水楊酸通過一氧化氮途徑調控水稻緩解低磷脅迫

朱春權 魏倩倩 黨彩霞 黃晶 徐青山 潘林 朱練峰 曹小闖 孔亞麗項興佳 劉佳 金千瑜 張均華,*

水楊酸通過一氧化氮途徑調控水稻緩解低磷脅迫

朱春權1, #魏倩倩1, 2, #黨彩霞3黃晶1徐青山1潘林1朱練峰1曹小闖1孔亞麗1項興佳2劉佳4金千瑜1張均華1,*

(1中國水稻研究所 水稻生物學國家重點實驗室，杭州 310006；2安徽大學，合肥 230039；3宜賓學院，湖北 宜賓 644000；4江西省農業科學院，南昌 330200；#共同第一作者；*通信聯系人，email: zhangjunhua@caas.cn)

【目的】深入剖析水楊酸調控水稻低磷脅迫響應的生理與分子機制具有重要意義。【方法】選取常規水稻品種日本晴，外源添加水楊酸后測定水稻體內總磷含量、酸性磷酸酶活性、木質部汁液磷含量、水稻根系特征參數、磷轉運子基因表達水平和一氧化氮含量等指標解析水楊酸緩解水稻缺磷脅迫的生理和分子機制。【結果】1）水楊酸對水稻磷吸收的調控存在劑量效應，1 μmol/L水楊酸顯著提高低磷條件下水稻體內總磷含量，5 μmol/L水楊酸則降低水稻體內總磷含量。2）低磷條件下，1 μmol/L水楊酸使酸性磷酸酶活性提高了11.35%，根系總長增加了20.90%，根系表面積增加11.86%，根系體積增加了15.38%，總根數增加了23.55%，木質部汁液中的磷含量提高了22.67%。同時，1 μmol/L水楊酸提高了水稻根系磷轉運子基因的表達，從而提高水稻對外界磷的吸收和體內磷的轉運。3）水楊酸通過提高硝酸還原酶的活性增加水稻根系的一氧化氮含量，從而通過調控磷轉運子基因的表達提高低磷條件下水稻對外界磷的吸收。【結論】水楊酸與信號分子一氧化氮互作緩解低磷脅迫。

水稻；磷；水楊酸；吸收和轉運；基因；一氧化氮

磷是植物體內ATP、細胞膜、核酸、酶等物質的重要組成成分，其含量約占植物干質量的0.05%～ 0.5%，同時，磷參與植物光合作用、呼吸作用、酶促反應等過程[1, 2]。然而，我國耕地土壤中磷含量普遍較低，雖然生產上常用增施磷肥的方式保證作物正常的磷需求，但磷肥施入土壤后除了易被土壤微生物轉化為有機磷外，還會被土壤顆粒和土壤中的陽離子固定形成難溶的無機磷，導致施入土壤中的磷肥并不能被作物完全利用。據統計，磷肥的當季利用率僅為15%左右[1, 2]。植物缺磷后，其光合磷酸化水平下降，光合速率降低，最終抑制作物生長，導致產量下降[3]。長期進化過程中，植物形成了一系列耐低磷機制響應外界的缺磷脅迫。比如，植物可以通過增加其側根數量、根毛長度和密度提高對外界磷的吸收，從而增強耐低磷脅迫能力[4]；植物體還可以通過向外分泌蘋果酸、檸檬酸等有機酸使土壤中的固態磷溶解，或是通過分泌酸性磷酸酶將體外有機態磷轉化為有效磷等方式提高植物體對外界磷的吸收[5]。除此之外，植物還會通過繞過需要磷的生理步驟[6]，釋放水稻根系細胞壁中結合態磷[7]，提高細胞膜中不含磷的硫醇和甾醇的含量，減少磷脂含量[8]，從而最終增加植株可利用磷的含量。

水楊酸(salicylic acid，SA)作為信號分子，在植物發育和調控植物響應生物或非生物脅迫過程中發揮調節功能[9]，比如提高植物光合速率，調節植物氣孔閉合[10-12]，提高植物耐鋁脅迫[13]、耐低溫脅迫[14,15]等。目前，水楊酸調控植物響應養分脅迫的研究較少。前期有研究發現，外源添加水楊酸后，與植物氮、鉀和硫吸收轉運相關基因的表達會發生變化，暗示水楊酸可能參與調控植物養分吸收和轉運。同時，有研究發現，在大麥中，水楊酸對磷的吸收存在抑制作用[16]，然而，在甜菜和玉米中，外源添加水楊酸不僅可以通過溶解土壤中的磷來提高植物對外界磷的吸收，還能直接提高逆境條件下植物對磷的吸收[17,18]。因此，水楊酸對植物磷吸收的不同調控作用是否與外源水楊酸的濃度相關，在不同種類植物中是否存在不同的調控作用值得進一步研究。

一氧化氮(nitric oxide，NO)是植物體內普遍存在的氣體信號分子，除廣泛參與調節植物的氣孔關閉、種子萌發等生理活動外，還參與調控植物緩解各類非生物脅迫[19]。比如，外源施加硝普鈉(SNP)提高了植物體內抗氧化系統酶活性和光合系統效率，并且減少砷在植物體內的積累[20]。外源添加一氧化氮清除劑c-PTIO顯著降低水稻體內的磷含量，說明一氧化氮參與調控水稻磷吸收[21]。同時，外源添加一氧化氮的前體物質硝普鈉顯著提高了水稻根系的果膠含量和果膠甲酯酶活性，從而促進了水稻根系細胞壁磷的再利用，此外，一氧化氮還通過提高磷轉運子基因和的表達增強水稻磷吸收[22]。除此之外，在調節植物生長發育和調控植物應對非生物脅迫過程中，一氧化氮常與植物激素水楊酸互相作用。比如促進種子萌發，增強植物光合作用，緩解植物水分脅迫、重金屬脅迫和高溫脅迫等[23]。

