大豆分離蛋白及卡拉膠對泥鰍肌原纖維蛋白凝膠特性的影響

孫朋朋 王 薇 李若彤 朱 紅 任圓圓

(長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025)

泥鰍，又稱鰍魚，是中國極具特色的淡水魚類，有“水中人參”之美譽[1]。據《中國漁業統計年鑒》[2-4]顯示，2013—2017年泥鰍的養殖量分別為32.15萬，34.31萬，36.62萬，37.26萬，39.47萬t，以平均每年5.7%的速度持續增加。但泥鰍等淡水魚與海水魚相比，其魚糜的凝膠性能相對較差，因此其深加工程度較低，目前以鮮活銷售為主。

肌原纖維蛋白是一類具有重要生物學功能的結構蛋白，因其出色的水結合能力和凝膠形成能力，決定著魚糜制品的保水性、質構等品質特性。在肌原纖維蛋白的熱誘導凝膠化過程中，肌原纖維蛋白內部結構遭到破壞而發生伸展，蛋白質分子之間相互聚集，形成高黏彈性的三維網絡凝膠結構，這種結構對魚糜制品的品質特性非常重要[5]。目前國內外針對肌原纖維蛋白改性的研究較多，包括物理改性、化學改性、生物改性以及新型技術的改性等[6]。此外，利用肌原纖維蛋白和高分子化合物(如：多糖、蛋白質等)形成復合物也是提高其凝膠特性的方法之一。呂旭琴等[7]探討了不同種類多糖對肌原纖維蛋白凝膠特性的影響，包括陰/陽離子多糖、中性多糖及改性多糖。Lin等[8]探究了植物蛋白混合物對紅鯛魚肌原纖維蛋白凝膠特性的影響。

大豆分離蛋白與卡拉膠是常用的凝膠改良劑，常被用于魚糜凝膠制品的食品加工中，以提升產品的凝膠性、持水性以及肉制品的口感。然而，目前關于使用大豆分離蛋白和卡拉膠對泥鰍肌原纖維蛋白進行改性的研究尚未見報道。研究擬以泥鰍肌原纖維蛋白為研究對象，探究大豆分離蛋白及卡拉膠對其凝膠特性的影響，以期為開發泥鰍類魚糜制品提供理論參考，提高泥鰍的經濟價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

鮮活泥鰍：市售；

大豆分離蛋白、卡拉膠：北京索萊寶科技有限公司；

所有分析用有機溶劑均為國產分析純。

1.1.2 主要儀器設備

紫外可見分光光度計：UV-2600型，日本島津公司；

質構儀：TMS-PRO型，美國Food Technology Corporation (FTC)公司；

色差儀：Hunterlab型，昆山蘊科機電科技有限公司；

掃描電子顯微鏡：Tescan Vega 3型，捷克泰斯肯(Tescan)公司；

紅外光譜儀：VECTOR22型，德國BRUKER公司。

1.2 方法

1.2.1 泥鰍肌原纖維蛋白的提取 參考Pan等[9]的方法并加以改進。將鮮活泥鰍去頭、尾、內臟、魚皮及骨刺后，清洗瀝干，獲得泥鰍肉。向其中加入事先預冷(4 ℃)的0.02 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液(含0.01 mol/L Na2HPO4·12H2O、0.01 mol/L NaH2PO4·2H2O、0.1 mol/L Triton-X 100)[m泥鰍肉∶V緩沖溶液=1∶4 (g/mL)]，高速勻漿，在4 ℃、9 982 r/min條件下離心15 min收集沉淀，重復上述步驟兩次。向所得沉淀中加入事先預冷(4 ℃)的0.1 mol/L NaCl溶液[m泥鰍肉∶VNaCl溶液=1∶4 (g/mL)]，高速勻漿，雙層紗布過濾。所得濾液在4 ℃、9 982 r/min條件下離心15 min 收集沉淀，重復上述步驟兩次，最終得到的沉淀即為泥鰍肌原纖維蛋白(MP)，于4 ℃冰箱中保存備用。

