利用CRISPR/Cas9技術創制高效抗除草劑水稻

尹麗穎 張元野 李榮田,* 何明良 王芳權 許揚 劉欣欣 潘婷婷 田曉杰 卜慶云 李秀峰,*

利用CRISPR/Cas9技術創制高效抗除草劑水稻

尹麗穎1張元野1李榮田1,*何明良2王芳權3許揚3劉欣欣4潘婷婷5田曉杰2卜慶云2李秀峰2,*

（1黑龍江大學 生命科學學院，哈爾濱 150080；2中國科學院 東北地理與農業生態研究所，哈爾濱 150081；3江蘇省農業科學院 糧食作物研究所，南京 210014；4東北林業大學 生命科學學院，哈爾濱 150040；5黑龍江八一農墾大學 農學院，大慶 163319；*通信聯系人，email: lirongtian07@aliyun.com; email: lixiufeng@iga.ac.cn）

【目的】培育抗除草劑品種在水稻育種中具有重要意義。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術，以黑龍江優質粳稻品種為材料，編輯乙酰乳酸合酶基因，創制具有抗除草劑特性的水稻材料。【方法】利用CRISPR/Cas9技術，以乙酰乳酸合酶為靶基因，構建單堿基突變載體pH-nCas9-PBE-，以松粳22、龍粳46和綏粳18為轉化材料，利用農桿菌介導轉化獲得轉基因植株，通過對轉基因植株的突變位點進行測序結合除草劑噴施試驗，鑒定基因型及表型。【結果】經分子水平檢測驗證，獲得S627N突變植株10株，S627N且1884G-A但第628位氨基酸未改變突變植株1株，S627N/G628E突變植株1株。相較于野生型，以上三類突變植株均具有較強抗除草劑特性。【結論】利用CRISPR/Cas9基因編輯技術獲得具有抗除草劑特性，能夠穩定遺傳，不含轉基因標記的純合株系，可為抗除草劑水稻育種提供基礎材料。

水稻；乙酰乳酸合酶；抗除草劑；咪唑乙煙酸；CRISPR/Cas9；基因編輯

當前世界人口急劇增長，糧食不足成為制約人均生活水平的主要難題[1]。水稻作為主要糧食作物之一，稻田雜草泛濫是增產的重要限制因素，選育和創制抗除草劑品種具有很大的發展空間[2]。草害是影響水稻產量的重要因素之一，雜草與作物競爭水、陽光、土壤等生存資源的同時，抑制植株生長、結實，降低稻谷品質、產量，造成嚴重經濟損失[3]。隨著城鎮化速度的加快，傳統農業面臨極大挑戰，人工除草、機械除草、物理除草等因耗時費力逐漸被化學除草取代，化學除草現已成為控制草害的主要手段[4]。化學除草能夠有效減少作物產量損失、降低人力成本，然而化學除草劑在殺傷雜草的同時，也會對作物產生不良影響，造成水稻減量降低、稻米品質變差[5]，因而培育抗除草劑水稻品種尤為重要。

世界上第一種商品化轉基因水稻為抗除草劑水稻[6]。隨著技術發展，傳統育種技術已不能滿足現代需求。作為新一代的基因編輯技術，CRISPR/Cas9技術可進行定向基因編輯改造[7]，在作物育種改良中應用廣泛。在水稻育種研究中，該技術因簡單高效而被大量使用，已有研究利用該項技術改良水稻熟期[8]、香味[9]、直鏈淀粉含量[10]及粒型[11]等多個性狀。

不同的化學除草劑具有不同的殺草譜，化學除草劑與相應的抗除草劑水稻品種聯用控制草害效果較好[12]。目前抗除草劑類型有咪唑啉酮類、磺酰脲類、環己烯酮類、有機磷類、均三氮苯類和激素類等6大類[13]。咪唑啉酮類除草劑在實際生產中應用廣泛，包括咪唑煙酯、咪唑乙煙酸、咪唑喹啉酸、甲氧咪草煙、甲基咪草煙和咪草酸[14]。這是一類廣譜除草劑，通過與靶標酶乙酰乳酸合酶（acetolactate synthase，）結合[15]，抑制其活性，破壞植物體內纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的合成[16]，最終導致植物死亡，進而達到除草的目的。抗抑制劑水稻品種具有較大的研究價值，國外學者首先獲得了抗抑制劑水稻品種[17]。美國科學家通過抗性篩選選育出CL141 和 CL121兩個品種，已在2001獲得批準大量種植[18]，至2011年，抗抑制劑類水稻（抗咪草煙）已占美國水稻種植總數的50%[19]。研究顯示，至少有20個氨基酸突變位點導致植物對抑制劑類除草劑產生抗性[15]，在黃華占、華航31、金粳818、鎮稻18等水稻品種中，通過EMS誘變或自然變異均成功獲得了抗抑制劑類突變植株[21-24]。

