不同樹齡桑根際土壤原生生物群落組成多樣性

王子夜 王志剛 閻愛華

（1. 河北農業大學林學院，保定 071000；2. 河北省林木種質資源和森林保護重點實驗室，保定 071000；3. 河北省城市森林健康技術創新中心，保定 071000）

原生動物種類繁多，廣泛存在于海洋、森林、農田等各生態系統，通過土壤初級生產、菌物捕食、動植物餌料和病原物等多層次作用調節土壤生產力，控制微生物群落組裝，影響植物生長，其種群落結構的變化往往會影響到土壤-植物系統微食物網及生態系統結構的變動，對于維持土壤能量養分循環的強度和穩定性尤其重要［1-3］。研究表明，溫度、地理環境、海拔、土壤性質甚至土壤大型動物都會對原生生物多樣性產生影響，而地上部植物功能類群主導了原生生物種群多樣性建成［4-5］。但當前土壤微生物組研究的重點集中在細菌、真菌和單類群原生生物類別的互作關系，探討完整的土壤原生生物組在土壤生態系統中的種群分布、關鍵功能的研究仍很缺乏［6-7］。

林木生長周期長，營林措施頻繁，為應對不同環境挑戰，發展出獨特的生理適應性與緩解策略，土壤作為生態環境的重要組成部分，了解原生生物群落在土壤中產生和維持的機制對于理解其生物功能，維持林木-土壤良性循環，促進林木生產力提高至關重要［8］。樹齡不僅影響樹體形態建成、營養獲取和免疫抗逆能力，還與土壤理化結構和和水肥營養狀況相關，隨著樹齡增長，林木共生體（symbiont）內生和外生真菌、細菌的種群和功能多樣性在時間空間都上都表現出差異［9-11］，但目前作為林木根際土壤微生態三級營養層次的關鍵環節，樹齡對土壤原生生物種群多樣性和群落構建的影響仍缺乏系統研究［12-13］。

桑（Morus albaL.）是中國傳統藥食兼用的資源植物，也被廣泛用于土壤生態修復，具有良好的生態效益和社會效益。河北省桑樹種植歷史悠久，東南部古桑樹群為研究桑土壤原生生物群落多樣性演化提供了寶貴的資源。本研究按照空間換時間法，以同時期同桑園同品種的根際土壤樣品替換傳統不同時間采集不同樹齡根際土壤樣品為試驗材料，通過Illumina高通量測序和生物信息學分析，探討古桑園不同樹齡桑（10a、80a和200a）根際土壤原生生物種類多樣性差異和功能類群演變，明確影響原生生物群落構建和穩定性的不同環境因子和生物因子，為進一步探討原生生物種群分化機制和生態服務功能提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗地概況 樣品采自河北農業大學營子定位站，地理位置坐標為116°2'5''E，37°54'13''N。屬暖溫帶濕潤大陸性季風氣候區，又屬冀南暖濕輕干旱區。年平均氣溫12.7℃，無霜期187 d，年均日照2.78 h，年均降水543 mm。土壤由古河流沖積形成，層理清晰，土層深厚，疏松涵潤，園區統一常規管理。

1.1.2 樣品的采集及處理 本研究以同桑園的幼齡樹（10a）、中齡樹（80a）和老齡樹（200a）根際土壤為材料，每株4個方位分別取樣10-30 cm土層根際土壤采集，先抖落不含根系的土壤，然后選取松散黏附在根系表面1-4 mm范圍內的土壤為根際土的土壤裝入無菌袋內，每株土樣充分混合為一個樣本［14］，取樣后樣品于-80℃的冷凍室中冷凍保存。10a和80a隨機取樣5 株，由于200a樹齡為珍稀古樹故僅取1 株，用于土壤原生生物高通量測序及土壤理化性質測定。

1.2 方法

1.2.1 土壤理化性質測定 有機質：以硫酸亞鐵為標準溶液，將容量法的滴定手段改為光度測定手段，進行土壤有機質585 nm處比色的測定［15］。

堿解氮：在擴散皿中，用堿性溶液水解土壤，使易水解態氮（潛在有效氮）堿解轉化為NH3，NH3擴散后為硼酸吸收。硼酸吸收液中的NH3再用標準酸滴定，然后計算土壤中速效氮的含量［14］。