1.2.2 凝膠的制備 用0.6 mol/L NaCl溶液將MP質量濃度調節至70 mg/mL，分別加入0%，1%，2%，3%，4%，5%的大豆分離蛋白及卡拉膠(以MP含量計)，混勻，40 ℃加熱60 min，90 ℃加熱30 min，立即取出冷卻至室溫，置于4 ℃冰箱中平衡過夜，得到復合物凝膠。

1.2.3 凝膠強度的測定 將凝膠切成大小均勻一致的圓柱狀(Φ30 mm×10 mm)，利用質構儀對其凝膠強度進行測定。使用P/0.5型號圓柱探頭，設定探頭位移速度為0.5 mm/s，初始高度為11 mm，下壓比例30%，觸發力0.1 N。

1.2.4 保水性的測定 采用離心法測定凝膠的保水性。準備一根干燥潔凈的離心管，取一定質量的凝膠放入離心管中，在4 ℃、9 982 r/min條件下離心10 min，傾倒上清液，用濾紙吸干凝膠表面水分，再次稱量離心后凝膠與離心管的質量。按式(1)計算凝膠的保水性(Water Holding Capacity，WHC)。

(1)

式中：

WHC——保水性，%；

W——離心管的質量，g；

W1——離心管與初始凝膠的質量，g；

W2——離心管與離心后凝膠的質量，g。

1.2.5 蒸煮損失的測定 取一定質量的凝膠樣品，在40 ℃條件下加熱1 h，再轉入90 ℃加熱30 min 后取出，冷卻至室溫，擦干表面水分后再次稱量凝膠的質量。按式(2)計算凝膠的蒸煮損失(Cooking Loss，CL)。

(2)

式中：

CL——蒸煮損失，%；

M1——凝膠的初始質量，g；

M2——蒸煮后凝膠的質量，g。

1.2.6 白度的測定 將凝膠切成10 mm厚的圓片，利用色差儀測定其表面的色差(L*，a*，b*)，測前先用標準白板進行校正。按式(3)計算凝膠的白度(Whiteness，W)。

(3)

式中：

W——白度；

L*——亮度值；

a*——紅度值；

b*——黃度值。

1.2.7 微觀結構測定 將凝膠切成3 mm×3 mm×3 mm的塊狀，在2.5%的戊二醛溶液中固定過夜，然后用0.2 mol/L pH 7.0的磷酸緩沖液清洗3次，再依次用30%，60%，70%，80%，90%，100%的乙醇溶液梯度脫水，每次脫水30 min。最后經真空冷凍干燥(真空度為1 Pa，冷阱溫度為-70 ℃，運行時間為24 h)及噴金處理后，用掃描電子顯微鏡進行微觀結構的觀察[10]。

1.2.8 傅里葉紅外光譜的測定 將真空冷凍干燥后的凝膠與KBr以m凝膠∶mKBr為1∶150進行混合研磨，壓成薄片，利用傅立葉紅外光譜儀對其進行掃描。掃描范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數為16次。使用MONIC軟件對數據進行去卷積，PeakFit 軟件對1 700～1 600 cm-1區域進行二階導數峰值擬合[11]。

1.3 數據處理與統計分析

所有試驗均進行3次重復，并采用Microsoft Excel計算平均值及標準偏差，SPSS 23.0軟件中的Duncan 法進行顯著性分析，Origin 2019軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 凝膠強度

由圖1可知，隨著大豆分離蛋白含量的增加(1%～5%)，MP凝膠硬度呈先降低后升高的趨勢，而凝膠彈性整體上則先升高后降低。當大豆分離蛋白含量為1%時，MP凝膠硬度最大(1.95 N)，比對照組增加81.39%(P<0.05)，而MP凝膠彈性最小，比對照組減小10.63%(P<0.05)；添加3%的大豆分離蛋白，MP凝膠硬度最低(1.5 N)，但仍顯著高于對照組(P<0.05)，此時的凝膠彈性最大。這可能是由于大豆分離蛋白本身具有較好的乳化性能，可使單位體積凝膠分子數量增加，促進分子間相互作用[12]。與大豆分離蛋白不同，不同含量(1%～5%)的卡拉膠對MP凝膠硬度和彈性均有減弱作用。當卡拉膠含量為1%時，MP凝膠彈性較好，但仍低于對照組(P<0.05)；當卡拉膠含量為2%和4%時，MP凝膠硬度低達0.3 N，比對照組降低了72.09%。作為一種凝膠多糖，卡拉膠具有優良的凝膠特性，可與蛋白質絡合提升產品質量。但試驗中，卡拉膠并未提高泥鰍肌原纖維蛋白的凝膠品質，與孫澤坤等[13]的研究結果相反。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖1 大豆分離蛋白及卡拉膠對泥鰍肌原纖維蛋白凝膠硬度和彈性的影響Figure 1 Effects of soybean protein isolate and carrageenan on gel hardness and springiness of myofibrillar protein from loach

