具有殺線活性馬尾松內(nèi)生細(xì)菌的篩選與鑒定

賀麗娜 馮源 石慧敏 葉建仁

（南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心 南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，南京 210037）

松材線蟲(chóng)病是一種毀滅性的森林病害，使我國(guó)松林資源遭到嚴(yán)重破壞［1］。目前我國(guó)對(duì)松材線蟲(chóng)的防治措施主要包括病害檢疫、疫情監(jiān)測(cè)、疫木除治、媒介昆蟲(chóng)防治以及樹(shù)干注射等［2］。目前盡管一些市售的殺線蟲(chóng)劑如阿維菌素和甲維鹽等化學(xué)樹(shù)干注射劑取得了顯著成效［3-6］，但仍然存在著對(duì)環(huán)境產(chǎn)生不利影響的因素。隨著人們環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)，利用生物防治來(lái)防控松材線蟲(chóng)病一直是研究和關(guān)注的方向。利用細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物來(lái)防治松材線蟲(chóng)病已有一些研究，據(jù)報(bào)道，生防細(xì)菌可以通過(guò)多種方式殺死松材線蟲(chóng)，例如產(chǎn)生毒素、分泌胞外蛋白酶消解線蟲(chóng)的體表組織以及干擾線蟲(chóng)行為等［7］。已報(bào)導(dǎo)的具有殺線功能的細(xì)菌主要包括芽孢桿菌、假單胞菌、沙雷氏菌、腸桿菌和放線菌等，其中研究較多的是芽孢桿菌和假單胞菌［8］。

植物內(nèi)生細(xì)菌普遍存在于植物的各個(gè)器官中，與寄主植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中建立了和諧聯(lián)合關(guān)系，是植物微生態(tài)系統(tǒng)中巨大而寶貴的資源庫(kù)［9］。研究表明，植物內(nèi)生細(xì)菌具有豐富的種群多樣性，對(duì)寄主植物具有內(nèi)生固氮、促生、抗病蟲(chóng)害、殺線蟲(chóng)等多種生物學(xué)作用［10］。由于植物內(nèi)生細(xì)菌定殖在寄主植物體內(nèi)，占據(jù)比較穩(wěn)定的生態(tài)位，大量研究表明內(nèi)生細(xì)菌在定殖后可以通過(guò)誘導(dǎo)植物抗性從而抵抗外界不良環(huán)境的影響［11-13］，因此篩選和利用內(nèi)生細(xì)菌將成為生物防治的熱點(diǎn)。對(duì)于松樹(shù)內(nèi)生細(xì)菌，袁文婷［14］首次對(duì)馬尾松和黑松的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離，共分離得到39株內(nèi)生細(xì)菌，為松樹(shù)內(nèi)生細(xì)菌的研究提供了參考。朱麗梅等［15］從馬尾松樹(shù)體上分離出一株對(duì)松樹(shù)線蟲(chóng)具有顯著毒殺活性的解淀粉芽孢桿菌。李亮亮等［16］從松樹(shù)體內(nèi)篩選得到兩株具有殺線功能的內(nèi)生細(xì)菌，分別是短小芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌。彭雙［17］從6種不同植物內(nèi)篩選得到4株高活性殺線菌株，并能夠在黃瓜體內(nèi)定殖。Ponpandian等［18］報(bào)道了松樹(shù)內(nèi)生細(xì)菌寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas）和芽孢桿菌（Bacillussp.）對(duì)松材線蟲(chóng)的活性有抑制作用。

