壤土中培養(yǎng)3 d。盆容量為8 L，將盆懸掛在控溫的水中，以保持土壤溫度約27℃。每盆插入25個(gè)管子（直徑約3 cm，長(zhǎng)25 cm），每管移栽一株大豆幼苗。在每個(gè)大豆主根附近打1個(gè)深度約15 cm的孔，將蟲卵懸浮液依次注入，每株接種蟲卵的個(gè)數(shù)約為2 000個(gè)。未接種材料注入等體積水作為對(duì)照。每個(gè)材料接種10棵，接種10 d后，連根挖出，用無(wú)菌水將5棵大豆的根快速清洗并擦干水分后置液氮中速凍，然后超低溫冰箱保存。未接種材料同時(shí)取材作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 染色觀察 大豆根用5.25%次氯酸鈉浸泡4 min后，用流動(dòng)的自來(lái)水沖洗干凈，然后置于0.37%酸性品紅溶液中染色，微波爐中煮沸約30 s，取出置于流動(dòng)的自來(lái)水下沖洗。將根置于甘油中保存和觀察。使用解剖顯微鏡觀察染色后的SCN幼蟲，以確保接種效率［19］。

1.2.4 RNA提取 冷凍樣品在液氮中用研缽和杵研磨成粉末。按照Qiagen 植物RNA提取試劑盒（Cat#74904）說(shuō)明書提取約200 mg的組織樣本中總RNA。所提取的總RNA進(jìn)一步用Qiagen無(wú)核糖核酸酶DNA酶試劑盒（Cat#79254）消化DNA。使用Nanodrop?1000分 光 光 度 計(jì) 定 量RNA（Thermo Scientific）。

1.2.5 熒光定量PCR 以提取的每個(gè)樣本的2 μg總RNA為 模 板，按 照Clontech反 轉(zhuǎn) 錄 試 劑盒（Cat#639549）說(shuō)明書合成cDNA。PCR反應(yīng)使用Thermo公 司 的Maxima SYBR Green/ROX qPCR（Cat#K0223）。擴(kuò)增程序如下：50℃ 2 min，95℃ 10 min，然后95℃ 15 s，60℃ 10 min，40個(gè)循環(huán)。以Actin（Glyma.18G290800）基因?yàn)閮?nèi)參基因。每個(gè)樣本有3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和2個(gè)技術(shù)重復(fù)。用2-（ΔΔct）法計(jì)算出各個(gè)基因在不同材料中的相對(duì)表達(dá)量。所有引物均采用Primer3在線程序設(shè)計(jì)（http://frodo.wi.mit.edu/primer3/）［20］。引物序列見(jiàn)表1。大豆EIN和ACS基因命名采用Arraes等［21］文章中的命名規(guī)則。

表1 乙烯相關(guān)基因及其RT-qPCR引物序列Table 1 Ethylene related genes and their RT-qPCR primer sequences

2 結(jié)果

2.1 大豆EIN和ACS家族的組織特異性表達(dá)分析

大豆基因組共編碼21個(gè)GmACS基因及11個(gè)GmEIN基因。為了確定大豆EIN和ACS基因家族在不同組織的表達(dá)譜，我們對(duì)Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因組織表達(dá)模式進(jìn)行了分析。結(jié)果如圖1所示，GmACS和GmEIN基因在大豆?fàn)I養(yǎng)和生殖生長(zhǎng)的不同組織中均有不同豐度的表達(dá)。在根和根毛中相對(duì)高表達(dá)的基因有GmACS#001、GmACS#005、G m A C S#0 0 6、G m A C S#0 0 7、G m A C S#0 1 0、GmACS#012、GmACS#015和GmACS#020， 其 中GmACS#015在葉組織中表達(dá)也較高。而GmEIN基因家族均無(wú)在根及根毛中有特異性高表達(dá)。

圖1 GmACS和GmEIN基因家族的組織表達(dá)模式Fig. 1 Tissue expression patterns of GmACS and GmEIN gene families

2.2 SCN接種后侵染效果

為監(jiān)測(cè)孢囊線蟲接種效果，我們對(duì)3號(hào)生理小種感病的大豆品種Magellan分別在接種2、4、6和8 d后的侵染情況進(jìn)行了觀察。如圖2所示，孢囊線蟲經(jīng)歷了從J2-J4期的發(fā)育（2-A-D），表明SCN侵染成功，而且侵染效率較高。圖2-E表明在單株不同的根中SCN侵染8 d后染色觀察，結(jié)果表明SCN在大豆根系中不同根中的侵染效率也是較高的，為后續(xù)RNA表達(dá)水平分析提供保障。

圖2 SCN（race 3）侵染大豆Magellan品種后根組織染色Fig.2 Root staining after SCN（race 3）infecting soybean Magellan variety