低磷脅迫是限制水稻產量與品質的重要因素。雖然前人對水楊酸參與調控植物應對逆境脅迫有較多的研究，但水楊酸信號是否參與調節水稻響應低磷脅迫還需進一步研究。本研究選用常規水稻品種日本晴作為供試材料，通過外源添加水楊酸，在正常磷和低磷脅迫下測定水稻地上部和根系磷含量變化與生理變化，探究水楊酸調控水稻響應低磷脅迫的生理和分子機制，從而為提高實際生產中水稻磷的利用率提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

采用水培方法，選擇常規粳稻品種日本晴作為實驗材料。將水稻種子浸泡后在鋪有濾紙的培養皿上催芽，待水稻種子露白后移入1/2的木村培養液繼續培養，待水稻長至兩葉一心期后進行處理。營養液中包含0.5 mmol/L NH4NO3, 0.18 mmol/L KCl, 0.36 mmol/L CaCl2, 0.6 mmol/L MgSO4·7H2O, 9 mmol/L MnCl2·4H2O, 0.1 mmol/L Na2MoO4·4H2O, 10 mmol/L H3BO3, 0.7 mmol/L ZnSO4·7H2O, 0.3 mmol/L CuSO4和20 mmol/L FeSO4·7H2O-EDTA。使用NaH2PO4·2H2O作為磷源，其中正常磷處理為180 mmol/L，低磷處理為18 mmol/L。為篩選合適的水楊酸濃度，設置三個水楊酸濃度：0、1、5 μmol/L，水楊酸直接添加在培養液中。水稻培養在光照培養間中，條件為白天12 h、28℃，晚上12 h、22℃，光照強度為400 μmol/(m2·s)，相對濕度為65%。每3 d換一次營養液，換完營養液后同時添加水楊酸。根據水稻體內的總磷含量確定合適的水楊酸濃度為1 μmol/L，然后進行后續試驗(分別標記為P，P+SA，LP和LP+SA)。

在后續與一氧化氮互作試驗中，處理分別為P，P+SA+cPTIO，LP，LP+SA+cPTIO。其中，cPTIO的濃度為1 μmol/L，直接添加在培養液中。正常磷和低磷的濃度與前面的處理一致。

1.2 水楊酸含量測定

水楊酸含量采用高效液相色譜-串聯質譜測定。將1 g植物鮮樣用液氮研磨后加入10 mL提取液(異丙醇∶水∶鹽酸，2∶1∶0.002，/)，進一步提取離心后過0.22 μm濾膜，然后將最終提取液注入高效液相色譜-質譜(HPLC-MS/MS)串聯分析儀進行測定[24,25]。

1.3 總磷的提取和測定

收集水稻根系和地上部裝入信封，在105 ℃烘箱中殺青30 min后，取出植物樣本，再放入75 ℃烘箱中烘干至恒重。稱取烘干后的水稻地上部和根干質量，用過氧化氫(H2O2)和濃H2SO4進行消煮，待其冷卻后用超純水定容，然后用鉬藍比色法測定水稻總磷含量[1]。

1.4 酸性磷酸酶活性測定

取水稻根系鮮樣，稱量，在液氮中研磨，然后用0.2 mmol/L醋酸鈉緩沖液提取根系酸性磷酸酶。將反應液(0.2 mmol/L, pH 5.8的醋酸鈉緩沖液，內含0.5 g/L對硝基苯磷酸二鈉)與酶粗提液混合并搖勻，在37℃水浴保溫30 min，加入6 mol/L的NaOH以終止酶促反應，用紫外可見分光光度計在400 nm波長下比色。酸性磷酸酶活性通過單位時間內單位質量的根催化對硝基苯磷酸二鈉生成對硝基苯酚的量來表示[1]。

1.5 木質部汁液磷的提取與測定

切斷水稻根上部2 cm處，持續2 h用移液器吸取流出的傷流液。將同一處理中吸取的傷流液放入同一個離心管中并記錄傷流液體積，然后將傷流液適當稀釋后用電感耦合等離子體(ICP)測定木質部汁液磷含量[1]。

1.6 水稻根系構型參數測定

將水稻根系剪下后平鋪在有水的塑料盤中，使用EPSON 10000XL掃描儀掃描獲得水稻根系的圖片。然后利用WinRHIZO根系分析系統(加拿大Regent儀器公司)計算根系的總根長、總表面積、平均直徑、總體積和根尖數等指標[1]。

1.7 水稻硝酸還原酶和一氧化氮合酶活性測定

采用磺胺比色法測定水稻硝酸還原酶活性，根據單位時間內亞硝態氮生成量計算硝酸還原酶的活性[26, 27]。

采用熒光比色法測定水稻一氧化氮合成酶(NOS)活性，根據單位時間產生的一氧化氮與N-乙酰半胱氨酸相互作用生成硝基N-乙酰半胱氨酸的量計算NOS酶活[28]。

數據用均值±標準差(n = 4)表示。不同的大小寫字母代表處理間差異分別在P < 0.01和P < 0.05 水平上顯著。P－180 mmol/L；LP－18 mmol/L。

Fig. 1. P contents in roots(A) and shoots (B) under low and normal P levels.