隨著農業供給側改革的推進，黑龍江地區作物生產模式逐步向輕簡栽培發展，直播稻成為一種重要的發展方向，田間草害是直播稻發展的重要限制因子，除草劑成為現代農業中常用防治雜草的手段之一[25]。為進一步豐富黑龍江抗除草劑水稻種質，本研究利用CRISPR/Cas9技術，以黑龍江優質粳稻品種松粳22、龍粳46和綏粳18為研究材料，對基因進行單堿基編輯，以期基因第627位氨基酸由絲氨酸突變為天冬酰胺，從而使水稻材料具有除草劑抗性，為深入開展水稻抗除草劑育種奠定材料基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究以粳稻松粳22、龍粳46和綏粳18為試驗材料，獲得基因編輯植株，并在哈爾濱（北緯45°）種植，行株距為以25 cm×25 cm，自然長日照條件下生長。

試驗所用載體pZHW-OsU3和pH-nCas9-PBE為中國科學院遺傳與發育生物學研究所高彩霞研究組開發并擁有自主知識產權，由江蘇省農業科學院楊杰研究員惠贈。

1.2 CRISPR/Cas9靶點接頭設計及載體構建

通過NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得（LOC_Os02g30630）的基因序列，利用CRISPR-GE在線網站（http://skl.scau.edu.cn/），在第1外顯子（圖1）設計1對靶點接頭引物CAS9-ALS-LP/RP（表1），利用軟件“CRISPR Primer Designer”比對水稻全基因組序列，檢測靶點的特異性，排除潛在脫靶序列。

參照Li等[26]的方法進行載體構建，將連接好的載體通過熱激法轉入大腸桿菌TOP10中，菌液PCR檢測后，選取陽性菌落搖菌后提取質粒。利用測序公共引物M13-F對載體質粒進行PCR，對PCR產物進行測序，通過熱激法將檢測無誤的質粒轉入EHA105農桿菌感受態細胞中。

表1 本研究中所用的引物

1.3 T0代陽性植株的獲得

通過農桿菌介導法，將CRISPR/Cas9表達載體pH-nCas9-PBE-轉入松粳22、龍粳46和綏粳18的愈傷組織中，經過潮霉素篩選抗性愈傷組織，分化獲得T0代植株。將T0代植株種植于室外盆栽盒中，對每株T0代植株提取葉片的全基因組DNA，通過引物HPT-F/R(表1)進行PCR檢測，產物大小為900 bp的植株即陽性轉基因植株。同時，利用測序引物ALS-F/R(表1)進行PCR，將產物送吉林省庫美生物科技有限公司進行測序，將陽性轉基因植株種植于盆栽盒中，收獲種子用于下一代種植。

黑色序列為靶點序列，下劃線序列為PAM序列。

Fig. 1. Gene structure and target site of

1.4 T1代純合突變植株的篩選

在T0代收獲的種子中，挑選粒型飽滿的種子，室溫浸種1 d，37℃下催芽1 d，種植于室外盆栽盒中，在苗期提取T1代植株基因組DNA，利用潮霉素引物HPT-F/R鑒定，選擇不含有潮霉素標記的植株繼續加代。同時利用測序引物ALS- F/R(表1)進行PCR擴增，產物送吉林省庫美生物科技有限公司進行測序，挑選編輯成功且編輯位點純合的植物進行種植。

1.5 T2代植株性狀分析

依據測序結果，選擇T2代植株與野生型植株種植于室外盆栽場45 cm×85 cm盆栽盒中，于4葉期時，按照0.1 mL/m2噴施10%咪唑乙煙酸（山東先達農化股份有限公司，先達豆說好10%咪唑乙煙酸水劑）。3 d后觀察植株生長情況，對比T2代植株與野生型植株的抗藥性，15 d后統計成活率。