由于內(nèi)生細(xì)菌能夠定殖在植物內(nèi)部，因此從寄主植物本身篩選具有殺線功能的內(nèi)生細(xì)菌也更具有生防意義。本研究以前期從南京中山陵健康馬尾松上分離的58株內(nèi)生細(xì)菌為研究對(duì)象，通過(guò)浸漬法對(duì)分離的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行殺線活性的測(cè)定，以期篩選出具有高效殺線活性的內(nèi)生細(xì)菌，豐富拮抗松材線蟲(chóng)的細(xì)菌資源，為開(kāi)發(fā)生防菌劑防治松材線蟲(chóng)病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 內(nèi)生細(xì)菌來(lái)源 前期從南京中山陵健康馬尾松莖部一共分離得到了58株內(nèi)生細(xì)菌，現(xiàn)保存在南京林業(yè)大學(xué)森林病理實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 松材線蟲(chóng)來(lái)源 所用松材線蟲(chóng)為南京林業(yè)大學(xué)森林病理實(shí)驗(yàn)室保存的強(qiáng)毒力蟲(chóng)株AMA3。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基（NA）、牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基（NB）、LB液體培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生細(xì)菌的活化 用接種針挑取保存的內(nèi)生細(xì)菌菌液，在LB固體培養(yǎng)基上劃線，待菌落長(zhǎng)出后，挑取單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，28℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h進(jìn)行菌株的活化。

1.2.2 松材線蟲(chóng)的培養(yǎng) 將灰葡萄孢菌接種到PDA培養(yǎng)基上，待灰葡萄孢長(zhǎng)滿平皿后，在超凈工作臺(tái)上接種松材線蟲(chóng)。待松材線蟲(chóng)取食完灰葡萄孢，用貝爾曼漏斗法收集松材線蟲(chóng)液。將收集得到的松材線蟲(chóng)液經(jīng)3 500 r/min，5 min離心，倒掉上清液，用無(wú)菌水反復(fù)清洗3次。將洗凈的松材線蟲(chóng)懸液濃度配制為5 000條/mL線蟲(chóng)懸液，備用。

1.2.3 細(xì)菌發(fā)酵濾液的制備 將活化后的馬尾松內(nèi)生細(xì)菌以1%的比例轉(zhuǎn)接到50 mL的NB液體培養(yǎng)基中28℃，200 r/min搖培3 d，將菌液經(jīng)8 000 r/min離心5 min，得到的上清液用0.22 μm的濾膜過(guò)濾，得到細(xì)菌發(fā)酵濾液，置于-20℃冰箱中，備用。

1.2.4 具有高效殺線活性的內(nèi)生細(xì)菌的篩選 采用浸漬法測(cè)定分離出的細(xì)菌培養(yǎng)濾液殺松材線蟲(chóng)的活性。分別將500 μL細(xì)菌發(fā)酵濾液與500 μL（約2 500 條）的松材線蟲(chóng)懸液加入2 mL離心管中輕輕振蕩混勻，放置線蟲(chóng)培養(yǎng)箱（25℃，避光）中培養(yǎng)。以不接菌的NB液體培養(yǎng)基作為對(duì)照。每一處理重復(fù)3次，分別在24 h、48 h時(shí)測(cè)定殺線能力。在顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)加有各不同細(xì)菌菌株培養(yǎng)濾液的處理中松材線蟲(chóng)的總數(shù)和死亡數(shù)量，計(jì)算死亡率和校正死亡率，依次比較各細(xì)菌菌株發(fā)酵濾液的殺線活性。統(tǒng)計(jì)時(shí)，先對(duì)離心管中的線蟲(chóng)液進(jìn)行振蕩，吸取20 μL的線蟲(chóng)混合液后放在載玻片上靜置5 min，避免線蟲(chóng)假死對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響。線蟲(chóng)的死亡標(biāo)準(zhǔn)為身體僵直，用針戳線蟲(chóng)沒(méi)有反應(yīng)。

進(jìn)一步對(duì)篩選出的NZM13-11菌株的發(fā)酵濾液按照0（原液）、2、4、6、8倍稀釋?zhuān)蔑@微鏡觀察在12、24、36以及48 h松材線蟲(chóng)的死亡情況和消解情況，計(jì)算校正死亡率和消解率。測(cè)定方法同上。