1.8 水稻根系RNA提取和基因表達量測定

水稻根系鮮樣取樣后用液氮進行研磨，然后用TRizol提取總RNA，用PrimeScript反轉錄試劑盒進行RNA的反轉錄，用Sybgreen(TaKaRa，日本)進行實時熒光定量PCR，基因的引物序列和內參基因的引物序列均參考文獻[1]。

1.9 數據統計分析

每個實驗均含有4個生物學重復。單因素方差分析采用SPSS 21.0.0軟件進行，均數采用Tukey檢驗統計學差異。圖表上不同的字母表示平均值在<0.05水平上有統計學差異。

2 結果與分析

2.1 水楊酸對水稻磷吸收的影響

外源添加1 μmol/L的水楊酸后，在正常磷濃度和缺磷條件下，水稻地上部和根部的總磷含量均顯著提高(圖1)。然而，外源添加5 μmol/L水楊酸后，正常磷條件下，水稻根系和地上部的總磷含量均顯著下降，低磷條件下，水稻根系的總磷含量也顯著下降(圖1)。說明水楊酸對水稻磷吸收的調控存在劑量效應，合適的水楊酸濃度可以增加水稻在正常情況下和低磷條件下對外源磷的吸收，超過合適濃度則抑制水稻對外源磷的吸收。

為確定外源水楊酸是否進入水稻體內發揮作用，我們測定了水稻體內的水楊酸含量和與水楊酸合成相關的苯丙氨酸解氨酶活性[29]。由圖2可知，在未添加水楊酸條件下，缺磷后水稻體內的水楊酸含量和苯丙氨酸解氨酶的活性均顯著上升，暗示水楊酸可能參與水稻對缺磷脅迫的響應。外源添加水楊酸后，水稻體內的水楊酸含量和苯丙氨酸解氨酶活性隨著水楊酸添加量的增加而提高(圖2)，暗示外源添加水楊酸增加了水稻體內水楊酸的含量，促進水稻體內水楊酸的合成。

數據用均值±標準差(n = 4)表示。不同的大小寫字母代表處理間差異分別在P < 0.01和P < 0.05 水平上顯著。P－180 mmol/L；LP－18 mmol/L。

Fig. 2. Salicylic acid content and phenylalanine ammonia lyase activity under different exogenous salicylic acid levels.

因為本研究主要分析水楊酸對水稻外源磷吸收轉運的促進作用，因此接下來的實驗均采用1 μmol/L的水楊酸進行處理。

2.2 水楊酸調控水稻磷吸收和轉運

根系是水稻吸收磷的主要器官。由表1可知，在低磷條件下，水稻根系總長、表面積、根的體積和總根數較正常磷條件均有所提高，分別提高了3.76%、38.82%、18.18%和58.73%。在低磷條件下，與未添加水楊酸處理組相比，添加1 μmol/L水楊酸后，水稻根系總長、表面積、平均直徑和總根數均顯著提高，分別提高了20.90%、11.86%、15.38%、23.55%。水稻根系的表型同樣顯示，在外源添加水楊酸后，水稻的根系顯著變長(圖3-A)。同時，缺磷導致水稻株高顯著降低，添加水楊酸對水稻地上部的長勢沒有顯著影響(圖3-A)。

數據用均值±標準差(n = 4)表示。不同的大小寫字母代表處理間差異分別在P < 0.01和P < 0.05 水平上顯著。P－180 mmol/L；LP－18 mmol/L；SA－1 μmol/L水楊酸。

Fig. 3. Phenotype of rice, acid phosphatase activity in rice roots and xylem P concentration.

正常磷和低磷條件下，外源添加1 μmol/L水楊酸后，水稻根系的酸性磷酸酶活性均顯著提高。在正常磷和低磷條件下，外源添加1 μmol/L的水楊酸后，水稻木質部汁液中的磷含量顯著提高，增幅為22.67%(圖3-B～C)。

表1 水稻根系發育相關指標

2.3 水楊酸調控水稻體內磷轉運子基因的表達

低磷脅迫下，水稻根系的基因家族中，除了表達沒有變化，表達顯著下降外，其余的磷轉運子基因的表達均顯著上調。在缺磷條件下，外源添加水楊酸后，水稻根系的，，，，，，，基因的表達均顯著上調(圖4)。缺磷條件下，和基因的表達不受水楊酸的調控，基因的表達在添加水楊酸后甚至顯著下降(圖4)，這也說明了水楊酸對水稻磷轉運子基因家族調控的多元化。

數據用均值±標準差(n = 4)表示。不同的大小寫字母代表處理間差異分別在P < 0.01和P < 0.05 水平上顯著。P－180 mmol/L；LP－18 mmol/L。

Fig. 4. Relative expression levels of P transporter genes.

2.4 水楊酸與一氧化氮互作調控水稻磷吸收

本研究采用熒光法檢測水稻根尖一氧化氮含量，綠色熒光越強，一氧化氮含量越高。結果顯示，低磷脅迫顯著增加水稻根系的一氧化氮含量，外源添加水楊酸進一步增加了水稻根系一氧化氮含量(圖5-A～B)。

植物體內主要通過硝酸還原酶(NR)和一氧化氮合酶(NOS)合成一氧化氮。結果顯示，在低磷條件下，水稻根系的硝酸還原酶和一氧化氮合酶活性均顯著增加，與一氧化氮含量的變化趨勢一致。低磷條件下外源添加水楊酸后，水稻根系的硝酸還原酶(NR)活性進一步顯著增加，而一氧化氮合酶的活性并沒有顯著變化(圖5-C～D)。

數據用均值±標準差(n = 4)表示。不同的小寫字母代表處理間差異在P < 0.05 水平上顯著。P－180 mmol/L；LP－18 mmol/L；SA－1 μmol/L水楊酸。

Fig. 5. Nitric oxide fluorescence (A), fluorescence intensity (B), NR activity (C), and relative NOS activity (D).