同時，將T2代植株與野生型植株分為三組種植于盆栽盒中，噴施農業中常用其他種類除草劑作耐藥性研究，包括甲嘧磺隆（江蘇瑞邦農藥廠有限公司，瑞邦綠無影75%甲嘧磺隆可濕性粉劑）、氯吡嘧磺隆（江蘇省農用激素工程技術研究中心有限公司，巨禾75%氯吡嘧磺隆水分散粒劑）和雙草醚（安徽藍田農業開發有限公司，藍田農美保10%雙草醚懸浮劑），待植株生長至4葉期，選用適當濃度噴施除草劑，3 d后觀察植株生長情況。

2 結果與分析

2.1 T0代轉基因陽性苗檢測

水稻基因編碼區序列全長為1935 bp，編碼644個氨基酸[27]。根據以往研究，在1880 bp處堿基G突變為A后，第627位氨基酸由絲氨酸突變為了天冬酰胺，能夠使植株獲得抗咪唑啉酮類抗性[28]，據此設計CRISPR/Cas9引物，并構建載體pH-nCas9-PBE-，利用農桿菌轉化法侵染松粳22、龍粳46和綏粳18的愈傷組織，獲得轉基因植株T0代，對獲得的21株轉基因植株進行潮霉素鑒定及測序。其中19株為陽性植株，2株為陰性植株，陽性率為90.5%（圖2）。對T0代植株進行測序發現（圖3），靶點附近出現較多套峰，編輯材料多為雜合，可在下一代植株進一步測序篩選。因環境因素導致部分T0代植株結實率低，最終收獲12株T0代植株的種子。

M―DM2000 DNA 標記; 1―陰性對照; 2―陽性對照; 3～23―T0代植株。

M, DM2000 DNA Marker; 1, Negative control; 2, Positive control; 3?23, T0generation plants.

圖2 T0代植株轉基因檢測

Fig. 2. Transgenic detection of T0generation plants.

圖3 T0代轉基因植株測序結果

Fig. 3. Sequencing results of T0generation transgenic plants.

2.2 T1代植株突變類型檢測

將T0代收獲的種子繼續種植，根據PCR檢測結果篩選出剔除潮霉素基因的植株種植到室外盆栽場，鑒定結果如圖4所示。

12水稻株系中，有10個株系（SJ22-1、SJ22-2、SJ22-3、SJ22-4、LJ46-1、LJ46-2、LJ46-4、SJ18-1、SJ18-2、SJ18-3）在1880 bp處堿基G突變為A，即627位氨基酸由絲氨酸突變為了天冬酰胺（S627N）。SJ18-4在1880 bp處堿基G突變為A的情況下第1884 bp處堿基G突變為A，但氨基酸沒有發生改變（S627N且1884G-A）。另外，LJ46-3除第1880 bp處堿基G突變為A外，在第1883―1884 bp處還存在堿基GG變為AA的突變，導致第628位甘氨酸變為谷氨酸（S627N/G628E）（圖5）。

2.3 T2代植株抗性分析

將T2代編輯植株與野生型松粳22、龍粳46和綏粳18種植在與盆栽場相同的環境中，生長40 d后，噴施10%的化學除草劑咪唑乙煙酸，3 d后觀察其生長情況。在噴施除草劑3 d后，野生型松粳22、龍粳46和綏粳18的各個株系均出現明顯的葉片干枯、黃化、生長停滯等現象（圖6），且在噴施咪唑乙煙酸后15 d內逐漸死亡（表2），而12種突變體在噴施除草劑15 d后仍能夠正常生長，葉片無干枯、黃化現象，具有很強的抗除草劑能力，且田間無雜草生長，證明基因編輯抗除草劑植株與相應化學除草劑聯用能夠充分解決草害問題。

圖4 T1代轉基因植株測序結果

Fig. 4. Sequencing results of T1generation transgenic plants.

