葡萄糖和丁酸鈉對CHO-rHSA工程細胞株中rHSA產(chǎn)量的影響

牛宇輝 李向茸 吳貝 李洪珊 李殿玉 陳磊 魏鎖成馮若飛

（1.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心 生物工程與技術(shù)國家民委重點實驗室，蘭州 730030；2.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730030）

人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）是一種在人體內(nèi)帶負電荷的由585個氨基酸組成的單鏈非糖基化的可溶性蛋白單體，分子量為66.5 kD［1］，為人血漿中含量最多、分子較小、溶解度大、功能較多的一種蛋白質(zhì)。HSA的三級結(jié)構(gòu)由Domain-I、Domain-II和Domain-III三個結(jié)構(gòu)域所構(gòu)成，每個結(jié)構(gòu)域均由2個含有4-6個α-螺旋的亞結(jié)構(gòu)域組成，6個亞結(jié)構(gòu)域聚合形成一個不中心對稱的心型分子結(jié)構(gòu)［2-3］。HSA在人體內(nèi)的主要作用是維持血漿膠體滲透壓及總蛋白水平，人血白蛋白制劑當(dāng)前廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)和生物制藥等領(lǐng)域，其中臨床上主要用于治療休克、水腫和作為血漿容量擴充劑等；生物制劑領(lǐng)域常常被用作疫苗保護劑和無血清培養(yǎng)基添加劑等［4-6］。目前我國商品化的HSA主要是從人血漿或胎盤血中通過低溫乙醇法或柱層析法進行提取制備的。其不足之處主要有兩點：（1）血漿來源有限，市場供應(yīng)緊張；（2）可能增加血源性傳染疾病的擴散，如艾滋病、肝炎［7-8］。與之相比，采用基因工程生產(chǎn)的重組人血清白蛋白（recombinant human serum albumin，rHSA）其優(yōu)點主要有生物活性與天然的HSA相同，還兼具可大規(guī)模生產(chǎn)，來源不易受病原體污染等多種優(yōu)點［9-11］，因此，rHSA市場蘊含著巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

葡萄糖作為哺乳動物細胞培養(yǎng)基中的重要的碳源物質(zhì)，在CHO細胞培養(yǎng)過程中通過添加葡萄糖可以顯著提高活細胞密度和外源蛋白表達量［12］。但葡萄糖會通過糖酵解代謝產(chǎn)生乳酸，乳酸又會通過影響pH進而影響細胞生長，故常見的CHO細胞無血清培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度一般控制在5.0-7.0 g/L左右。丁酸鹽作為一種小分子短鏈脂肪酸可以提高細胞中多種外源蛋白的表達量，如人促紅細胞生成素［13］、嵌合抗體等［14］，依據(jù)其脂肪酸特性還可誘導(dǎo)腸道抗菌肽的產(chǎn)生［15］。有研究表明，丁酸鈉可通過延緩細胞周期來提高外源蛋白表達量，但同時也抑制細胞生長［16-17］。本實驗以表達重組人血清白蛋白的CHO-rHSA工程細胞株為研究對象，考察培養(yǎng)過程中葡萄糖及丁酸鈉對rHSA產(chǎn)量的影響，并優(yōu)選出利于rHSA表達的最佳葡萄糖及丁酸鈉組合方案，為藥用輔料級及獸用生物制品中重組人血清白蛋白的工業(yè)生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗所用表達重組人血清白蛋白的全懸浮單克隆CHO工程細胞株CHO-rHSA由西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心提供。SFM4CHO培養(yǎng)基購自Cytiva（原Hyclone公司）；HRP標記的抗人血清白蛋白抗體（ab24438）及Human Albumin ELISA Ki（tab108788）購自Abcam公司；無水葡萄糖購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；丁酸鈉（NaBu）購自上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 葡萄糖對CHO-rHSA細胞生長及rHSA表達量的影響 復(fù)蘇1支CHO工程細胞株CHO-rHSA，迅速離心后棄去上清，將細胞加入至SFM4CHO培養(yǎng)基中，隨后置于37℃、5% CO2搖床中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120 r/min。待細胞狀態(tài)穩(wěn)定后，以0.5×106cells/mL的密度接種至125 mL搖瓶中，培養(yǎng)體積為50 mL，培養(yǎng)條件同上。之后從第4天開始每天測定其活細胞密度、細胞活力及培養(yǎng)基中的葡萄糖含量。待培養(yǎng)基中葡萄糖含量降低至2.0或3.0 g/L時，添加葡萄糖至終濃度為5.0或7.0 g/L，以不添加葡萄糖組作為對照，具體補糖策略見表1。直到培養(yǎng)第14天或細胞活力降至60%以下時收獲細胞懸浮液，離心后收集上清，采用Western Blot或ELISA檢測上清中rHSA的含量。