線蟲(chóng)的死亡率、校正死亡率和消解率計(jì)算公式［19］：

死亡率（%）=線蟲(chóng)死亡數(shù)/線蟲(chóng)總數(shù)×100%

校正死亡率（%）=（處理死亡率-空白對(duì)照死亡率）/（100-空白對(duì)照死亡率）×100%

消解率（%）=線蟲(chóng)消解數(shù)/線蟲(chóng)總數(shù)×100%

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 采用Origin和 WPS 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)圖表處理，用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.6 具有高效殺線活性的內(nèi)生細(xì)菌的鑒定

1.2.6.1 菌落形態(tài)特征描述 將篩選出來(lái)的具有殺松材線蟲(chóng)活性的菌株接種于NA培養(yǎng)基在30℃恒溫條件下培養(yǎng) 24 h，觀察生長(zhǎng)出來(lái)的菌落的外形特征、顏色、大小、邊緣狀況、透明度等培養(yǎng)特征，并對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色和生長(zhǎng)曲線等的測(cè)定。

1.2.6.2 生理生化特征的測(cè)定 根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》（東秀珠等主編）［20］和《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》［21］進(jìn)行了接觸酶試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、VP試驗(yàn)（乙酰甲基甲醇）、淀粉水解試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、亞硝酸鹽還原試驗(yàn)、反硝化試驗(yàn)、明膠水解試驗(yàn)以及精氨酸雙水解酶試驗(yàn)對(duì)菌株進(jìn)行常規(guī)生理生化特性的鑒定。

1.2.6.3 分子鑒定 參照已報(bào)道的文獻(xiàn)［22］提取細(xì)菌的基因組DNA，以基因組DNA為模板，利用細(xì)菌16S rDNA通用引物（上游引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，下 游 引 物1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72℃修復(fù)延伸10 min。將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至上海生工公司完成測(cè)序。根據(jù)測(cè)序得到的DNA序列在Ezbiocloud網(wǎng)站上進(jìn)行16S rDNA分析。篩選出同源性較高的16S rDNA 的基因序列作為參比對(duì)象，對(duì)克隆片段進(jìn)行序列分析，使用Bioedit和MEGA X軟件對(duì)序列進(jìn)行多序列比對(duì)和編輯后，采用Neighbor-joining（N-J）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 具有高效殺線活性的內(nèi)生細(xì)菌的篩選

對(duì)內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵濾液殺線活性進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細(xì)菌菌株都有一定的殺線作用，從58株內(nèi)生細(xì)菌中篩選出19株內(nèi)生細(xì)菌的殺線活性較強(qiáng)，校正死亡率均在80%以上。編號(hào)為NZM13-11的內(nèi)生細(xì)菌的殺線能力最強(qiáng)，并且能夠使松材線蟲(chóng)蟲(chóng)體發(fā)生消解，具有進(jìn)一步的研究?jī)r(jià)值。通過(guò)對(duì)菌株NZM13-11的進(jìn)一步研究，由表1可知，該菌株在12 h時(shí)原液處理對(duì)線蟲(chóng)的死亡率可達(dá)到92.2%，并且對(duì)松材線蟲(chóng)的蟲(chóng)體有消解作用，消解率達(dá)到85%。在處理36 h后，線蟲(chóng)的校正死亡率達(dá)到100%，消解率達(dá)到90%，在處理48 h后，線蟲(chóng)體壁被完全消解，顯微鏡視野內(nèi)已觀察不到完整的線蟲(chóng)蟲(chóng)體。

表1 菌株NZM13-11對(duì)松材線蟲(chóng)的殺線活性Table 1 Nematicidal activities of the strain NZM13-11 against B. xylophilus

