高效液相色譜法檢測糖漿劑藥品中愛德萬甜不確定度評定

雷德卿 鐘菲菲 周金沙 劉 波 王子倩 周亞敏

(長沙市食品藥品檢驗所，湖南 長沙 410008)

人工合成甜味劑是一類應用較廣泛的食品添加劑[1]，過量攝入可能損害身體健康[2-3]，尤其是肝腎發(fā)育不成熟的兒童，造成的損傷可能不可逆[4]。相對來源于天然產(chǎn)物的藥用級蔗糖，作為食品添加劑的人工合成甜味劑價格低廉，個別企業(yè)為了非法牟利，將食品甜味劑添加到藥品中減少藥用蔗糖量，嚴重損害患者尤其是兒童身體健康。

常用的食品甜味劑主要有糖精鈉、安賽蜜、甜蜜素、阿斯巴甜等[1]，檢測手段比較多，如毛細管電泳法、離子色譜法、氣相色譜法、液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法等[5-9]。愛德萬甜是近年使用較廣泛的甜味劑新興品種，國家市場監(jiān)督管理總局于2022年發(fā)布了食品中愛德萬甜補充檢驗方法[10]。食品甜味劑用于食品的研究較多，而用于藥品的研究較少[11-12]，目前尚未見愛德萬甜非法添加到藥品糖漿劑的文獻或補充檢驗方法。研究擬在建立高效液相色譜法的基礎上，依據(jù)《測量不確定度評定與表示》等資料[13-16]，試圖對該法進行測量不確定度分析，探討誤差來源及各分量大小，并提出相應建議，以期為減少測量誤差、提高測量準確度提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

乙腈：色譜純，美國默克公司；

其余試劑均為分析純；

超純水：自制；

愛德萬甜標準物質(zhì)：含量97.0%，美國Sigma公司；

小兒止咳糖漿樣品：來源于21家生產(chǎn)企業(yè)共45批次，市售。

1.1.2 主要儀器設備

高效液相色譜儀：Waters alliance e2695型，配有自動進樣器、DAD檢測器，美國沃特斯公司；

電子分析天平：METTLER XS205DU型，瑞士梅特勒—托利多公司；

純化水系統(tǒng)：Millipore Milli-Q Direct 8型，美國密理博公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品溶液的制備 精密量取樣品5 mL至50 mL量瓶，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，棄去初濾液10 mL，取續(xù)濾液。

1.2.2 標準溶液的制備 精密稱取愛德萬甜標準物質(zhì)25.21 mg，置25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液，用10 mL刻度吸管精密量取貯備液0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 mL分別置100 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為標準曲線工作溶液，每1 mL含愛德萬甜約2，5，10，20，50，100 μg。

1.2.3 液相色譜條件 Shiseido AQ-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm) 色譜柱，以乙腈為流動相A，以0.02 mol/L 磷酸二氫銨(用三乙胺調(diào)節(jié)pH至5.5±0.05)為流動相B，梯度洗脫(洗脫程序見表1)，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長214 nm，進樣量10 μL。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

1.2.4 數(shù)學模型建立

P=C×V1/V2，

(1)

式中:

P——樣品中愛德萬甜含量，μg/mL；

C——愛德萬甜在樣品溶液中的質(zhì)量濃度，μg/mL；

V1——樣品定容體積，mL；

V2——樣品量取體積，mL。

1.2.5 不確定度來源分析 分析愛德萬甜檢測方法與含量計算數(shù)學模型，不確定度的主要影響因素有標準溶液制備(包括稱量和稀釋)、標準曲線擬合、樣品溶液制備(包括量取、稀釋、包含隨機誤差的回收率)、樣品測量重復性等。

2 結果與分析

2.1 標準溶液制備不確定度

2.1.1 稱量不確定度 標準物質(zhì)稱量不確定度u(m)來源于稱量誤差u(m1)及稱量重復性u(m2) 2個分量。

合成上述2個分量，得到標準物質(zhì)稱量不確定度：

標準物質(zhì)稱量相對不確定度為u(m)/m=0.010/25=0.000 40。

2.1.2 稀釋不確定度 精密稱取愛德萬甜標準物質(zhì)于25 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容，作為貯備液，再用10 mL 分刻度吸管精密量取不同體積貯備液分別至100 mL 量瓶中，制備系列標準工作溶液，不確定度來源于10 mL刻度吸管誤差、25 mL容量瓶誤差、100 mL容量瓶誤差3個分量。