為了進一步確認水楊酸是否通過調控一氧化氮含量緩解低磷脅迫，我們在外源添加水楊酸的同時添加了一氧化氮的清除劑c-PTIO。結果顯示，無論在加磷還是低磷條件下，同時添加水楊酸和c-PTIO后，水稻根系和地上部的總磷含量均顯著下降(圖6)。

數據用均值±標準差(n = 4)表示。不同大小寫字母代表處理間差異分別在P < 0.01和P < 0.05水平上顯著。P－180 mmol/L；LP－18 mmol/L；SA－1 μmol/L；cPTIO－1 μmol/L。

Fig. 6. Total P content of rice roots (A) and shoots (B) after c-PTIO application.

數據用均值±標準差(n = 4)表示。不同大小寫字母代表處理間差異分別在P < 0.01和P < 0.05 水平上顯著。P－180 mmol/L；LP－18 mmol/L；SA－1 μmol/L；cPTIO－1 μmol/L。

Fig. 7. Salicylic acid content of rice roots after 1 μmol/L c-PTIO application.

外源添加水楊酸顯著增加水稻體內的水楊酸含量，然而在添加水楊酸的同時添加一氧化氮清除劑c-PTIO后，水稻根系中的水楊酸含量進一步增加。可能的原因在于，一氧化氮在水楊酸的下游發揮作用，當下游的一氧化氮被清除后造成上游水楊酸補償性的合成，因此進一步增加了水稻根系的水楊酸含量。

對水稻根系硝酸還原酶活性進行測定后發現，外源水楊酸顯著增加水稻根系的硝酸還原酶活性，同時添加一氧化氮的清除劑c-PTIO后，顯著降低水稻根系的硝酸還原酶活性，說明c-PTIO同時可能通過抑制硝酸還原酶的活性抑制水稻體內一氧化氮的合成(圖8)。

數據用均值±標準差(n = 4)表示。不同的小寫字母代表處理間差異在P < 0.05 水平上顯著。P－180 mmol/L，LP－18 mmol/L；SA－1 μmol/L；cPTIO－1 μmol/L。

Fig. 8. NR activity of rice roots after 1 μmol/L c-PTIO application.

選擇8個添加水楊酸后顯著上調表達的磷轉運子基因繼續試驗，發現在低磷條件下，同時添加水楊酸和c-PTIO后，除了基因的表達與單獨添加水楊酸處理沒有顯著差異，其余的磷轉運子在同時添加c-PTIO后，其基因的表達均顯著低于單純的水楊酸處理組，部分甚至低于單純的低磷處理組(圖9)，說明清除一氧化氮顯著降低水楊酸對水稻磷轉運子基因表達的調控作用，進一步證明了水楊酸通過一氧化氮調控磷轉運子基因表達提高水稻對外界磷的吸收。

數據用均值±標準差(n = 4)表示。不同小寫字母代表處理間差異在P < 0.05 水平上顯著。P－180 mmol/L; LP－18 mmol/L; SA－1 μmol/L水楊酸；CP－cPTIO，1 μmol/L。

Fig. 9. Relative expression levels of P transporter genes.

3 討論

水楊酸是植物體內普遍存在的一種含酚羥基有機酸，是植物抵抗外界逆境的重要信號分子[13, 29,30]。水楊酸和植物響應缺磷脅迫之間存在不同的研究結果。在甜菜中，低磷條件下甜菜根系通過向外分泌水楊酸溶解土壤中的磷，從而提高甜菜對磷的吸收[17]。在干旱、鹽脅迫和硼毒條件下，無論是用水楊酸浸種還是在土壤中添加水楊酸，均提高了玉米體內的磷含量[18]。然而，在離體大麥根系試驗中發現，外源添加0.5 mmol/L水楊酸顯著降低離體大麥根系對磷的吸收[16]。在我們的試驗中，較高濃度的(5 μmol/L)水楊酸處理降低了水稻體內的總磷含量，然而，合適的濃度(1 μmol/L)則會增加水稻體內的總磷含量(圖1)，說明水楊酸對水稻磷吸收的調控作用存在劑量效應。水楊酸莽草酸途徑合成過程中，苯丙氨酸解氨酶發揮了重要作用[29]。在本研究中，外源添加水楊酸后，水稻體內的水楊酸含量和苯丙氨酸解氨酶的活性均顯著上升(圖2)，說明外源添加水楊酸確實提高了水稻體內的水楊酸含量，促進了水稻體內水楊酸的合成，進一步證明了水稻體內總磷含量的變化與水楊酸的調控密切相關。

根系構型改變從而提高對外界磷的吸收是植物應對缺磷脅迫的常見策略。比如缺磷誘導菜豆基根上側根生長，增加整個根系的總長和吸收面積，并且根系變淺，從而擴大對磷的吸收范圍[31]。缺磷條件下，水稻種子根、不定根和側根的長度隨著磷供應水平的降低而顯著增加[32]。低磷條件下，水稻品種Kasalath比日本晴擁有更龐大的根系，因此在缺磷土壤中可以吸收更多的磷，維持較好的生長[33]。在本研究中，缺磷條件下水稻根系總長、表面積、根的體積和總根數較正常磷條件下均顯著增加(表1)，說明水稻通過改變根系構型響應低磷脅迫。外源添加水楊酸后，水稻根系的總長、表面積、根的體積和總根數進一步增加(表1)。水稻的表型同樣顯示，外源添加水楊酸，顯著提高水稻的根長(圖3-A)，說明水楊酸通過改變水稻根系構型提高水稻對外界磷的吸收，從而緩解低磷脅迫。