通過(guò)對(duì)菌株NZM13-11發(fā)酵濾液稀釋?zhuān)鐖D1所示，在處理36 h后測(cè)定發(fā)現(xiàn)，在2倍稀釋下，線蟲(chóng)的校正死亡率依然高達(dá)100%，并且消解率高達(dá)88%。在4倍、6倍和8倍稀釋下，線蟲(chóng)的校正死亡率分別為92.5%、84.3%和72.9%，在4倍稀釋下對(duì)線蟲(chóng)依然有較高的消解，消解率為83.1%。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，死亡率逐漸升高，在36 h后達(dá)到100%。隨著稀釋倍數(shù)的增加，死亡率和消解率均有所降低，但是在稀釋8倍，處理36 h后，線蟲(chóng)的校正死亡率依然達(dá)到72.9%。通過(guò)在顯微鏡下觀察被菌株NZM13-11發(fā)酵濾液處理后的松材線蟲(chóng)，蟲(chóng)體消解，表現(xiàn)為蟲(chóng)體內(nèi)形成空泡，內(nèi)含物外滲，身體斷裂，如圖2所示。說(shuō)明菌株NZM13-11的發(fā)酵濾液中可能含有某些能夠降解線蟲(chóng)體壁的物質(zhì)。

圖1 不同稀釋倍數(shù)下菌株NZM13-11的殺線活性Fig.1 Nematicidal activities of the strain NZM13-11 against B. xylophilus under different dilution times

圖2 NZM 13-11菌株發(fā)酵濾液處理松材線蟲(chóng)后的蟲(chóng)體形態(tài)觀察Fig.2 Morphological observation of B.xylophilus treated with fermentation filtrate of NZM 13-11 strain

2.2 菌株NZM13-11的種類(lèi)鑒定

2.2.1 形態(tài)觀察 如圖3所示，菌株NZM13-11在LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落顏色為黃綠色，菌落的性狀為圓形、橢圓形，大小不一，邊緣不整齊，菌落隆起程度不一，菌落光滑濕潤(rùn)且常呈融合狀態(tài)。革蘭氏染色結(jié)果顯示該菌株為革蘭氏陰性菌，菌體為桿狀。菌株NZM13-11的生長(zhǎng)曲線如圖4所示，在2 h開(kāi)始指數(shù)增長(zhǎng)，在24 h后開(kāi)始趨于穩(wěn)定。

圖3 菌株NZM13-11的菌落形態(tài)（A）和革蘭氏染色（B）Fig. 3 Colony morphology of strain NZM13-11（A）and Gram staining（B）

圖4 菌株NZM13-11的生長(zhǎng)曲線Fig.4 Growth curve of strain NZM13-11

2.2.2 生理生化鑒定 NZM13-11生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知該菌能夠利用葡萄糖和果糖，氧化酶、接觸酶陽(yáng)性，是好氧型細(xì)菌，硝酸鹽還原和亞硝酸鹽還原反應(yīng)為陽(yáng)性，能夠水解明膠，不能夠水解淀粉，具有精氨酸雙水解酶活性。

表2 菌株NZM13-11的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain NZM13-11

2.2.3 菌株NZM13-11的16S rDNA測(cè)序結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建 以菌株NZM13-11的基因組DNA為模板，擴(kuò)增16S rDNA序列，將提取的NZM13-11的16S rDNA序列送至上海生工進(jìn)行序列測(cè)定，菌株NZM13-11的16S rDNA序列總長(zhǎng)1 401 bp。菌株NZM13-11的基因組DNA的電泳結(jié)果和16S rDNA的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖5所示。

圖5 菌株NZM13-11的基因組DNA（A）以及16S rDNA的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果（B）Fig.5 Electrophoresis results of genomic DNA（A）and16S rDNA PCR products（B）of strain NZM13-11

將內(nèi)生細(xì)菌NZM13-11的16S rDNA序列與EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)，采用MEGA X進(jìn)行同源性分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖6所示，由系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可以看出菌株NZM13-11與Pseudomonas aeruginosa（銅綠假單胞菌）在同一個(gè)遺傳分支上。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，菌株NZM13-11與Pseudomonas aeruginosastrain DSM 50071和Pseudomonas aeruginosaJCM 5962表現(xiàn)出98%的相似性。