2.2 凝膠保水性

由圖2可知，低含量(1%)的大豆分離蛋白不利于MP凝膠保水性，而高含量(≥2%)的大豆分離蛋白可以提高其保水性。當大豆分離蛋白含量為4%時，MP凝膠保水性高達88.97%，比對照組提高了6.67%(P<0.05)。這可能是由于大豆分離蛋白可以為周圍水分子提供更多的氫鍵結合位點，增強氫鍵和二硫鍵[14-15]，使蛋白質交聯程度增大。張鈺嘉等[16]也發現大豆分離蛋白可以提高草魚肌原纖維蛋白凝膠的保水能力。與大豆分離蛋白不同，卡拉膠的添加對MP凝膠保水性的影響沒有一定規律。當卡拉膠含量為2%，4%時，MP凝膠保水性低于對照組，而在其他添加量時則高于對照組。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖2 大豆分離蛋白及卡拉膠對泥鰍肌原纖維蛋白凝膠保水性的影響Figure 2 Effects of soybean protein isolate and carrageenan on gel water holding capacity of myofibrillar protein from loach

2.3 凝膠蒸煮損失

由圖3可知，隨著大豆分離蛋白和卡拉膠含量(1%～5%)的增加，MP凝膠蒸煮損失呈先降低后升高的趨勢，且均低于對照組，表明這兩種添加物都可以不同程度地降低MP凝膠的蒸煮損失率。這可能是由于在加熱過程中，大豆分離蛋白、卡拉膠及肌原纖維蛋白的結構被充分打開，分子間相互作用增強，使得凝膠網絡持水能力增強，從而減少蒸煮損失率[17]。值得注意的是，添加相同含量(≤4%)的大豆分離蛋白及卡拉膠，后者的MP凝膠蒸煮損失均較小，說明卡拉膠對MP凝膠蒸煮損失的降低效果比大豆分離蛋白的好。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖3 大豆分離蛋白及卡拉膠對泥鰍肌原纖維蛋白凝膠蒸煮損失的影響Figure 3 Effects of soybean protein isolate and carrageenan on gel cooking loss of myofibrillar protein from loach

2.4 凝膠白度

由圖4可知，與對照組相比，不同含量(1%～5%)的大豆分離蛋白對MP凝膠白度均有一定的降低作用(P<0.05)，而卡拉膠對MP凝膠白度整體上呈增大作用。當卡拉膠含量為5%時，MP凝膠白度最大，較對照組增加3.77%(P<0.05)。這主要是因為大豆分離蛋白外觀呈暗黃色，而卡拉膠為白色粉末，因而大豆分離蛋白的添加會降低整個體系的白度，而卡拉膠則與之相反。趙澤潤等[12]在研究大豆分離蛋白對低鹽木質化雞肉糜凝膠特性的影響時也得到類似結論。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖4 大豆分離蛋白及卡拉膠對泥鰍肌原纖維蛋白凝膠白度的影響Figure 4 Effects of soybean protein isolate and carrageenan on gel whiteness of myofibrillar protein from loach