2.3 不同大豆品種中GmEIN基因在SCN侵染后的表達(dá)模式

我們根據(jù)GmEIN基因家族的相對(duì)表達(dá)水平及特異性組織表達(dá)模式，對(duì)其中6個(gè)基因進(jìn)行了SCN侵染前后的表達(dá)模式分析。如圖3所示，6個(gè)GmEINs基因在SCN侵染10 d后，表達(dá)變化水平較小，其中GmEIN#010和GmEIN#007在所有大豆品種中其表達(dá)水平均未受到顯著調(diào)控。此外，在非抗病性品種Magellan和Essex中，以及抗性品種Forrest、Peking、PI 88788、PI 548316、PI 567516C中，6個(gè)GmEINs的表達(dá)均未受到顯著調(diào)控。GmEIN#001、GmEIN#005、GmEIN#006和GmEIN#008的 表 達(dá) 在PI 438489B均受到SCN顯著上調(diào)上調(diào)幅度較小，約1.5-2.2倍 左 右。另 外，GmEIN#001、GmEIN#005和GmEIN#008的表達(dá)在PI 437654、PI 89772和PI 90763中亦均受到SCN顯著誘導(dǎo)。以上研究結(jié)果表明4個(gè)大豆抗性品種（PI 438489B、PI 437654、PI 89772和PI 90763）中乙烯的信號(hào)傳導(dǎo)在SCN侵染后得到一定程度加強(qiáng)，但是其他5個(gè)抗病品種中的表達(dá)與2個(gè)感病品種相似。

圖3 GmEIN基因在SCN侵染10 d后與未侵染對(duì)照的相對(duì)表達(dá)水平Fig.3 Relative expressions of GmEIN genes in SCN infected root 10 d after inoculation compared with uninfected control

2.4 不同大豆品種中GmACS基因在SCN侵染后的表達(dá)模式

選取9個(gè)GmACS基因進(jìn)行SCN侵染前后的表達(dá)模式分析。如圖4和5所示，乙烯合成相關(guān)基因ACS家族9個(gè)基因在SCN侵染10 d后，在抗病品種中表達(dá)水平受到了顯著調(diào)控（升高或抑制）。首先，PI 548316中有7個(gè)ACS基因（圖4-C、圖5-A-F）的表達(dá)被顯著上調(diào)，其表達(dá)水平可升高6-260倍，如升高幅度最大的是GmACS#009，較未接種對(duì)照升高了260倍左右。其次，在PI 437654和 PI 88788中，多個(gè)GmACS基因的表達(dá)受到顯著抑制。但是感病品種中，9個(gè)GmACS基因表達(dá)水平在侵染和未侵染植株中均無(wú)顯著性差異。有些品種中僅其中幾個(gè)基因受到顯著調(diào)控，例如在Forrest品種 中，GmACS#009、GmACS#018和GmACS#014的表達(dá)受到了SCN侵染的顯著上調(diào)（圖5-A-C）。在Peking品種中，GmACS#020的表達(dá)受到了SCN侵染的顯著上調(diào)（圖5-F），但是SCN侵染卻顯著下調(diào)了GmACS#007、GmACS#011和GmACS#015的表達(dá)（圖4-A-C）。上述結(jié)果表明乙烯的合成基因GmACS的表達(dá)在不同的抗性材料中受到了顯著的差異調(diào)控。

圖4 GmACS#007、GmACS#011和GmACS#015在SCN侵染10 d后與未侵染對(duì)照的相對(duì)表達(dá)水平Fig.4 Relative expressions of GmACS#007，GmACS#011and GmACS#015 in SCN infected root 10 d after inoculation compared with uninfected control

圖5 6個(gè)GmACS基因在SCN侵染10 d后與未侵染對(duì)照的相對(duì)表達(dá)水平Fig.5 Relative expressions of 6 GmACS genes in SCN infected root 10 d after inoculation compared with uninfected control

3 討論

大豆孢囊線蟲J2幼蟲通過(guò)口針侵入大豆根部，到達(dá)維管束后注入大量的分泌物溶解相鄰細(xì)胞的細(xì)胞壁，細(xì)胞壁溶解后原生質(zhì)體融合即形成合胞體（syncytia）。因此，合胞體是線蟲建立的多核取食位點(diǎn)來(lái)供其生長(zhǎng)發(fā)育，合胞體在形態(tài)和生理上的變化是大豆基因表達(dá)變化調(diào)控的直接結(jié)果［12，22］。Ithal等［23］通過(guò)顯微切割的方式對(duì)SCN侵染后大豆根中形成的合胞體的表達(dá)譜進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)乙烯相關(guān)基因（如ACO，EIL1和ERF）受到調(diào)控。在SCN幼蟲侵染及合胞體發(fā)育過(guò)程中，ACC氧化酶基因和ERF-TF基因的表達(dá)被顯著調(diào)控［24］。本研究表明GmEIN基因主要在PI 437654、PI 89772、PI90763和PI438489B中表達(dá)被上調(diào)，在其余抗病及感病品種中均無(wú)顯著變化。GmACS基因的表達(dá)調(diào)控分為兩種類型：Peking、PI 437654、PI88988和PI 89772中被顯著下調(diào)，而PI548316、PI567516C和PI438489B中的表達(dá)被顯著上調(diào)，感病材料中無(wú)顯著變化。由于本研究取材時(shí)間為SCN蟲卵接種10 d后，此時(shí)合胞體已經(jīng)形成，因此我們認(rèn)為GmEIN和GmACS基因在不同抗性品種中的表達(dá)變化不僅與合胞體的發(fā)育相關(guān)，也與品種之間抗病程度及機(jī)制不同相關(guān)。未來(lái)進(jìn)一步對(duì)合胞體中基因表達(dá)變化的深入解析將是挖掘SCN抗性機(jī)制的基礎(chǔ)。