速效磷、速效鉀、氯離子和鈉離子分別用鉬銻抗比色法測定、火焰光度法測定、硝酸銀滴定法和ICP-AES［16］。

全鹽含量采用電導法（LY/T 1251-1999）［17］。

pH值：稱土10 g，放入50 mL燒杯中，加入蒸餾水25 mL用攪拌器攪拌1 min，使土體充分散開，放置半小時然后用酸度計測定［15］。

1.2.2 土壤原生生物基因組DNA提取 基因組DNA提取方法參考Edwards等［18］。利用1%瓊脂糖凝膠檢測DNA的長度和完整性，利用NanoDrop檢測DNA的濃度和純度。

1.2.3 DNA擴增及測序 PCR擴增和高通量測序：通過Illumina MiSeq平臺，利用原生動物18S通用引物V9：上游引物序列1389F（5'-TTGTACACACCGCCC-3'）和下游引物序列1510R（5'-CCTTCYGCAGGTTCACCTAC-3'）進行序列測定，目的片段長度為120 bp［19］。PCR擴 增體系（20 μL）：5×FastPfu Buffer 2 μL，2.5 mmol/LdNTPs 2 μL，正 反 引 物（5 μmol/L）各0.8 μL，FastPfu Polymerase（2.5 U/μL）0.4 μL，BSA 0.2 μL，模板10 ng，加ddH2O補充至20 μL。反應程序為95℃預變性3 min后，第一輪擴增27個循環（95℃變性30 s，55℃復性30 s，72℃延伸45 s），最后72℃延伸10 min，第二輪擴展13個循環，其余條件均不變，10℃保溫。擴增后PCR產物使用濃度1.8%的瓊脂糖進行電泳檢測（北京博美富鑫科技有限公司）對完整性進行檢測。質檢合格樣本構建目標區域PCR體系，之后進行產物純化和PCR擴增，再進行切膠回收。對于構建好的文庫使用采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測序文庫（上海派森諾生物科技有限公司）。

1.2.4 數據分析 （1）基于有效數據進行OTUs（operational taxonomic units）聚類和物種分類分析，使用 Trimmomatic v0.33軟件，對測序得到的 Raw Reads進行過濾；利用cutadapt 1.9.1軟件進行引物序列的識別與去除，得到不包含引物序列的Clean Reads；使用Usearch v10軟件雙端序列拼接，通過overlap對每個樣品的Clean Reads 進行拼接，根據不同區域的長度范圍對拼接后數據進行長度過濾；利用 UCHIME v4.2軟件，鑒定并去除嵌合體序列，得到最終有效數據（effective reads）。并將OTU和物種注釋結合，人工剔除測序結果中植物、真菌和動物等序列，得到每個樣品中原生生物OTUs和物種注釋等基本分析結果。

（2）應用Mothur軟件對根際土壤中原生生物群落在各個分類水平上的豐度劃分alpha多樣性指數（Chao1、Shannon、Simpson 指數以及覆蓋度），beta多樣性通過主成分分析（principal component analysis，PCA）等統計分析，獲得群落樣本的分布特征［20］。

（3）采用Excel 2003進行數據處理，采用SPSS 17.0進行Duncan氏差異顯著性檢驗和Pearson相關性分析。計算原生生物與真菌、細菌（為本實驗室前期獲得數據，尚未公開發表）之間的Spearman等級相關系數，對其中rho>0.6且P<0.01的相關優勢屬構建關聯網絡，并導入Cytoscape（http://www.cytoscape.org/）軟件進行可視化［21］。

2 結果

2.1 多樣性分析

2.1.1 α多樣性分析 200 a原生動物獲得最多的有效序列數，但產生的OTUs最少。基于OTU數及相對豐度，結果表明果桑不同樹齡多樣性隨樹齡增大而降低，不同樹齡Shannon、和Chao1指數表明原生生物隨樹齡增大其多樣性和豐富度降低（表1）。