為進一步研究編輯材料對除草劑的抗性，在農業生產中使用頻率較高的除草劑中，選擇三種除草劑（甲嘧磺隆、氯吡嘧磺隆、雙草醚）進行廣譜抗性研究。經梯度濃度噴施測試后，根據表型選擇合適濃度進行噴施，其結果如圖7。在氯吡嘧磺隆處理組中，噴藥3 d后，各編輯材料葉片微微變黃，但在后續觀察中發現，編輯材料生長良好，而野生型植株葉片發黃，干枯皺縮，逐漸死亡；在甲嘧磺隆處理組中，噴藥3 d后，植株生長情況與氯吡嘧磺隆組類似，在綏粳18背景的材料中，野生型葉片迅速發黃干枯，而編輯材料正常生長，葉片微微發黃；在雙草醚處理組中，噴藥2 d后，全部植株葉片發黃，3 d后，植株均出現較大程度的干枯皺縮，但相對于野生型，編輯材料生長能力較強。雖在不同除草劑處理情況下，各背景下的編輯材料表現出不同的抗性，但相較于野生型，表現出一定的抗性，證明本研究選用的三種材料，在對基因進行編輯過后，對其他類除草劑的抗性有所增強。

圖5 T1代轉基因植株氨基酸突變類型

Fig. 5. Amino acid mutation of the target gene of T1generation transgenic plants.

圖6 T2代除草劑抗性鑒定（標尺=10 cm）

Fig. 6. Herbicide resistance identification of T2generation (Bar=10 cm).

圖7 T2代農用除草劑抗性鑒定（標尺=10 cm）

Fig. 7. Resistance identification of T2generation to herbicides for agricultural use (Bar=10 cm).

3 討論

本研究利用CRISPR/Cas9技術，以黑龍江優質粳稻品種松粳22、龍粳46和綏粳18為研究材料，對基因進行定點突變，獲得具有良好除草劑抗性的水稻材料。相較于傳統育種技術，在育種速度及精度上有很大的提高，而且相較于誘變育種以及自然變異等需大量精力篩選材料的方法，CRISPR/Cas9技術存在極大的高效優勢。

表2 噴施除草劑咪唑乙煙酸后T2代植株存活率調查

CK―正常生長40 d的成苗數量; 3 d―噴施咪唑乙煙酸3 d后黃化苗數量; 15 d―噴施咪唑乙煙酸15 d后的成苗數量; 存活率―噴施咪唑乙煙酸存活率。

CK, Number of seedlings after 40 days of growth under normal conditions; 3 d, Number of etiolated seedlings 3 days after imidazole ethylnicotinic acid spraying; 15 d, Number of living seedlings 15 days after imidazole ethylnicotinic acid spraying; Survival rate, Survival rate of seedlings after imidazole ethylnicotinic acid spraying.

根據突變位點和類型的不同，植物基因突變后，可以分別獲得抗咪唑啉酮類、磺酸脲類和嘧啶硫代苯甲酸酯類等除草劑的能力，但單一位點突變后，往往只具有對一種類型除草劑的抗性[29]。在目前的水稻生產中，單一突變基因作物還未暴露出更大的缺陷，依然能夠應付一定劑量此類型除草劑，但是雜草存在產生除草劑抗性的可能，因而抗除草劑作物育種不能停滯。

在本研究中，除10個成功突變預期位點的株系外，還獲得了兩種不同類型的轉基因株系（SJ18-4、LJ46-3），SJ18-4的第1884 bp處堿基G突變為A，但氨基酸沒有發生改變。而LJ46-3第1883－1884 bp處堿基同樣發生了突變，堿基GG變為AA，導致第628位甘氨酸變為谷氨酸。在以往的研究中，有報道G628W的突變類型[30]，突變后具有抗咪唑啉酮類抗性。類似地，G628E突變后同樣具有抗咪唑啉酮類除草劑的能力，且627、628雙位點突變后，除草劑抗性能夠提升約30%[31]，具有S627N/G628E突變的LJ46-3株系，是否能夠獲得除抗咪唑啉酮類以外除草劑的抗性或更強的咪唑啉酮類抗性目前尚不清楚，根據測序結果僅LJ46-3為雜合植株，可在后續加代中獲得純合植株后繼續進行研究。在對其他三種除草劑的抗性研究中發現，在基因突變后，噴施超額劑量的除草劑后，LJ46-3植株能夠一定程度正常生長，證明對其他除草劑抗性也部分增強。本研究中獲得的雙位點突變材料LJ46-3，具有較強的除草劑抗性，有望進一步培育為優質抗除草劑材料。抗除草劑品種仍是育種者的目標，本研究可為抗除草劑的研究提供一定的數據參考。

[1] 徐振偉. 世界糧食危機與中國糧食安全[J]. 東北亞論壇, 2012(3): 30-37.