土壤中的磷通過根系的磷轉運子進入植物體內。水稻體內磷轉運子1()基因家族共有13個等位基因，除了和在菌根共生過程中誘導，其余大多數在水稻根部細胞膜上表達，編碼的磷轉運子蛋白直接參與水稻對磷的吸收和轉運[34,35]。外源添加水楊酸提高水稻體內總磷含量與水稻磷轉運子基因的表達變化密不可分。比如，，和均屬于高親和磷轉運子，受磷饑餓誘導，過表達后顯著增加水稻體內的磷含量[36,37]在本研究中，低磷條件下外源添加水楊酸后，，，，，基因的表達顯著上調(圖4)，從而提高水稻對外界磷的吸收。然而，低磷條件下外源添加水楊酸后，和的基因并沒有上調表達，基因甚至出現了下調表達(圖4)，可能原因在于不同磷酸鹽轉運子基因對同一種信號物質存在不同的調控反應以及在水稻生長過程中發揮不同的作用。比如，是組成型基因，不受缺磷脅迫的誘導表達，雖然受缺磷誘導表達，但是在水稻的胚胎發育過程中發揮重要作用[38]，以上差異具體原因還需后續進一步研究。

除此之外，通過測定水稻木質部汁液中的磷含量發現，外源添加水楊酸后，木質部汁液中的磷含量顯著上升，說明水楊酸還調控水稻體內的磷從根系往地上部的轉運(圖3-A)。水稻體內的磷轉運子，，基因主要與水稻體內磷的轉運密切相關，比如和屬于高親和磷轉運子，具有磷吸收和體內再分配的雙重功能，屬于低親和磷轉運子，主要負責水稻體內磷從根系往地上部的長距離轉運[39,40]。在本研究中，低磷脅迫顯著增加了以上3個基因的表達(圖4)，外源添加水楊酸后，3個基因的表達進一步增加。結合木質部汁液中磷含量的變化，說明水楊酸同樣可以調控低磷條件下水稻根系中的磷往地上部的轉運。

缺磷條件下，植物體內酸性磷酸酶的合成和分泌急劇增加。酸性磷酸酶不僅能夠催化植物體內的磷酸單脂分解成脂肪酸和無機磷，還可以通過分泌進入土壤后參與土壤無機磷的分解，從而提高植物的磷吸收效率[41]。本研究發現，低磷脅迫顯著增加水稻根系的酸性磷酸酶活性，外源添加水楊酸后，水稻根系的酸性磷酸酶活性進一步提高(圖3)，說明水楊酸通過提高酸性磷酸酶的活性，促進水稻對外界磷的吸收和磷在體內的轉運。

水楊酸調控植物響應逆境脅迫過程中常與一氧化氮產生互作[42]。比如水楊酸減輕煙草花葉病毒損傷過程中，外源添加一氧化氮合成的抑制劑會減弱水楊酸的作用[43]；在擬南芥中，水楊酸通過調控一氧化氮合酶產生一氧化氮[44]。在本研究中，我們同樣測定了硝酸還原酶和一氧化氮合酶的活性，發現缺磷脅迫顯著增強了兩種酶的活性(圖5)，說明水稻通過調控硝酸還原酶和一氧化氮合酶活性產生一氧化氮。然而在低磷條件下外源添加水楊酸后，只有硝酸還原酶的活性進一步增加，而NOS酶活并沒有顯著變化(圖5)，說明在水稻體內水楊酸通過增強硝酸還原酶的活性提高體內一氧化氮含量。前期研究發現，一氧化氮參與調控植物響應缺磷脅迫，比如在白羽扇豆中，一氧化氮通過提高根系檸檬酸的釋放提高其對外界磷的吸收，在水稻中，一氧化氮通過調控水稻根系細胞壁組分的變化，促使細胞壁中結合態磷的釋放，從而緩解缺磷脅迫[22,45]。為了進一步驗證水楊酸是否通過一氧化氮途徑調控水稻響應缺磷脅迫，我們同時添加了水楊酸和一氧化氮的清除劑c-PTIO，結果發現，當添加c-PTIO后，即使存在水楊酸，水稻在低磷條件下體內的總磷含量仍然顯著下降(圖6)，證明了一氧化氮參與調控水稻緩解缺磷脅迫。同時添加水楊酸和c-PTIO，顯著降低了水稻根系中的硝酸還原酶的活性(圖8)，并且降低了磷轉運子基因的表達(圖9)，進一步驗證了水楊酸通過調控一氧化氮的合成調節水稻磷轉運子基因的表達，最終緩解低磷脅迫。然而，同時添加水楊酸和c-PTIO，顯著提高了水稻根系中水楊酸的含量(圖7)，可能的原因在于，一氧化氮作為水楊酸的下游信號物質，當它被清除后，上游的水楊酸補償性地大量合成，將水稻根系一氧化氮含量維持在正常的范圍。

然而，本研究的結果是在水培條件下取得的，在土壤培養過程中可能存在不一樣的結果。比如，在土壤環境中，因為水稻品種Kasalath擁有更大的根系，因此能在缺磷的土壤中比日本晴長得更好[33]。然而，在完全缺磷的水培條件下，因為培養液中完全缺磷，因此Kasalath的大根系不能發揮作用，只能靠體內磷的再利用緩解缺磷脅迫。對比日本晴與Kasalath兩個水稻品種根細胞壁結合態磷再利用的研究發現，在完全缺磷的營養液中，日本晴的根系細胞壁擁有更多的果膠含量，可以將細胞壁中的結合態磷釋放出來，供水稻利用，因此，日本晴體內擁有更高的有效磷含量[22]。同時，土壤中的磷以各種形式存在，包括可以直接利用的有效磷和不能直接利用的結合態磷等，植物能通過根系向外釋放氫離子、有機酸和果膠等物質，將土壤中與礦物或者土壤顆粒結合的磷釋放出來，供植物吸收利用[46,47]。然而，在水培條件下，因為營養液中添加的是可被植物直接吸收利用的磷，同時營養液的pH可被緩沖液控制，以上的方式均不能提高水稻對營養液中磷的吸收。因此，本研究結果運用于土培時，可能會存在一些差異，可能有必要運用土培試驗驗證水楊酸對水稻磷吸收和利用的調控作用。