表1 不同的補糖策略Table 1 Different strategies for supplementing glucose

1.2.2 丁酸鈉對CHO-rHSA細胞生長及rHSA表達量的影響 將生長狀態(tài)良好的CHO-rHSA細胞以1.0×106cells/mL的密度傳代，培養(yǎng)體積為50 mL，置37℃、5% CO2搖床中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120 r/min。傳代時SFM4CHO培養(yǎng)基中加入不同濃度的丁酸鈉（1.0、2.0及3.0 mmol/L），以不添加丁酸鈉組作為對照。從第4天開始每天測定其活細胞密度、細胞活力及培養(yǎng)基中的葡萄糖含量，待培養(yǎng)至第14天或活力降至60%以下收獲細胞懸浮液，離心后收集上清，采用Western Blot及ELISA檢測上清中rHSA的含量。

1.2.3 葡萄糖及丁酸鈉組合使用對CHO-rHSA細胞生長及rHSA表達量的影響 為進一步驗證葡萄糖和丁酸鈉同時加入對rHSA表達量的影響，最大限度地提高工程細胞株CHO-rHSA生長密度及rHSA表達量。我們選擇1.2.1和1.2.2單因素實驗篩選出的葡萄糖添加策略同丁酸鈉濃度進行兩因素組合作用分析。將生長狀態(tài)良好的CHO-rHSA細胞以1.0×106cells/mL的密度傳代，培養(yǎng)體積為50 mL，置37℃、5% CO2搖床中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120 r/min。傳代時SFM4CHO培養(yǎng)基中分別加入兩種濃度的丁酸鈉，同時以篩選出兩種補糖策略進行補糖，以不添加丁酸鈉和葡萄糖組作為對照。從第4天開始每天測定其活細胞密度、細胞活力及培養(yǎng)基中的葡萄糖含量，待培養(yǎng)至第14天或活力降至60%以下時收獲細胞懸液，離心后收集上清，采用Western Blot及ELISA檢測上清中rHSA的含量。

1.2.4 不同時間段添加丁酸鈉對CHO-rHSA細胞生長及rHSA表達量的影響 為了進一步考察丁酸鈉加入時間對CHO-rHSA生長及rHSA表達量的影響，在細胞培養(yǎng)24 h、48 h和72 h分別加入1.2.3篩選出的最佳的丁酸鈉濃度和葡萄糖添加策略進行組合培養(yǎng)。將生長狀態(tài)良好的CHO-rHSA細胞以1.0×106cells/mL的密度傳代，培養(yǎng)體積為50 mL，置37℃、5% CO2搖床中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120 r/min。分別在24 h、48 h和72 h向培養(yǎng)基中加入1.2.3篩選出丁酸鈉濃度以及相應(yīng)補糖策略進行培養(yǎng)。從第4天開始每天測定其活細胞密度、細胞活力及培養(yǎng)基中的葡萄糖含量，待培養(yǎng)至第14天或活力降至60%以下時收獲細胞懸液，離心后收集上清，采用Western Blot及ELISA檢測上清中rHSA的含量。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPad Prism 8.0軟件作圖，利用單因素分析ANOVA或t檢驗法計算各組數(shù)據(jù)間顯著性差異。數(shù)據(jù)均以均值±標準差形式表示，P 值用星號表示，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001。

2 結(jié)果

2.1 不同補糖策略對CHO-rHSA細胞生長及rHSA表達量的影響

單因素試驗結(jié)果顯示，添加葡萄糖組工程細胞株CHO-rHSA的最高活細胞密度和rHSA表達量均高于對照組，且各補糖組細胞培養(yǎng)時間與對照組相比明顯延長（圖1-A和D），表明補糖對CHO-rHSA細胞生長和rHSA表達均具有一定的促進作用。而對照組細胞中的葡萄糖濃度從第4天開始持續(xù)降低，活細胞密度和活力在培養(yǎng)至第8天后急劇下降（圖1-A-C），這可能是由于培養(yǎng)基中的葡萄糖等營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡及代謝產(chǎn)物累積太多所致。不同補糖策略下CHO-rHSA細胞的活細胞密度與細胞活力相差不大（圖1-A和B），其中補糖方案為3.0→7.0 g/L時，rHSA表達量為36.467 mg/L，與對照組（rHSA表達量為16.432 mg/L）相比平均提高了121.93%（圖1-D）。綜合考慮，選擇補糖方案為3.0→5.0 g/L和3.0→7.0 g/L進行后續(xù)葡萄糖同丁酸鈉兩因素組合作用分析。