Xu Z W. World food crisis and food security of China[J]., 2012(3): 30-37. (in Chinese with English abstract)

[2] 張為農. 我國水稻除草劑的發展趨勢[J]. 營銷界(農資與市場), 2014(6): 84-86.

Zhang W N. Development trend of rice herbicide in China[J].), 2014(6): 84-86. (in Chinese with English abstract)

[3] Norsworthy J K, Scott R C, Bangarwa S K, Griffith G M, Wilson M J, Mccelland M. Weed management in a furrow-irrigated imidazolinone-resistant hybrid rice production system[J]., 2011, 25(1): 25-29.

[4] Kumar V, Bellinder R R, Gupta R K, Malik R K, Brainard D C. Role of herbicide-resistant rice in promoting resource conservation technologies in rice-wheat cropping systems of India: A review[J]., 2008, 27(3-5): 290-301.

[5] 李燕敏, 祁顯濤, 劉昌林, 劉方, 謝傳曉. 除草劑抗性農作物育種研究進展[J]. 作物雜志, 2017(2): 1-6.

Li Y M, Qi X T, Liu C L, Liu F, Xie C X. Progress of crop breeding on resistance to herbicides[J]., 2017(2): 1-6. (in Chinese with English abstract)

[6] 崔瑩. 新型轉基因抗除草劑水稻培育[D]. 武漢: 華中農業大學, 2017.

Cui Y. Developing novel transgenic herbicide-tolerant rice[D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University, 2017. (in Chinese with English abstract)

[7] Wang M G, Mao Y F, Lu Y M, Wang Z D, Tao X P, Zhu J K. Multiplex gene editing in rice with simplified CRISPR-Cpf1 and CRISPR-Cas9 systems[J]., 2018, 60(8): 626-631.

[8] Li X F, Zhou W J, Ren Y K, Tian X J, Lü T X, Wang Z Y, Fang J, Chu C C, Yang J, Bu Q Y. High-efficiency breeding of early-maturing rice cultivars via CRISPR/Cas9-mediated genome editing[J]., 2017, 44(3): 175-178.

[9] 周文甲, 田曉杰, 任月坤, 魏祥進, 高揚, 謝黎虹, 劉華招, 卜慶云, 李秀峰. 利用CRISPR/Cas9創造早熟香味水稻[J]. 土壤與作物, 2017, 6(2): 146-152.

Zhou W J, Tian X J, Ren Y K, Wei X J, Gao Y, Xie L H, Liu H Z, Bu Q Y, Li X F. Breeding of early-maturatity and fragrant rice via CRISPR/Cas9 mediated genome editing[J]., 2017, 6(2): 146-152. (in Chinese with English abstract)

[10] Xu Y, Lin Q, Li X, Wang F, Chen Z, Wang J, Li W, Fan F, Tao Y, Jiang Y. Fine-tuning the amylose content of rice by precise base editing of thegene[J]., 2021, 19(1): 11-13.

[11] 徐善斌, 鄭洪亮, 劉利鋒, 卜慶云, 李秀峰, 鄒德堂. 利用CRISPR/Cas9技術高效創制長粒香型水稻[J]. 中國水稻科學, 2020, 34(5): 406-412.

Xu S B, Zheng H L, Liu L F, Bu Q Y, Li X F, Zou D T. Improvement of grain shape and fragrance by using CRISPR/Cas9 system[J]., 2020, 34(5): 406-412. (in Chinese with English abstract)

[12] Antralina M, Istina I N, YuyunYuwariah, Simarmata T. Effect of difference weed control methods to yield of lowland rice in the SOBARI[J]., 2015, 3: 323-329.

[13] 蘇少泉. 抗咪唑啉酮類除草劑作物的發展與未來[J]. 現代農藥, 2006(1): 1-4.

Su S Q. The development and future of imidazolinone herbicide-resistant crops[J]., 2006(1): 1-4. (in Chinese with English abstract)

[14] Kiyoshi K, Koichiro K, Norihiko I, Tsutomu S, Atsunori F, Yoshiyuki T. A novel mutant acetolactate synthase gene from rice cells, which confers resistance to ALS-inhibiting herbicides[J]., 2007, 32(2): 89-98.