表1 土壤原生生物數據統計及alpha多樣性Table 1 Soil protist data statistics and alpha diversity

2.1.2 β多樣性分析 基于物種豐度進行主成分分析（principal component analysis，PCA），在OTU水平上對β多樣性進行評估，分析不同樣本組成結構的相似性和差異關系。基于Bray-Curtis距離算法，構建不同樹齡原生生物的層級聚類樹（圖1），各樣點聚集表明樹齡對原生生物群落β多樣性影響較小。

圖1 根際土壤原生生物主成分分析Fig. 1 Principal component analysis（PCA）of rhizosphere soil protist

2.2 門和屬水平土壤原生生物群落豐富度分析

不同樹齡根部土壤原生生物在門水平上Chlorophyta、Kinetoplastida、Bacillariophyta、Rotaliida、Oomycetes、Petalomonadida、Blastocystidae被 定 義為優勢門（平均相對豐度>1）。Bacillariophyta相對豐度隨樹齡的增大降低，綠藻門Chlorophyta、Petalomonadida和Blastocystidae相對豐度升高。由圖2可知原生生物群落優勢門種類基本一致，但它們相對豐度存在差異。

圖2 門水平物種統計圖Fig. 2 Statistics at phylum level

在屬水平上，各樹齡中Poteriospumella、Vermamoeba、Paracercomonas、吻滴蟲屬Rhynchomonas、Synura、Neobodo、Spumella、吻波豆蟲Rhynchobodo、卵囊藻Oocystis、Petalomonas、棘阿米巴屬Acanthamoeba和Blastocystis為優勢屬（平均相對豐度>1）（圖3）。10a中獨有屬18 個，80a獨有12 個，200a獨有2 個。利用單因素ANOVA檢驗發現在10a-80a、10a-200a和80a-200a中 相 對 豐 度 差 異顯著的屬分別為Paracercomonas、Petalomonas和Acanthamoeba、Rhynchomonas，結果表明土壤原生生物群落組成和相對豐度具有明顯樹齡變異（圖4）。

圖3 屬水平物種統計圖Fig. 3 Statistics at genus level

圖4 獨有和共有原生生物種類數Fig. 4 Number of unique and common protist species

2.3 基于影響群落組成土壤環境因素的分析

根據差異顯著分析結果表明：各樹齡速效鉀含量差異顯著，80a vs 200a間速效磷、氯離子含量差異顯著，pH值10a vs 80a差異極顯著，堿解氮含量、有機質含量、全鹽量和鈉離子隨樹齡變化不顯著（圖5）

圖5 土壤理化指標差異顯著性分析Fig. 5 Significance analysis of differences in soil physical and chemical indicators

根際土壤原生生物群落多樣性、豐富度（Chao指數、Simpson指數、Shannon指數）、均勻度與樹齡和氯離子含量極顯著負相關，Simpson指數與全鹽量顯著負相關，覆蓋度與樹齡、速效鉀和堿解氮含量顯著正相關；同時各多樣性指數與速效磷、有機質、鈉離子含量和pH值相關但不顯著（表2）。

表2 土壤理化性狀與土壤原生生物多樣性指數的相關性分析Table 2 Correlation analysis between soil physical and chemical properties and biodiversity indexes of soil protist