研究人員通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)現(xiàn)乙烯合成或響應(yīng)基因的確參與植物抗病蟲性。Dahl等［4］發(fā)現(xiàn)下調(diào)煙草（N. attenuate）ACS基因的表達(dá)可減少蟲害誘導(dǎo)的乙烯釋放。過(guò)量表達(dá)ERF基因（RAP2.6）的轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)甜菜孢囊線蟲的抗性增強(qiáng)［25］。過(guò)量表達(dá)rF113（AtRAP2.6的同源基因）的轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)大豆疫霉病的抗性增強(qiáng)［26］。另一方面，擬南芥AtRAP2.6L基因突變體對(duì)丁香假單胞菌的防御反應(yīng)增強(qiáng)［27］。因此，乙烯的響應(yīng)及信號(hào)傳導(dǎo)在不同的植物品種及不同的抗病性中發(fā)揮復(fù)雜的調(diào)控功能。我國(guó)研究人員發(fā)現(xiàn)灰皮支黑豆（ZDD2315）是一個(gè)高抗SCN的大豆品種，在SCN 3號(hào)小種侵染后，與未接種對(duì)照相比，外源乙烯利施加降低灰皮支黑豆中SCN侵染率可達(dá)29.01%；而在敏感品種遼豆15中，乙烯利施加降低遼豆15中J2侵染率可達(dá)41.88%。因此，乙烯可能通過(guò)影響SCN幼體的感染率而發(fā)揮重要作用［16］。本研究中多個(gè)抗性品種的GmACS基因在SCN侵染后表達(dá)量受到大幅度調(diào)控，進(jìn)一步說(shuō)明乙烯的合成受到SCN侵染調(diào)控，而且這些GmACS基因可以作為提高大豆抗SCN育種的候選基因。但是有些抗性品種中未觀察到GmACS基因表達(dá)的顯著變化，說(shuō)明在大豆SCN抗性品種及其抗性機(jī)制上可以分為兩類，和乙烯合成相關(guān)或不相關(guān)。

目前我國(guó)報(bào)道的SCN生理小種已達(dá)11個(gè)，其中，1、3、4 號(hào)為主要致病小種且分布最廣，3 號(hào)生理小種的致病力強(qiáng)且分布較廣［28］。我國(guó)大豆品種資源豐富，篩選和利用抗性品種是控制大豆孢囊線蟲危害的最經(jīng)濟(jì)有效的方法。然而，大豆防御大豆孢囊線蟲的分子機(jī)制非常復(fù)雜，不僅涉及大豆品種，還有線蟲的不同生理小種。目前，育種學(xué)家已經(jīng)篩選出多個(gè)對(duì)抗不同生理小種的種質(zhì)資源，然而仍有較多抗性種質(zhì)資源的抗蟲分子機(jī)制尚不清楚［29］。盡管多個(gè)抗性品種中GmACS基因的表達(dá)上調(diào)，但是PI548316品種中多個(gè)GmACS基因的誘導(dǎo)表達(dá)水平非常高，原因可能是該品種在受到SCN侵染10 d后的時(shí)間點(diǎn)，乙烯的合成被大幅上調(diào)。其他抗性品種中可能也有如此高的誘導(dǎo)表達(dá)水平，但是由于和侵染時(shí)間相關(guān)性較強(qiáng)，本次研究可能未檢測(cè)到基因誘導(dǎo)峰值。其次，可能和不同的大豆孢囊線蟲生理小種侵染相關(guān)。后續(xù)我們將對(duì)不同抗性品種在不同生理小種侵染不同時(shí)間段后檢測(cè)ACS基因的表達(dá)水平，以期深入解析乙烯合成與孢囊線蟲侵染之間的關(guān)系。

4 結(jié)論

本研究對(duì)大豆乙烯合成及信號(hào)響應(yīng)基因在不同大豆材料（抗病或感病）中如何響應(yīng)SCN侵染進(jìn)行了表達(dá)水平的模式分析，研究結(jié)果表明乙烯合成基因GmACS在SCN侵染后的多個(gè)品種中的表達(dá)受到顯著調(diào)控。研究結(jié)果不僅有助于更好地了解大豆-孢囊線蟲互作，更為進(jìn)一步解析不同種質(zhì)資源中乙烯合成相關(guān)基因家族的響應(yīng)及調(diào)控模式提供線索，從而為深入揭示不同大豆材料抗SCN機(jī)理提供理論依據(jù)。

致謝

本研究得到美國(guó)密蘇里大學(xué)植物系Henry T.Nguyen教授的大力支持，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均在該實(shí)驗(yàn)室取得。