[15] 任洪雷. 乙酰乳酸合成酶及基因研究概述[J]. 中國農學通報, 2016, 32(26): 37-42.

Ren H L. Acetolactate synthase andgene research[J]., 2016, 32(26): 37-42. (in Chinese with English abstract)

[16] Endo M, Osakabe K, Ono K, Handa H, Toki S. Molecular breeding of a novel herbicide-tolerant rice by gene targeting[J]., 2007, 52(1): 157-166.

[17] Webster E P, Masson J A. Acetolactate synthase- inhibiting herbicides on imidazolinone-tolerant rice[J]., 2001, 49(5): 652-657.

[18] 范方軍, 王芳權, 李文奇, 王軍, 朱金燕, 許楊, 仲維功, 楊杰. 抗咪草煙水稻資源的篩選[J]. 中國稻米, 2018, 24(6): 108-109.

Fan F J, Wang F Q, Li W Q, Wang J, Zhu J Y, Xu Y, Zhong W G, Yang J. Screening of imazethapyr-resistant rice resources[J]., 2018, 24(6): 108-109. (in Chinese with English abstract)

[19] Xiao G Y, Chen F, Meng Q C, Zhou H, Deng L H, Weng L S. Ecological risk and management of herbicide-resistant transgenic rice() in China[J]., 2015, 23(1): 1-11.

[20] Boutsalis P, Karotam J, Powles S B. Molecular basis of resistance to acetolactate synthase-inhibiting herbicides inand[J]., 1999, 55(5): 507-516.

[21] 陳竹鋒, 王承旭, 柳威, 唐曉艷, 鄧興旺. 水稻抗除草劑蛋白及其在植物育種中的應用：CN102586215A[P]. 2012-07-18.

Chen Z F, Wang C X, Liu W, Tang X Y, Deng X W. Rice herbicide-resistant protein and its application in plant breeding: CN102586215A[P]. 2012-07-18.(in Chinese)

[22] 趙炳然, 袁定陽, 韶也, 毛畢剛, 袁智成, 胡遠藝, 彭彥, 羅武中. 一種水稻抗除草劑蛋白與基因及其應用：CN106867977A[P]. 2017-06-20.

Zhao B R, Yuan D Y, Shao Y, Mao B G, Yuan Z C, Hu Y Y, Peng Y, Luo W Z. Application of novel herbicide resistance proteins and genes in rice: CN106867977A[P]. 2017-06-20. (in Chinese with)

[23] 王芳權, 楊杰, 范方軍, 李文奇, 王軍, 許揚, 朱金燕, 費云燕, 仲維功. 水稻抗咪唑啉酮類除草劑基因功能標記的開發與應用[J]. 作物學報, 2018, 44(3): 324-331.

Wang F Q, Yang J, Fan F J, Li W Q, Wang J, Xu Y, Zhu J Y, Fei Y Y, Zhong W G. Development and application of the functional marker for imidazolinone herbicides resistantgene in rice[J]., 2018, 44(3): 324-331. (in Chinese with English abstract)

[24] 張保龍, 王金彥, 陳天子, 凌溪鐵. 粳稻的突變型基因及其蛋白和應用: CN106868028A[P]. 2017-06-20.

Zhang B L, Wang J Y, Chen T Z, Ling X T. Application ofmutant gene and protein inrice: CN106868028A[P]. 2017-06-20. (in Chinese)

[25] 張喜娟, 來永才, 王俊河, 孟英, 唐傲, 董文軍, 冷春旭. 黑龍江省直播稻的發展現狀與對策[J]. 黑龍江農業科學, 2015(8): 142-145.

Zhang X J, Lai Y C, Wang J H, Meng Y, Tang A, Dong W J, Leng C X. Development situation and countermeasures of rice direct seeding cultivation in Heilongjiang Province[J]., 2015(8): 142-145. (in Chinese)

[26] Li H, Li X F, Xu Y, Liu H L, He M L, Tian X J, Wang Z Y, Wu X J, Bu Q Y, Yang J. High-efficiency reduction of rice amylose content via CRISPR/Cas9-mediated base editing[J]., 2020, 27(6): 445-448.