4 結論

水楊酸調控水稻緩解低磷脅迫具有劑量效應，在合適的濃度下，水楊酸通過改變水稻根系構型，提高酸性磷酸酶活性，提高磷轉運子基因的表達和促進磷從根系往地上部的轉運緩解水稻低磷脅迫活性。在水楊酸緩解水稻低磷脅迫的調控過程中，與信號分子一氧化氮產生互作，是一氧化氮依賴的過程。

[1] 朱春權, 曹小闖, 朱練峰, 白志剛，黃潔，梁清鐸，金千瑜，張均華. 硫化氫提高水稻磷吸收轉運的生理和分子機制[J]. 中國水稻科學, 2019, 33(6): 532-540.

Zhu C Q, Cao X C, Zhu L F, Bai Z G, Huang J, Liang Q D, Jin Q Y, Zhang J H. Physiological and molecular mechanisms of hydrogen sulfide enhancing phosphorus absorption and transportation in rice[J]., 2019, 33(6): 532-540. (in Chinese with English abstract)

[2] 郎印海. 缺磷脅迫下植物應激反應初步研究及應激物質的誘導、提取分離[D]. 泰安: 山東農業大學, 2000.

Lang Y H. Preliminary study on plants response to phosphorus deficiency stress and the extraction and separation of stress induction substances[D]. Tai’an: Shandong Agricultural University, 2000.

[3] 張海偉, 黃宇, 葉祥盛, 徐芳森. 低磷脅迫下甘藍型油菜酸性磷酸酶對磷效率的貢獻分析[J]. 中國科學: C輯, 2010, 40(5): 418-427.

Zhang H W, Huang Y, Ye X S, Xu F S. Contribution analysis of phosphorus efficiency for acid phosphatase inL. under low phosphorus stress[J]., 2010, 40(5): 418-427. (in Chinese)

[4] 李立芹. 植物低磷脅迫適應機制的研究進展[J]. 生物學通報, 2011, 46(2): 13-16.

Li L Q. Advances in the mechanism of plant adapt to low phosphorus stress[J]., 2011, 46(2): 13-16. (in Chinese)

[5] 李鋒, 潘曉華. 植物適應缺磷脅迫的根系形態及生理特征研究進展[J]. 中國農學通報, 2002, 18(5): 65-69, 76.

Li F, Pan X H. The research development of morphological and physiological characteristics of plant root system under phosphorus deficiency[J]. Chinese, 2002, 18(5): 65-69, 76. (in Chinese with English abstract)

[6] Plaxton W C, Carswell M C. Metabolic aspects of the phosphate starvation response in plants. Plant responses to environmental stresses: From phytohormones to genome reorganization Marcel Dekker, New York: 1999, 349-372.

[7] Zhu X F, Wang Z W, Wan J X, Sun Y, Wu Y R, Li G X, Shen R F, Zheng S J. Pectin enhances rice () root phosphorus remobilization[J]., 2015, 66(3): 1017-1024.

[8] Yu B, Xu C, Benning C.disrupted in SQD2 encoding sulfolipid synthase is impaired in phosphate-limited growth[J].2002, 99(8): 5732-5737.

[9] Bandurska H. An update on biosynthesis and action in plant response to water deficit and performance under drought[C]//Hayat S, Ahmad A, Alyemeni M N. Salicylic Acid, Springer, 2013: 1-14.

[10] Yusuf M, Hayat S, Alyemeni M N, Fariduddin Q, Ahmad A. Salicylic acid: Physiological roles in plants[C]// Hayat S, Ahmad A, Alyemeni M N. Salicylic Acid, Springer, 2013: 15-30.

[11] Pancheva T V, Popova L P, Uzunova A N. Effects of salicylic acid on growth and photosynthesis in barley plants[J]., 1996, 149(1-2): 57-63.

[12] Pancheva T V, Popova L P. Effect of salicylic acid on the synthesis of ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase/ oxygenase in barley leaves[J]., 1998, 152(4): 381-386.

[13] 張永福, 黃鶴平, 彭聲靜, 任禛，陳澤斌，劉佳妮，陳瑞. 鋁脅迫下水楊酸對水晶葡萄植株生長及營養積累的影響[J]. 中外葡萄與葡萄酒, 2015(2): 10-15.

Zhang Y F, Huang H P, Peng S J, Ren C, Chen Z B, Liu J N, Chen R. Effects of salicylic acid on growth and nutrition accumulation of Shuijing seedling under aluminum stress[J]., 2015(2): 10-15. (in Chinese with English abstract)

[14] Janda T, Szalai G, Tari I, Páldi E. Hydroponic treatment with salicylic acid decreases the effects of chilling injury in maize (L.) plants[J]., 1999, 208(8): 175-180.

[15] Tasgin E, Attici O, Nalbantoglu B. Effect of salicylic acid and cold on freezing tolerance in winter wheat leaves[J]., 2003, 41(3): 231-236.

[16] Glass A D. Influence of phenolic acids on ion uptake: I. Inhibition of phosphate uptake[J]., 1973, 51(6): 1037-1041.