圖6 基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的菌株NZM13-11的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 6 Phylogenetic tree of strain NZM13-11 based on 16S rDNA gene sequence

結(jié)合菌落形態(tài)特征和生理生化特征，將NZM13-11鑒定為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。

3 討論

銅綠假單胞菌作為假單胞菌屬的一種模式菌株，常常也被稱(chēng)為綠膿桿菌，同時(shí)也是臨床上三大條件性致病細(xì)菌之一，在自然界中存在廣泛。近年來(lái)，具有生防作用的銅綠假單胞菌逐漸被鑒定和分離。銅綠假單胞菌能夠分泌多種次級(jí)代謝產(chǎn)物，研究表明這些次級(jí)代謝產(chǎn)物，比如吩嗪類(lèi)抗生素、生長(zhǎng)素、鐵載體等［23］可以拮抗多種植物病原菌，因此成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的一種重要的生防菌株。近年來(lái)，研究人員分離篩選出很多具有生防作用的銅綠假單胞菌應(yīng)用于多種植物病害中。其中，肖咪云等［24-25］從植物根中分離得到的一株銅綠假單胞菌2016NX1對(duì)玉米大斑病菌、甘蔗鳳梨病菌、貢柑鏈格孢菌、辣椒炭疽病菌、水稻胡麻葉斑病菌等多種不同植物病原真菌的生長(zhǎng)具有抑制作用。王雪潔等［26］從健康葡萄植株中分離得到157株內(nèi)生細(xì)菌，并篩選出一株對(duì)葡萄霜霉病菌具有防治效果的一株銅綠假單胞菌，并且該菌株對(duì)10種供試病原真菌均具有不錯(cuò)的抑制作用。Bakthavatchalu［27］從根際土壤中分離到一株銅綠假單胞菌FP6，經(jīng)研究該菌株產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)立枯病絲核菌和炭疽菌具有廣譜抗真菌活性，能夠使這兩種病原真菌的菌絲出現(xiàn)畸形現(xiàn)象。這些研究表明，銅綠假單胞菌在植物病害的生物防治方面具有很好的應(yīng)用價(jià)值。目前利用銅綠假單胞菌來(lái)防治松材線蟲(chóng)病鮮有報(bào)道，牟亞妮等［28］從松墨天牛的蟲(chóng)尸中分離到一株銅綠假單胞菌BRCCXG5，結(jié)果表明對(duì)松墨天牛表現(xiàn)出殺蟲(chóng)活性。范津［29］對(duì)銅綠假單胞菌中毒性蛋白進(jìn)行南方根結(jié)線蟲(chóng)殺蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌中毒性物質(zhì)不僅對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)具有殺蟲(chóng)活性，對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)同樣具有毒性作用。