[27] 宋貴生, 馮德江, 魏曉麗, 唐家斌, 朱禎. 水稻乙酰乳酸合成酶基因的克隆和功能分析[J]. 中國農業科技導報, 2007(3): 66-72.

Song G S, Feng D J, Wei X L, Tang J B, Zhu Z. Isolation and functional analysis of rice acetolactate-synthase (ALS)[J]., 2007(3): 66-72. (in Chinese with English abstract)

[28] 畢俊國, 譚金松, 劉毅, 張安寧, 王飛名, 劉國蘭, 余新橋, 羅利軍. 抗咪唑啉酮類除草劑水稻種質的篩選鑒定[J]. 植物遺傳資源學報, 2020, 21(4): 804-808.

Bi J G, Tan J S, Liu Y, Zhang A N, Wang F M, Liu G L, Yu X Q, Luo L J. Screening and identification of rice germplasm resistant to imidazolinone herbicide[J]., 2020, 21(4): 804-808. (in Chinese with English abstract)

[29] 陳天子, 余月, 凌溪鐵, 張保龍. EMS誘變水稻創制抗咪唑啉酮除草劑種質[J]. 核農學報, 2021, 35(2): 253-261.

Chen T Z, Yu Y, Ling X T, Zhang B L. Screening of imidazolinone-resistant rice from EMS-mutated populations[J]., 2021, 35(2): 253-261. (in Chinese with English abstract)

[30] Wang F Q, Xu Y, Li W Q, Chen Z H, Wang J, Fan F J, Tao Y J, Jiang Y J, Zhu Q H, Yang J. Creating a novel herbicide-tolerance OsALS allele using CRISPR/Cas9- mediated gene editing[J]., 2021, 9(2): 305-312.

[31] 張保龍, 王金彥, 凌溪鐵, 陳天子, 鄧惠清, 吳魁. 使植物具有除草劑抗性的水稻突變型蛋白, 基因及其應用: CN107090447A[P]. 2017.

Zhang B L, Wang J Y, Ling X T, Chen T Z, Deng H Q, Wu K. Rice plants having a mutantherbicide resistance protein, genes and their application: CN107090447A[P]. 2017. (in Chinese with English abstract)

Improvement of Herbicide Resistance in Rice by Using CRISPR/Cas9 System

YIN Liying1, ZHANG Yuanye1, LI Rongtian1,*, HE Mingliang2, WANG Fangquan3, XU Yang3, LIU Xinxin4, PAN Tingting5, TIAN Xiaojie2, BU Qingyun2, LI Xiufeng2,*

(1College of Life Science, Heilongjiang University, Harbin 150080, China;2Northeast Institute of Geography and Agroecology, Key Laboratory of Soybean Molecular Design Breeding, Chinese Academy of Sciences, Harbin 150081, China;3Institute of Food Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China;4College of Life Science, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China;5College of Agriculture, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China;*Corresponding author, email: lirongtian07@aliyun.com; lixiufeng@iga.ac.cn)

【Objective】It is of great significance to create herbicide-resistant rice varieties. The acetyllactic acid synthase () gene was edited to create rice varieties with excellent herbicide resistance using non-herbicide-resistantrice varieties with good quality as materials. 【Methods】Using CRISPR/Cas9 technology, the single-base mutant vector pH-NCas9-PBA-was constructed with acyllactic acid synthase () as the target gene. Songjing 22, Longjing 46 and Suijing 18 were used as transformation materials to obtain transgenic plants through-mediated genetic transformation. Genotypes and phenotypes were identified by sequencing the mutation sites of transgenic plants and herbicide spraying test. 【Results】 TenS627Nmutants, oneS627Nand1884G-A(the 628thamino acid unchanged mutant), and oneS627N/G628Emutant were obtained by molecular level detection. Compared with the wild type, the three types of mutants had stronger herbicide resistance.【Conclusion】Using CRISPR/Cas9 gene editing technology, we obtained homozygous mutant lines which are genetically stable and herbicide-resistant, providing basic materials for herbicide-resistant rice breeding.

rice;; herbicide resistance; imazethapyr; CRISPR/Cas9; gene editing

10.16819/j.1001-7216.2022.211004

2021-10-13;

2021-12-07。

黑龍江省杰出青年基金資助項目(JQ2020C003)。