[17] Khorassani R, Hettwer U, Ratzinger A, Ursula H, Reza K, Norbert C. Citramalic acid and salicylic acid in sugar beet root exudates solubilize soil phosphorus[J]., 2011, 11(1): 121.

[18] Gunes A, Inal A, Alpaslan M, Cicek N, Guneri E, Eraslan F, Guzelordu T. Effects of exogenously applied salicylic acid on the induction of multiple stress tolerance and mineral nutrition in maize (L.) [J]., 2005, 51(6): 687-695.

[19] He J Y, Ren Y F, Chen X L, Chen H. Protective roles of nitric oxide on seed germination and seedling growth of rice (L.) under cadmium stress[J]., 2014, 108: 114-119.

[20] Singh V P, Srivastava P K, Prasad S M. Nitric oxide alleviates arsenic-induced toxic effects in ridged Luffa seedlings[J]., 2013, 71: 155-163.

[21] 李鵬飛. 一氧化氮通過調節磷酸鹽吸收與轉運促進水稻磷營養[D]. 廈門: 廈門大學, 2017.

Li P F. Nitric oxide enhances phosphate nutrition in rice seedlings by regulating phosphate uptake and translocation[D]. Xiamen: Xiamen University, 2017.

[22] Zhu C Q, Zhu X F, Hu A Y, Wang C, Wang B, Dong X Y, Shen R F. Differential effects of nitrogen forms on cell wall phosphorus remobilization are mediated by nitric oxide, pectin content, and phosphate transporter expression[J]., 2016, 171: 1407-1417.

[23] Shao R X, Xin L F, Guo J M, Zheng H F, Mao J, Han X P, Jia L, Jia S J, Du C G, Song R, Yang Q H, Elmore R W. Salicylic acid-induced photosynthetic adaptability ofL. to polyethylene glycol-simulated water deficit is associated with nitric oxide signaling[J].,2018, 56: 1370-1377.

[24] Zhang X B, Feng B H, Wang H M, Xu X, Shi Y F, He Y, Chen Z, Sathe A P, Shirle Y L, Wu J L. A substitution mutation inconfers bacterial blight resistance by activating the salicylic acid pathway[J]., 2018, 60(2): 160-172.

[25] You C, Zhu H, Xu B, Wang S, Ding Y, Liu Z, Li G, Chen L, Ding C. Effect of removing superior spikelets on grain filling of inferior spikelets in rice[J]., 2016: 7.

[26] 李忠光，龔明. 磺胺比色法測定植物組織硝酸還原酶活性的改進[J]. 植物生理學通訊, 2009, 45(1): 67-68.

Li Z G, Gong M. Improvement of nitrate reductase activity measurement in plant tissues by sulfa colorimetry method[J]., 2009, 45(1): 67-68. (in Chinese)

[27] 張志良. 植物生理學實驗指導. 北京: 高等教育出版社, 2003: 41-43.

Zhang Z L. Experimental Guidance in Plant Physiology. Beijing: Higher Education Press, 2003: 41-43. (in Chinese)

[28] 徐暢, 安書成. 一氧化氮及一氧化氮合酶的測定[J]. 陜西師范大學繼續教育學報, 2004, 21(1): 115-118.

Xu C, An S C. Determination of nitric oxide and nitric oxide synthase[J]., 2004, 21(1): 115-118. (in Chinese)

[29] 穆師洋, 胡文忠, 姜愛麗. 水楊酸的信號分子作用及其在鮮切果蔬中的應用[J]. 食品安全質量檢測學報, 2015(7): 2434-2438.

Mu S Y, Hu W Z, Jiang A L. The role of salicylic acid as signal molecule and its application in fresh-cut fruits and vegetables[J]., 2015(7): 2434-2438. (in Chinese with English abstract)

[30] 侯爽, 陳錦芬, 劉溶榮, 王瑞, 陳俊鴻, 鄒聰明, 謝小玉. 外源水楊酸對煙草幼苗低溫脅迫的緩解效應[J]. 湖南農業大學學報: 自然科學版, 2020, 46(1): 14-20.

Hou S, Chen J F, Liu R R, Wang R, Chen J H, Zou C M, Xie X Y. Mitigative effect of exogenous salicylic acid on low temperature stress in tobacco seedlings[J].:, 2020, 46(1): 14-20. (in Chinese with English abstract)

[31] Liao H, Yan X L. Adaptive changes and genotypic variation for root architecture of common bean in response to phosphorus deficiency[J]., 2000, 42(2): 158-163. (in Chinese with English abstract)

[32] 黃榮, 孫虎威, 劉尚俊, 宋文靜, 劉言勛, 余超, 毛穎, 張亞麗, 徐國華. 低磷脅迫下水稻根系的發生及生長素的響應[J]. 中國水稻科學, 2012, 26(5): 563-568.

Huang R, Sun H W, Liu S J, Song W J, Liu Y X, Yu C, Mao Y, Zhang Y L, Xu G H. Rice Root Growth and Auxin Concentration in Response to Phosphate Deficiency[J]．, 2012, 26(5): 563-568. (in Chinese with English abstract)

[33] Wissuwa M, Ae N. Genotypic variation for tolerance to phosphorus deficiency in rice and the potential for its exploitation in rice improvement[J].,2001, 120: 43-48.

[34] Li H, Guo L, Tao C, Yang L M, Wang X Z. Nonredundant regulation of rice arbuscular mycorrhizal symbiosis by two members of thegene family[J]., 2012, 24: 4236-4251.

[35] Paszkowski U, Kroken S, Roux C, Briggs S P. Rice phosphate transporters include an evolutionarily divergent gene specifically activated in arbuscular mycorrhizal symbiosis[J]., 2002, 99: 13324-13329.