圖1 不同的補糖策略對CHO-rHSA細胞生長及rHSA產(chǎn)量的影響Fig.1 Effects of different glucose supplementation strategies on the growth of CHO-rHSA cells and the yield of rHSA

2.2 不同濃度丁酸鈉對CHO-rHSA細胞生長及rHSA表達量的影響

結(jié)合已有研究，本文選擇了1.0 mmol/L、2.0 mmol/L和3.0 mmol/L NaBu濃度來進行初篩，以選擇一個適宜的濃度來最大限度地提高rHSA的產(chǎn)量。結(jié)果顯示，加入不同濃度NaBu后工程細胞株CHO-rHSA的活細胞密度和細胞活力均低于對照組，且隨著NaBu濃度的增加，最大活細胞密度逐漸下降，說明高濃度的NaBu對CHO-rHSA細胞生長具有一定的抑制作用（圖2-A-C）。但3種濃度的NaBu均能顯著提高rHSA的表達（圖2-D-F），但因考慮到NaBu濃度為3.0 mmol/L時活細胞密度的下降尤為顯著，綜合考慮后選擇NaBu濃度為1.0 mmol/L和2.0 mmol/L進行接下來的兩因素組合試驗。

圖2 不同濃度丁酸鈉對CHO-rHSA細胞生長及rHSA產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of different concentrations of sodium butyrate on the growth of CHO-rHSA cells and the yield of rHSA

2.3 葡萄糖及丁酸鈉組合培養(yǎng)對CHO-rHSA細胞生長及rHSA表達量的影響

利用2.1和2.2單因素試驗篩選出的補糖方案（3.0→5.0 g/L和3.0→7.0 g/L）和NaBu濃度（1.0 mmol/L NaBu和2.0 mmol/L NaBu）進行兩因素組合分析，以驗證不同濃度的葡萄糖和丁酸鈉組合培養(yǎng)對CHO-rHSA細胞生長及rHSA表達的影響，確定最佳的培養(yǎng)方案，為后期補料及生物反應(yīng)器培養(yǎng)優(yōu)化夯實基礎(chǔ)。兩因素組合作用結(jié)果顯示，丁酸鈉和葡萄糖組合使用可使CHO-rHSA工程細胞株培養(yǎng)時間從7 d左右延長到14 d左右（圖3-A-C），并且顯著地提高rHSA表達（圖3-D-F）。說明不同的葡萄糖和丁酸鈉組合方案均能明顯延長CHO-rHSA細胞培養(yǎng)周期及提高rHSA表達量。綜合考慮活細胞密度和rHSA表達水平，選擇3.0→7.0 g/L的補糖方案與1.0 mmol/L NaBu濃度進行后續(xù)培養(yǎng)，但由于該組合培養(yǎng)中的最高活細胞密度僅達8.154×106cells/mL，遠遠低于對照組的最高活細胞密度10.783×106cells/mL（圖3-A），推測可能是由于添加丁酸鈉的時間不同所引起的，故接下來進行了不同時間段添加丁酸鈉及補糖實驗。

圖3 葡萄糖及丁酸鈉組合培養(yǎng)對CHO-rHSA細胞生長及rHSA產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of combined culture of glucose and sodium butyrate on the growth of CHO-rHSA cells and the yield of rHSA

2.4 不同時間段添加丁酸鈉對CHO-rHSA細胞生長及rHSA表達量的影響

為了進一步考察丁酸鈉加入時間對CHO-rHSA細胞生長及rHSA表達量的影響，在細胞培養(yǎng)24 h、48 h和72 h分別加入1.0 mmol/L丁酸鈉，同時選擇上述優(yōu)化得到的葡萄糖添加策略3.0→7.0 g/L進行組合培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)第24小時加入丁酸鈉細胞生長狀態(tài)最佳（圖4-A-C），最大活細胞密度與同期對照組相差無幾，可達10.213×106cells/mL，rHSA表達量為74.616 mg/L（圖4-F），比對照組平均提高了172.26%；但第48小時加入丁酸鈉CHO-rHSA細胞的最大活細胞密度僅為8.025×106cells/mL（圖4-A），但rHSA表達量是目前本工程細胞株能達到的最高表達量，為85.642 mg/L（圖4-D），比同期對照組平均提高了212.49%，比單獨添加葡萄糖平均提高了134.85%，比單獨添加丁酸鈉平均提高了88.35%。以上結(jié)果表明，丁酸鈉添加時間對提高rHSA表達量也顯得尤為重要。綜上，確定待細胞培養(yǎng)48 h 時添加1.0 mmol/L NaBu和補糖方案為3.0→7.0 g/L是利于CHO-rHSA工程細胞生長和rHSA表達的最佳條件，這為后期進一步優(yōu)化及生物反應(yīng)器培養(yǎng)提供數(shù)據(jù)支持。