稀釋的相對不確定度由上述3個分量合成得到：

查閱標準物質(zhì)證書，因未給出賦值的不確定度，故忽略不計。標準溶液制備不確定度由稱量相對不確定度與稀釋相對不確定度合成得到：

2.2 標準曲線擬合不確定度

取質(zhì)量濃度分別為1.956，4.891，9.781，19.56，48.91，97.81 μg/mL 的標準溶液(共6個濃度點)進樣，平行進樣2針，用最小二乘法擬合線性方程y=a+bc及相關系數(shù)(r)[15]。樣品測定9次，樣品中愛德萬甜平均質(zhì)量濃度為73.98 μg/mL。按貝塞爾公式計算標準差：

因此標準曲線擬合帶入的標準不確定度為：

2.3 樣品溶液制備不確定度

用5 mL單刻度移液管精密量取樣品溶液至50 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋定容，取續(xù)濾液即為樣品溶液，故不確定度包含3個分量：5 mL移液管不確定度、50 mL量瓶不確定度、包含人員操作等隨機誤差的回收率不確定度。

(3) 回收率不確定度:分析人員熟練程度、過濾時棄去初濾液的量、過濾時溶劑揮發(fā)等引起的不確定度，通過加標回收試驗評價[15]。按愛德萬甜在樣品中含量的80%，100%，120%分別添加標準溶液測定樣品加標回收率，每個梯度測定3份，共9份，回收率分別為102.4%，102.4%，98.8%，103.6%，104.8%，101.7%，102.1%，101.5%，102.6%，平均為102.2%，RSD為1.7，回收最大值與平均值偏差b+=104.8%-102.2%=2.6%，平均值與最小值偏差b-=102.2%-98.8%=3.4%。則回收不確定度為：

合成上述3個分量，即得到樣品溶液制備不確定度：

2.4 樣品重復測定不確定度

樣品重復測定9次，愛德萬甜含量分別為76.5，77.2，74.3，74.1，72.4，70.4，73.6，74.2，73.1 μg/mL，平均含量為74.0 μg/mL，標準偏差s=2.1。樣品重復測量相對標準不定度為

2.5 合成不確定度

合成標準溶液制備不確定度、標準曲線擬合不確定度、樣品溶液制備不確定度、樣品重復測定不確定度4個分量，即得到該法測定糖漿劑藥品中愛德萬甜含量的不確定度

U(v)=74.0×0.018=1.3 μg/mL。

以95%為置信限，包含因子k=2，計算擴展不確定度U=k×U(v)=2×1.3=2.6 μg/mL。則該批次小兒止咳糖漿樣品中愛德萬甜含量為(74.0±2.6) μg/mL。

2.6 不確定度影響因素分析

綜上，愛德萬甜測量不確定度來源見圖1，各影響因素按大小依次為樣品溶液制備(0.014)、樣品測量重復性(0.009 5)、標準曲線擬合(0.004 9)、標準溶液制備(0.004 3)。標準溶液制備操作步驟簡單，僅包含了容量儀器帶入的系統(tǒng)誤差，不確定分量較小。而樣品溶液制備、樣品測量重復性、標準曲線擬合不僅包含儀器設備帶入的系統(tǒng)誤差，也包括偶然誤差，因此相對較大。試驗時，為確保測定結果準確，應通過控制實驗室溫濕度恒定、使用檢定合格并清潔的器具、調(diào)試儀器設備達到最優(yōu)狀態(tài)、多次重復測定、提高技術人員分析水平等方面減少偶然誤差。

圖1 不確定度來源分析Figure 1 Analysis for source of uncertainty

3 結論

試驗表明,樣品溶液制備引入的不確定度(0.014)最大。高效液相色譜法測定小兒止咳糖漿中愛德萬甜含量的不確定度來源主要有：① 玻璃容器、量器不準確帶入的誤差，為了減少誤差，應使用經(jīng)校準符合要求的玻璃容器、量器，移液管使用前用待量取的溶液潤洗3次以上；② 環(huán)境影響，試驗過程中，盡量保持環(huán)境溫濕度恒定，試驗用的樣品、溶劑、玻璃器皿等放入實驗室一定時間與室溫保持一致，可以有效降低試驗環(huán)境帶入的誤差；③ 試驗人員讀數(shù)誤差，可以通過不斷提高分析人員水平降低誤差；④ 樣品過濾帶入的誤差，微孔濾膜、定量濾紙對待測成分都有一定程度的吸附作用，樣品過濾時，棄去初濾液，使濾膜或濾紙吸附達到飽和后，再接取續(xù)濾液用于試驗，可以有效消除或降低過濾帶入的誤差。