2.4 基于細菌、真菌的關聯分析

使用Mothur軟件對各樣本中原生生物與細菌、真菌在rho > 0.6且P值< 0.01相關的屬構建關聯網絡，結果表明關聯最多且互為共生關系的原生生物為破囊壺菌Aplanochytrium和微藻Chrysoxys（分別有22 個關聯屬），其次是Chlamydaster（19 個關聯屬）、鞭毛蟲Dimastigella（18 個關聯屬）和Goniomonas（17 個關聯屬）；與原生生物關聯最多的是Aplanochytrium（7 個關聯屬）；Chlamydaster、Chrysoxys、Dimastigella、Goniomonas、Rhogostoma、Rosculus和Uroleptus互為共生關系。絲壺菌屬Hyphochytrium與細菌關聯最多（4 個關聯屬），分別是動球菌屬Kineococcus、水生角質菌屬Pilimelia、Pseudorhodoferax和疣孢菌屬Verrucosispora。與真菌關聯最多（15 個關聯屬），分別是Flammulina、腹孢 菌 屬Gastrosporium、Genolevuria、Kalaharituber、Kondoa、Mycena、Perenniporia、 紅 酵 母 屬Rhodotorula、莢 孢 腔 菌 屬Sporormia、匍 柄 霉屬Stemphylium、Termitomyces、Trichophaeopsis、Tuber、Xerochrysium。在 各 原 生 生 物 集 團 中 與大量子囊菌門、擔子菌門、球囊菌門等真菌共生。Aplanochytrium、Chlamydaster、Dimastigella、Goniomonas、Eocercomonas和絲壺菌屬僅存在于10齡根部土壤中，Chrysoxys僅存在于80 齡根部土壤中。Pervetustus與細菌Ramicandelaber為競爭關系，Pervetustus在10 齡到80 齡相對豐度上升到200 齡消失，而Ramicandelaber在10 齡到80 齡相對豐度降低，200 齡豐度上升（圖6）。

圖6 原生生物與真菌、細菌網絡關聯圖Fig. 6 Correlation diagram of protis，fungi and bacteria network

3 討論

原生生物對各種土壤-植物系統表現出積極的動態響應和生物地理屬性［22］，對森林、草原、稻田的研究都表明，植被類型與土壤理化性質對土壤生物區系的影響大于植被的豐富度，且與微生物群落組成具有很強的相關性［4，23］。Ceja等［24］對開關草（Panicum virgatum）的研究表明，隨著時間的推移，植物的生理學指標水平發生變化，而根際土壤原生動物多樣性減少。樹木生命周期長，個體空間更大，隨著時間積累，單個樹種對土壤中的許多生化和生態過程的驅動顯著強于多樹種，并且表現出樹種特異性［25］。前人研究表明全球不同生態區土壤內Cercozoa和Ciliophor等捕食者（consumers）原生生物類群占支配地位［26］，但時間因素是否驅動土壤原生生物種類多樣性和群落結構分化仍然未知。本研究利用空間換時間法從較長時間尺度上探討原生生物群落的結構和組成動態變化，發現土壤原生生物群落組成和相對豐度具有明顯樹齡變異，不同樹齡根際原生生物的α多樣性和群落結構存在明顯的差異，原生生物豐富度和多樣性隨樹齡增大降低。可能是桑生長盛期樹體營養充足，促進了原生生物的群落多樣性和豐富度的增長；幼樹期或老齡期競爭養分和自身代謝能力較低，限制原生生物的生長及繁殖從而使多樣性和豐富度較低。在門水平上，在對各樹齡種類基本一致，但相對豐度存在一定差異，隨樹齡增長，提高了綠藻門等光能營養型原生生物的相對豐度，降低了硅藻門Bacillariophyta的相對豐度。在屬水平上，隨樹齡的增加，差異種群減少，10a中獨有屬18 個，80a獨有12 個，200a獨有2 個，Petalomonas和Acanthamoeba等捕食者原生動物的種類多樣性和豐度變異增強。

研究發現土壤pH值是原生生物多樣性、群落結構和功能組成變化的驅動力，自養類原生生物在較低酸堿度條件下多樣性下降［27-28］。同時，原生生物是對施氮肥最敏感的微生物類群［29］，在堿性潮土中施肥可以顯著降低捕食性原生生物的相對豐 度［30］。本 研究10a根際土 壤pH值高于80a和200a，這與黃晶淼和王靜等對蘋果樹齡對土壤pH值的研究趨勢一致［31-32］，同時，速效鉀含量差異顯著，80a vs 200a間速效磷、氯離子含量差異顯著；氯離子含量顯著影響了原生生物群落多樣性，速效鉀和堿解氮含量的增長也顯著促進了群落覆蓋度的增大。速效鉀和氯離子可調節土壤酸度，也證實了非生物參數是原生生物群落重要性的決定因素［33-34］。同 時，10a vs 80a、10a vs 200a和80a vs 200a中相對豐度差異顯著的屬也分別為動物性或腐生性營養型（Consumer）的Paracercomonas、溝滴蟲屬Petalomonas和棘阿米巴屬Acanthamoeba、吻滴蟲屬Rhynchomonas，群落多樣性也隨樹齡增大降低。這可能是樹齡影響了土壤主要營養和理化指標，不同類群的原生生物對根際土壤酸堿度和營養狀況適應性不同，捕食者群體或許可以作為土壤狀況的指示性生物［5］。