[36] Wang X, Wang Y, Pi?eros M A, Wang Z Y, Wang W X, Li C G, Wu Z C, Kochian L V, Wu P. Phosphate transportersandare involved in phosphate uptake in rice[J]., 2014, 37: 1159-1170.

[37] 王文霞. 水稻磷酸鹽轉運體和的功能研究. 杭州: 浙江大學, 2014: 21-30.

Wang W X. Functional analysis ofandin[D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2014: 21-30. (in Chinese with English abstract)

[38] Zhang F, Sun Y F, Pei W X, Jain A, Sun R, Cao Y, Wu X, Jiang T, Zhang L, Fan X, Chen A, Shen Q, Xu G, Sun S. Involvement ofin phosphate acquisition and mobilization facilitates embryo development in rice[J]., 2015, 82(4): 556-569.

[39] Ai P H, Sun S B, Zhao J N, Fan X R, Xin W J, Guo Q, Yu L, Shen Q R, Wu P, Miller A J, Xu G H. Two rice phosphate transporters,and, have different functions and kinetic properties in uptake and translocation[J]., 2009, 57(5): 798-809.

[40] Jia H, Ren H, Gu M, Zhao J, Sun S, Zhang X, Chen J, Wu P, Xu G. The phosphate transporter geneis involved in phosphate homeostasis in rice[J]., 2011, 156(3): 1164-1175.

[41] 黃沆, 付崇允, 周德貴, 陳光輝, 周少川. 植物磷吸收的分子機理研究進展[J]. 分子植物育種, 2008, 6(1): 117-122.

Huang H, Fu Z Y, Zhou D G, Chen G H, Zhou S C. Progress in research of molecular mechanism of phosphorus absorption in plants[J]., 2008, 6(1): 117-122. (in Chinese with English abstract)

[42] Klessig D F, Durner J, Noad R, Navarre D A, Wendehenne D, Kumar D, Zhou J M, Shah J, Zhang S Q, Kachroo P, Trifa Y, Pontier D, Lam E, Silva H. Nitric oxide and salicylic acid signaling in plant defense[J]., 2000, 97(16): 8849-8855.

[43] Song F, Goodman R M. Activity of nitric oxide is dependent on, but is partially required for function of, salicylic acid in the signaling pathway in tobacco systemic acquired resistance[J]., 2001, 14(12): 1458-1462.

[44] Zottini M, Costa A, Michele R D, Ruzzene M, Carimi F. Salicylic acid activates nitric oxide synthesis in Arabidopsis[J]., 2007, 6 (58): 1397-1405.

[45] Meng Z B, Chen L Q, Suo D, Li G X, Tang C X, Zheng S J. Nitric oxide is the shared signaling molecule in phosphorus- and iron-deficiency-induced formation of cluster roots in white lupin ()[J]., 2012, 109: 1055-1064.

[46] Shen J B, Yuan L X, Zhang J L, Li H G, Bai Z H, Chen H P, Zhang W F, Zhang F S. Phosphorus dynamics: From soil to plant[J]., 2011, 156: 997-1005.

[47] Ae N, Shen R F. Root cell-wall properties are proposed to contribute to phosphorus (P) mobilization by groundnut and pigeonpea[J]., 2002, 245: 95-103.

Salicylic Acid Alleviates Low Phosphorus Stress in Rice via a Nitric Oxide-dependent Manner

ZHU Chunquan1,#, WEI Qianqian1,2,#, DANG Caixia3, HUANG Jing1, XU Qingshan1, PAN Lin1, ZHU Lianfeng1, CAO Xiaochuang1, KONG Yali1, XIANG Xingjia2, LIU Jia4, JIN Qianyu1, ZHANG Junhua1,*

(State Key Laboratory of Rice Biology, China National Rice Research Institute, Hangzhou 310006, China; Anhui University, Hefei 230039, China; Yibin University, Yibin 644000, China; Jiangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanchang 330200; These authors contributed equally to the work; Corresponding author, E-mail: zhangjunhua@caas.cn)

【Objective】It is of great importance to analyze the physiological and molecular mechanisms of salicylic acid(SA) regulating the response of rice to phosphorus(P) stress. 【Method】The conventional rice cultivar Nipponbare was used in our experiment, and the total P content, acid phosphatase activity, xylem P concentration, root parameters, expression levels of P transporter genes and nitric oxide (NO) content in rice were measured after exogenous SA application to explore the physiological and molecular mechanism that SA alleviates P deficiency stress in rice. 【Result】 1) Application of 1 μmol/L SA significantly increased the total P content in rice under low P conditions. However, 5 μmol/L SA decreased the total P content in rice, indicating SA had a dose effect on the regulation of P absorption in rice. 2) Application of 1 μmol/L SA significantly increased the activity of acid phosphatase by 11.35%, total root length by 20.90%, surface area by 11.86%, root volume by 15.38%, total root number by 23.55%, xylem P concentration by 22.6%. In addition, the application of 1μmol/L SA significantly increased the expression levels of P transporter genes, thereby increased the absorption of exogenous P and the transportation of internal P in rice under low P conditions. 3) SA increased the content of NO in rice roots by increasing the activity of nitrate reductase, so as to improve the absorption of P in rice under low phosphorus conditions via regulating the expression of P transporter genes. 【Conclusion】SA alleviates low phosphorus stress in rice by its interacting with the signal molecule of NO.

rice; phosphorus; salicylic acid; absorption and transport; gene; nitric oxide

10.16819/j.1001-7216.2022.210813

2021-08-27；

2022-01-22。

國家自然科學基金青年項目（31901452）；國家自然科學基金面上項目（31872857，31771733）。