松材線蟲(chóng)病對(duì)松林資源造成的嚴(yán)重威脅至今仍然無(wú)法對(duì)其進(jìn)行有效的控制，研究表明，許多生防細(xì)菌產(chǎn)生的一些代謝物質(zhì)對(duì)松材線蟲(chóng)表現(xiàn)出強(qiáng)烈的殺線蟲(chóng)活性。除此之外，利用生防細(xì)菌來(lái)防治松材線蟲(chóng)有助于減少化學(xué)藥劑造成的環(huán)境污染，有助于保持生態(tài)系統(tǒng)的平衡。目前對(duì)于細(xì)菌是如何導(dǎo)致松材線蟲(chóng)致死的機(jī)制尚不明確，主要是包括毒素致死，消解線蟲(chóng)體表組織以及干擾線蟲(chóng)行為模式等［7］。在嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌殺線蟲(chóng)活性的研究中，從細(xì)菌濾液中提取的胞外蛋白酶能夠破壞線蟲(chóng)的表皮組織，使其逐漸裂解消失，體內(nèi)細(xì)胞逐漸形成空泡，最終使蟲(chóng)體基本裂解消失［30］。本研究從馬尾松內(nèi)生細(xì)菌篩選出一株內(nèi)生銅綠假單胞菌，首次證明了銅綠假單胞菌對(duì)松材線蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性，并且能夠使松材線蟲(chóng)的體表發(fā)生消解，消解率在48 h達(dá)到100%。在顯微鏡下觀察到，在12 h時(shí)松材線蟲(chóng)體表已經(jīng)出現(xiàn)消解，主要表現(xiàn)為線蟲(chóng)體壁不完整，內(nèi)含物外滲，松材線蟲(chóng)體內(nèi)出現(xiàn)空泡，在48 h時(shí)，線蟲(chóng)的體壁被完全分解，顯微鏡視野內(nèi)沒(méi)有觀察到完整的蟲(chóng)體。由于松材線蟲(chóng)的體壁主要是由蛋白質(zhì)構(gòu)成，因此細(xì)菌產(chǎn)生的蛋白酶能夠分解松材線蟲(chóng)的體壁，造成內(nèi)含物外滲，最終殺死松材線蟲(chóng)［31］。目前銅綠假單胞菌對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)毒性作用的研究較為深入，主要是由于銅綠假單胞菌能夠產(chǎn)生一些毒性次級(jí)代謝產(chǎn)物比如蛋白酶、吩嗪、氰化物等從而起到毒殺的作用［32］。結(jié)合前人研究猜想銅綠假單胞菌可能是因?yàn)榉置诘牡鞍酌笇?duì)線蟲(chóng)起到消解的作用，但由于微生物侵染松材線蟲(chóng)是一種復(fù)雜的過(guò)程，可能是一些其他毒力因子共同起作用從而起到殺蟲(chóng)的作用。因此對(duì)于具體是哪種物質(zhì)起殺線作用還有待于進(jìn)一步研究。由于銅綠假單胞菌的次生代謝產(chǎn)物豐富［33］，后續(xù)也可以通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基條件來(lái)提高次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而提高其殺線能力。

從銅綠假單胞菌的安全性考慮，本研究篩選出來(lái)的殺線菌株與Pseudomonas aeruginosaJCM 5962和Pseudomonas aeruginosastrain DSM 50071在同一個(gè)遺傳分支上，研究表明，Pseudomonas aeruginosaJCM 5962是從甘蔗地的土壤中篩選出來(lái)的一株高脂溶性的能夠產(chǎn)生生物表面活性銅綠假單胞菌［34］，Pseudomonas aeruginosastrain DSM 50071是從油田土壤中篩選出來(lái)的石油降解菌［35］，它們都屬于非致病性的銅綠假單胞菌。本研究從松材線蟲(chóng)寄主本身篩選出具有高效殺線活性的內(nèi)生銅綠假單胞菌，并發(fā)現(xiàn)該菌株的發(fā)酵濾液對(duì)松材線蟲(chóng)具有消解能力。為篩選具有殺線活性的內(nèi)生細(xì)菌提供了新的微生物資源，也為松材線蟲(chóng)病的生物防治提供了新思路。

4 結(jié)論

本研究以58株松樹(shù)內(nèi)生細(xì)菌為研究對(duì)象，測(cè)定了不同細(xì)菌菌株發(fā)酵濾液的殺線活力，其中NZM13-11的殺線活性最強(qiáng)，處理12 h、24 h和36 h的死亡率分別為92%、97%和100%，消解率為85%、86%和89%。在48 h線蟲(chóng)死亡率和消解率均達(dá)到100%，在48 h時(shí)，松材線蟲(chóng)的身體被完全消解，顯微鏡視野中不能觀察到完成的蟲(chóng)體。NZM13-11的發(fā)酵濾液主要通過(guò)消解松材線蟲(chóng)的體表，使線蟲(chóng)內(nèi)容物外泄，最終使松材線蟲(chóng)消解死亡。菌株NZM13-11為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。