在土壤微生物三級營養結構中，層次群落由自上而下（捕食者）和自下而上（營養）綜合效應決定［35］。原生動物作為土壤微生物組的中心樞紐，連接著不同的細菌和真菌種群，處于土壤微生態網絡對樹齡動態反應的關鍵位置，在土壤管理和調控細菌和真菌數量過程中發揮了杠桿作用［36-38］。例如異養型原生生物破囊壺菌Aplanochytrium和光能自養型卵囊菌屬Oocystis是各樹齡根際土壤中的優勢菌屬，他們與根際真菌、細菌和原生生物之間呈現出復雜的互作關系：破囊壺菌在和微藻Chrysoxys之間不僅存在共生關系，還共同與棘尾蟲屬Uroleptus等捕食性原生生物存在協同共生關系，與病原細菌氣單胞菌屬Aeromonas和大量植物病原真菌如假尾孢屬Pseudocercospora、新殼二孢Neoascochyta和絲核菌屬Rhizoctonia存在正向調控；而卵囊菌Oocystis則與老傘屬Gerronema、空團菌屬Cenococcum等植物菌根共生。原生生物通過直接取食病原體和通過捕食誘導細菌和真菌的分類和功能組成的變化來保護植物，控制微生物群落的多樣性和結構，從而促進植物生長［2，39-40］。例如近爪屬Parachela集團中與異常球菌屬Deinococcus、鐵銹菌Ferrovibrio和菌根菌膠膜菌屬Tulasnella、病原菌暗球腔菌屬Phaeosphaeria等11個真菌共生。異常球菌屬可提高鹽敏植物的抗旱能力和對鹽的耐受性，在一定程度上可提高樹體耐鹽堿能力，至于是否抑制或促進相關真菌的生長還未可知［41］。鐵銹菌可水解纖維素促進土壤中的能量流動以及氮、磷和硫的循環［42-44］。Pseudofulvimonas、四鞭毛蟲屬Tetramitus和Telaepolella集團與細菌Angustibacter和病原菌鏈蠕孢屬Dendryphion、菌屬Entyloma和叉絲殼屬Microsphaera等8屬真菌共生；絲壺菌屬和水生角質菌屬等4個細菌屬和犁頭霉屬Absidia等6個屬真菌共生，水生角質菌屬具有抗真菌活性［45］；其余各集團Globigerinita、尾滴蟲屬Cercomonas、吻滴蟲屬Rhynchomonas分別與鞘藻屬Microcoleus、甲基桿菌屬Methylibium和Methylacidiphilum共生，甲基桿菌屬細菌具有較高耐鹽、促生和抗菌性能，可促進桑的生長，抑制病蟲害發生［46］。原生生物與大量子囊菌門、擔子菌門、球囊菌門真菌，有益或潛在致病細菌共生，表明它們之間存在共同的環境偏好或潛在的生物相互作用，以互利共生的原則維持根際土壤微生態穩定。

4 結論

不同樹齡間優勢菌門一致但相對豐度存在差異，屬水平上種類組成及相對豐度均受到樹齡的影響。隨著樹齡的變化，樹體長勢和樹體吸收養分能力不同其生命活動也受到土壤理化指標的影響，其中氯離子含量和全鹽量可顯著影響原生生物群落多樣性、豐富度和均勻性，速效鉀和氯離子可顯著影響群落覆蓋度。在土壤微生物三級營養結構中，原生生物與真菌細菌構成不同的集團共生，表現出相同的環境偏好共同維持土壤微生物環境的平衡，為進一步探討原生生物種群分化機制和生態服務功能提供理論依據。