2.5 凝膠微觀結構

由圖5可知，對照組MP凝膠為不均勻的、疏松的網絡結構，這是由于肌原纖維蛋白受熱而變性展開，又因降溫時的聚合作用相互交聯形成。隨著大豆分離蛋白含量的增加，MP凝膠出現較多孔洞，且孔徑越來越大。當大豆分離蛋白含量≥4%時，疏松的網絡結構明顯變得更加緊實，可能是由于大豆分離蛋白填充到肌原纖維蛋白凝膠的微觀空隙中造成的。由于大分子的填充以及蛋白質分子間的相互作用使得復合凝膠的硬度增大，但網絡結構趨向于剛性結構，造成彈性下降[18]。研究[19]表明，肌原纖維蛋白凝膠微觀結構與其保水性有關，若凝膠網絡均勻致密，則凝膠保水性高。這與試驗結果相吻合。與大豆分離蛋白不同，添加1%的卡拉膠后，MP凝膠由疏松多孔的結構變為層次分明的網絡狀；隨著卡拉膠添加量的繼續增加，MP凝膠又出現規則有序的凝膠網絡結構。

圖5 大豆分離蛋白及卡拉膠對泥鰍肌原纖維蛋白凝膠微觀結構的影響Figure 5 Effects of soybean protein isolate and carrageenan on gel microstructure of myofibrillar protein from loach

2.6 凝膠二級結構

蛋白質的紅外光譜特征譜帶主要由酰胺Ⅰ帶、酰胺Ⅱ帶和酰胺Ⅲ帶組成。利用PeakFit軟件對酰胺Ⅰ帶進行基線校正、去卷積和峰擬合，然后根據各擬合峰位置及峰面積可以對泥鰍肌原纖維蛋白凝膠二級結構的相對含量進行分析。由圖6(a)可知，與對照組相比，添加大豆分離蛋白后，肌原纖維蛋白凝膠中β-折疊結構有所下降，僅在添加量為3%時略高于對照組；無規則卷曲及a-螺旋結構相對含量均低于對照組，而轉角結構則較對照組顯著增加。這可能是由于大豆分離蛋白與肌原纖維蛋白復合物在形成凝膠的過程中產生了共價相互作用，促使肌原纖維蛋白的a-螺旋展開，形成更多的轉角結構[20]。也有可能是因為大豆分離蛋白與肌原纖維蛋白是非共價結合，而大豆分離蛋白本身作為一種蛋白質，對肌原纖維蛋白的二級結構測定結果產生了一定的影響[21]。

圖6 大豆分離蛋白及卡拉膠對泥鰍肌原纖維蛋白凝膠二級結構的影響Figure 6 Effects of soybean protein isolate and carrageenan on gel secondary structure of myofibrillar protein from loach

與大豆分離蛋白不同，卡拉膠的添加使肌原纖維蛋白凝膠中無規則卷曲結構消失，β-折疊結構大幅度上升，表明更多的蛋白質分子之間靠氫鍵發生交聯，蛋白質三維網絡結構變得更加有序[22]，見圖6(b)。但a-螺旋及轉角結構的相對含量呈不規律的變化，在添加量為1%，3%，5%時兩者的相對含量都增加，其余添加量時則相反，說明凝膠的質地性質不僅僅與肌原纖維的β-折疊結構有關，可能還取決于其a-螺旋和轉角結構。梁惲紅等[23]認為，蛋白質中a-螺旋向有序的β-折疊轉化時，更有利于形成規則有序的凝膠網絡結構。因此，推測凝膠網絡的有序性與β-折疊的數量呈正相關，與卡拉膠對泥鰍肌原纖維蛋白凝膠微觀結構的影響結果一致。

3 結論

利用大豆分離蛋白和卡拉膠對泥鰍肌原纖維蛋白進行改性，采用質構儀、色差儀、掃描電鏡和紅外光譜等探究其對泥鰍肌原纖維蛋白凝膠特性的影響。結果顯示，隨著大豆分離蛋白含量的增加，泥鰍肌原纖維蛋白凝膠硬度先降低后升高，彈性先升高后降低，保水性增加，蒸煮損失降低，凝膠網絡孔洞越來越大，各二級結構相對含量發生變化；而卡拉膠對凝膠硬度和彈性有減弱作用，對白度及蒸煮損失有較好的改善作用，凝膠網絡結構規則有序且無規則卷曲結構消失。