圖4 不同時間段添加丁酸鈉對CHO-rHSA細胞生長及rHSA產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of adding time of sodium butyrate on the growth of CHO-rHSA cells and the yield of rHSA

3 討論

目前我國臨床使用的HSA 來源十分有限，HSA作為臨床醫(yī)學(xué)及生物制藥領(lǐng)域重要的藥物和原輔料，需求量逐年上升［7，18］。因此利用基因工程方法大規(guī)模生產(chǎn)rHSA即可解燃眉之急。由于研發(fā)成本過高，國內(nèi)大多數(shù)研究只限于實驗室水平，試制產(chǎn)品純度不高，華北制藥集團采用酵母表達人血清白蛋白取得了一定的進展，并開發(fā)了高鹽陽離子捕獲為特征的純化工藝，但酵母表達重組白蛋白在天然修飾方面始終劣于哺乳動物細胞表達［19-20］。而CHO細胞相對于酵母和大腸桿菌而言是很好的表達細胞系，其表達產(chǎn)物在分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和生物學(xué)功能等方面與天然蛋白更接近，重組乙肝疫苗、注射用重組人促紅細胞生成素等產(chǎn)品均利用CHO細胞表達平臺［21］。因此，用無血清懸浮的CHO細胞表達系統(tǒng)生產(chǎn)HSA相對于酵母菌和大腸桿菌等而言是更好的表達細胞系統(tǒng)，能夠準確的進行轉(zhuǎn)錄后修飾，天然修飾方面更具優(yōu)勢，同時還具有培養(yǎng)基化學(xué)組分明確、無血清成分、易于工業(yè)化放大等優(yōu)點，并且自身分泌的內(nèi)源性蛋白較少，更加有利于外源蛋白的分離純化，從而使CHO表達的rHSA更具市場潛力。

本文研究了在CHO-rHSA細胞培養(yǎng)過程中添加丁酸鈉及葡萄糖對rHSA產(chǎn)量的影響。單因素試驗結(jié)果表明，葡萄糖可明顯促進細胞生長，細胞培養(yǎng)第3天開始，每48 h添加終濃度為7 g/L的葡萄糖，可使rHSA產(chǎn)量顯著增加；同時發(fā)現(xiàn)細胞培養(yǎng)第48小時時加入終濃度為1.0 mmol/L的丁酸鈉對rHSA的表達量提高最為明顯。已有文獻表明，丁酸鈉對細胞生長有一定的抑制作用，會誘導(dǎo)細胞凋亡。但同時它也可促進與DNA結(jié)合的組蛋白的乙酰化功能從而具有顯著提高重組蛋白表達的能力［22-24］。本試驗通過添加葡萄糖來彌補丁酸鈉對細胞生長的毒副作用，葡萄糖又對細胞生長具有明顯的促進作用，最終提高重組蛋白產(chǎn)量。因此，探究丁酸鈉與葡萄糖之間平衡的點顯得尤為重要，同時丁酸鈉及葡萄糖在本試驗中對細胞作用的具體機制及作用比重仍有待研究。本研究采用葡萄糖和丁酸鈉聯(lián)合應(yīng)用可把CHO-rHSA工程細胞株培養(yǎng)時間從7 d左右延長到14 d左右。葡萄糖的加入明顯減弱了丁酸鈉對CHO-rHSA細胞生長的抑制作用，葡萄糖和丁酸鈉組合使用可更高效表達外源蛋白，與對照組相比表達量平均提高了212.49%。當(dāng)然接下來的生物反應(yīng)器還有一系列培養(yǎng)條件如pH、溶氧以及攪拌轉(zhuǎn)速等參數(shù)需要進一步優(yōu)化，因此對于工藝條件的不斷優(yōu)化是我們下一步探索的方向。

4 結(jié)論

本研究通過考察不同補糖策略、不同濃度丁酸鈉、葡萄糖及丁酸鈉組合培養(yǎng)與丁酸鈉的添加時間對CHO-rHSA細胞生長及rHSA產(chǎn)量的影響，確定待細胞培養(yǎng)48 h 時添加1.0 mmol/L NaBu和補糖方案為3.0→7.0 g/L是利于CHO-rHSA細胞生長及rHSA表達的最優(yōu)條件，為接下來的補料培養(yǎng)及生物反應(yīng)器培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。