肺炎支原體檢驗方法在醫學檢驗中的應用價值探析

肖遠

羅田縣人民醫院檢驗科，湖北黃岡 438600

呼吸系統類感染疾病是目前世界公認影響人類健康的主要疾病之一，據有關調查提示，全球每年死于呼吸系統感染疾病的人數占總死亡人數的1/3[1]。從臨床對引發肺炎的病原體調查情況來看，近幾年來以肺炎支原體（mycoplasma pneumoniae,MP）為代表的病原體其占據的位置越來越重要，也有報道指出MP就是導致社區獲得性肺炎的主要致病原[2]。人類本身就對MP具有易感性，因此MP在全球范圍內均有流行，因感染MP而發病的人數也有逐年升高趨勢，加上支原體肺炎臨床癥狀嚴重、診治困難等特點，因此成為目前臨床最為關注的公共衛生問題之一[3]。為了提高臨床對MP的檢出率，本文就LAMP、PCR兩種檢驗方法的應用價值展開研究分析，以2020年1月—2021年3月期間羅田縣人民醫院診治并確診為支原體肺炎的500例患者為例，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取到本院內兒科接受診治并確診為支原體肺炎的患者，其中男335例，女165例；年齡7～62歲，平均（28.6±7.4）歲。由本院相關專業護士采用一次性咽拭子采集管對所有患者的咽拭子標本進行采集，采集完畢后所有咽拭子標本均送入本院檢驗科保存于-80℃的冰箱內。由檢驗科人員將患者咽拭子標本中MP的DNA提取出，并對其進行LAMP、PCR檢驗。本次研究經本院倫理委員會批準，并取得患者及其家屬同意。

1.2 方法

所有患者的咽拭子標本均由專用的一次性咽拭子收集管進行收集，對患者的分泌物進行收集后將其置入2 mL的塑料離心管(eppendorf,EP)管內，隨即在其中加入300μl的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS），將溶液與患者分泌物進行漩渦處理（10 min），處理完成后取試管上清物300 μl備用[4]。首先對所有患者的咽拭子標本進行DNA提取，再將其裝入MP-DNA的專用試劑盒內，DNA提取步驟詳細操作如下所示。

利用提前準備好的GD緩沖液和PW緩沖液加入無水乙醇進行融合混合處理，然后在已經開始發生沉淀的液體中緩緩加入GA緩沖液，完畢后使用振蕩器將其充分震蕩直至徹底懸浮為止[5]。將之前與患者分泌物充分融合的PBS溶液拿出并取出其中經漩渦處理后懸浮的沉淀物1 mL，對這些沉淀物進行離心處理（1 000 rpm，1 min），注意取液時一定要盡量將上清液吸取干凈[6]。將蛋白酶K放入溫水中進行溫熱，時間為2 min，溫浴完畢后加入到之前放入EP管的分泌物中，加入量為20μl，并將蛋白酶K與其充分混合，直到完全均勻為止[7]。再向混合均勻的EP管內逐漸加入緩沖液GB，震蕩EP管20 s左右，然后將其放在47℃的環境內進行保存，放置時間為20 min左右，肉眼可見EP管內的溶液變得清亮即可，再將因離心操作而在管內壁上形成的水珠擦拭干凈[8]。將上一步得到了溶液全部注入吸附柱CB3中，對其進行離心處理（12 000 rpm，10 s），完成后將里面的廢液倒掉，最后再將其放入收集管內[9]。在試劑盒內的吸附柱CB3中加入緩沖液GD 500μl，再對其進行離心處理（12 000 rpm，30 s），結束后，倒掉其中的廢液，再將其放入收集管。將上步操作所得CB3內加入PW緩沖液700 μl，之后進行離心處理（12 000 rpm，30 s），倒掉廢液收回收集管。將上步所得CB3加入PW緩沖液500μl，離心處理（12 000 rpm，30 s），倒掉廢液放回收集管。將上一步所得CB3放回收集管后10 min左右，將產生的吸附材料全部清理掉，并將殘余的清洗液體晾干，再進行離心處理（12 000 rpm，10 min），處理完畢后將其中的廢液倒掉，打開吸附柱CB3的蓋子并將其放在室溫下靜置[10]。準備一個干凈的離心管，并將吸附柱CB3轉入其中，在其吸附膜的中間懸空位置滴入TE洗脫液（100μl），在室溫下靜置5 min，靜置完畢后進行離心處理（12 000 rpm，2 min），最后將所有離心處理后的溶液進行收集存放[11]。

兩種不同檢驗方法的具體實施內容如下：①PCR檢驗。在標本內加入純水至25 mL，PCR檢驗方法需要在94℃的高溫下進行預熱，再將溫度調至55℃進行退火，最后在68℃下進行延伸。將上述步驟循環30次，待標本充分反應后收集所得產物，對其實施瓊脂糖凝膠電泳（2%）[12]。為了保證PCR反應充分，本次研究中將退火溫度設置為55～58℃之間，以求標本可以在最適宜的退火溫度下進行。PCR檢驗所需藥品及用量：10*buffer（2.5 μl）、dNTP（2.0μl）、上引物（2.0μl）、下引物（1.0μl）、DNA模板（4.0μl）、酶（0.15μl）[13]。

②LAMP檢驗。以25 μl的總體積標本液對其進行加熱處理，加熱時間為2 min，此操作主要是為了讓MP的DNA充分解鏈，然后再將標本液置入冰水中進行浸泡，時間為3 min，隨即向其中加入8 U BstDNA聚合酶[14]。在62℃的恒溫環境下讓其進行充分反應（60 min），反應結束后再將溫度調整到80℃，并對其進行加熱處理（3 min），讓聚合酶徹底變性，對反應后剩余的產物進行觀察分析。為了優化LAMP反應，本次操作中設定了58℃、60℃、62℃以及64℃4個溫度梯度。LAMP反應所需藥品有AMpbuffer（2.5 μl）、dNTP（4 μl）、Mg2+（6 μl）、Betaine（4.5μl）、Loop（1μl）、LIP（1μl）、F3（1μl）、BIP（1μl）、B3（1μl）。

特異性檢測：為了保證本次實驗的特異性檢出準確度，在實驗完成后再選取院內其他幾種常見的呼吸道疾病致病原進行檢測，對其實施擴增反應，并利用瓊脂糖凝膠電泳（2%）進行鑒定，對最后的凝膠成像系統進行掃描并通過計算機掃描計算檢驗標本的片斷跑膠情況。

靈敏度檢測：選取同樣數量的陽性病例作為檢測的母本，并將咽拭子中的MP-DNA按上述方式提取出，利用分光光度對其進行檢測計算，得出該陽性模板的DNA濃度，再將其稀釋10倍，隨后進行瓊脂糖凝膠電泳（2%），觀察最后的跑膠結果，若在10-1、10-2、10-3各個梯度上都沒能夠對其進行擴增反應，那么即可判定其為該梯度上一級為LAMP反應的極限梯度。

1.3 統計方法

采用SPSS 21.0統計學軟件進行數據處理，計數資料以頻數或率（%）表示，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩種檢驗方式檢出陽性率對比

兩種檢驗方法的陽性檢出率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩種檢驗方法檢出陽性率情況對比

2.2 兩種檢驗方法特異性對比

對肺炎常見病原體（大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、糞腸桿菌、肺炎支原體等）DNA進行熒光PCR檢測。檢測結果見圖1，大腸埃希菌、銅綠假單胞菌及糞腸桿菌在0～100 min內均未發生顯著的熒光富集，這說明本方法在等溫條件下肺炎支原體的檢測特異性較高，可以進行推廣應用。見圖1。

圖1 兩種檢驗方法的特異性結果

2.3 兩種檢驗方法靈敏度對比

為了考察本檢測方法的靈敏度，將肺炎支原體DNA進行梯度稀釋。在10-1、10-2、10-3各個梯度1稀釋區間，產生擴增信號的時間隨著濃度降低逐漸推移，呈現很好變化趨勢。因此利用靶標濃度的負對數和其擴增熒光信號的Cq作一次函數，并得出其對應的數學函數公式為Cq=60147-6881gA（mol）（A表示檢測靶標的物質的量，R2=0.971 4），其線性范圍跨度3個數量級，檢測范圍寬。

3 討論

MP可在各個年齡段人群內發生感染，因此對于各個年齡階段的人群來說其都是一個非常重要的病原體，有大概率會引發人體發生嚴重的呼吸道疾病。據臨床有關調查數據顯示，社區獲得性肺炎中因MP所引起的支原體肺炎（mycoplasma pneumonia,MPP）占所有肺炎發病患者數量的20%～45%之間，且近年來此占比還有不斷上升的趨勢[15]。除了臨床常見的呼吸道感染疾病之外，人體感染MP之后可能還會進一步誘發人體的多個器官發生肺外并發癥，臨床中最常見的并發癥就有溶血性貧血、腎炎，癥狀嚴重且未能得到有效治療的患者還會有致死風險。MP的傳播途徑主要為口鼻飛沫，且兒童感染的概率會比青年人和老年人更大，且春夏秋冬都可發作，沒有地域性差異，以秋冬季節為主要發病時期，每3年左右就會流行一次[16]。MP好發于人口密集場所，比如學校、醫院等人口密集的場所發生MP感染的情況要明顯多于其他人口稀疏的場所。如果MPP早期未得到有效檢出，那么其除了可引發患者肺部損傷之外，還可能會繼發損害患者體內的其他系統，常見的受損系統有中樞神經系統、心血管系統以及血液系統[17]。

目前MP檢測的金標準為分離培養，MP分離培養雖然可以極大程度地檢測出MP，但培養的條件非常苛刻，且MP本身的生長速度緩慢，因此一般需要進行3 d左右的分離培養操作才能顯現出MP典型的菌落群形狀，因此并不適用于臨床快速檢驗MP。PCR和LAMP是目前臨床實驗室中較常見的檢驗方法，其中PCR研究發展最為成熟，通過合理設計引物進行PCR反應來判斷患者是否被MP感染，以此能有效地檢出MP，但PCR所需設備比較昂貴，對檢驗人員的技術要求也非常高，雖然其檢驗的準確性得到了廣泛認可，但卻并沒有得到推廣。LAMP是目前臨床新發展的一種檢驗方法，臨床有醫學研究對當地1 702例肺炎患者的數據進行分析，可見這些患者通過LAMP檢測的陽性率（91.37%）要高于通過PCR檢測的陽性率（79.53%）[18]。從本次研究的結果來看，LAMP檢驗陽性檢出率91.2%高于PCR檢驗陽性檢出率80.6%（P＜0.05），與其他臨床對LAMP和PCR檢驗方法的研究結果基本一致，LAMP只需要恒溫水浴鍋即可滿足檢驗要求，其反應產生物更是可以直接用肉眼觀察判斷，省去了PCR反應后還需要繼續進行跑膠的步驟，進一步加快了檢驗的速度。

綜上所述，本研究中，發現LAMP檢驗方法較PCR特異性、敏感度都更高，因此得出結論：LAMP檢驗方法檢測MP更加敏感，且其只需要進行很短的實驗時間，因此有較理想的發展應用前景。但不可忽視的是其反應所需溫度環境要求較高，因此還需要臨床不斷進行研究和探索，克服其存在的這些問題。