K-115增強自噬調控TGF-β1誘導的人Tenon囊成纖維細胞活化

樊 芳，田凈凈，趙智華，馬清敏，李科軍，賈志旸

作者單位：1(050000)中國河北省石家莊市，河北省人民醫院眼科；2(050000)中國河北省石家莊市，河北省胸科醫院眼科

0引言

青光眼是全球重要的致盲性眼病[1]，我國青光眼的患病人數也在逐年增加。目前阻止青光眼進展唯一有效的方法是控制眼壓。在藥物和激光不能有效降低眼壓的情況下，抗青光眼手術是控制眼壓的重要手段。盡管近年來有很多非濾過道依賴性手術的有效性被證實，但青光眼濾過性手術(glaucoma filtration surgery，GFS)目前仍然是臨床上控制眼壓的經典術式。該手術能有效控制眼壓，但術后濾過區域纖維增殖是導致手術失敗的主要原因。雖然術中應用抗代謝藥物可以控制濾過區域瘢痕化，提高手術成功率，但同時也增加了患者眼表損傷及濾過泡滲漏等并發癥出現的概率[2-4]。因此，GFS術中或術后尋找一種有效且安全的方法，能夠控制術后瘢痕形成且不增加其他并發癥發生率，是值得研究的問題。K-115是一種新型降眼壓藥物，可以通過調控細胞骨架作用減少小梁網阻力，增加小梁網房水流出速率，對開角型青光眼有明確的降眼壓效果[5-6]。研究證實，除了降眼壓作用外， K-115也參與調控GFS術后瘢痕化過程，但是其相關調控機制并不完全清楚[7]。自噬是細胞受到外界刺激后，增強自身的吞噬功能，降解細胞自身有害物質，維持細胞自身穩態的代謝途徑。在肝腎等器官纖維化疾病中自噬已被證實具有重要的調控作用[8-10]。本研究旨在探討K-115調控GFS術后瘢痕化是否受到細胞自噬功能的影響。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1標本收集標本取自2018-09/2019-09于河北省人民醫院眼科行青光眼手術患者的Tenon囊組織，采用組織塊法進行人Tenon囊成纖維細胞(human Tenon’s finroblasts，HTFs)的原代及傳代培養。本實驗遵循《赫爾辛基宣言》，實驗方案經河北省人民醫院醫學倫理委員會審核批準[批準號：2017科倫審第(05)號]，詳細告知患者實驗方案，取得患者同意并簽署知情同意書。

1.1.2主要試劑和儀器設備培養基、胎牛血清、胰蛋白酶、Hanks液(美國Gibco公司)，CCK-8試劑盒(日本Dojindo公司)， 轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)(美國Peprotech公司)，K-115(美國MCE公司)，EMbed 812包埋試劑盒(美國Electron Microscopy Sciences，公司)， Hoechst 33342/PI雙染試劑盒(北京Solarbio公司)。倒置相差顯微鏡(HF100F，日本Nikon公司)，自動多功能酶標儀(Mustikan，芬蘭Labsystem公司)，透射電子顯微鏡(HT7700，日本Hitachi公司)，切片機(UC7，德國Leica公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養和處理在組織塊接種后3～7d可見原代HTFs從組織塊邊緣游出，約2wk達到80%～90%融合，急性傳代培養，經免疫組織化學法鑒定可見波形蛋白陽性表達，角蛋白表達陰性。取第3～6代細胞進行實驗，細胞分為4組：(1)對照組：加入溶劑二甲基亞砜(DMSO)處理；(2)TGF-β1組：加入10μg/L TGF-β1處理24h；(3)TGF-β1+5 K-115組：5μmol/L K-115預處理2h后，加入10μg/L TGF-β1處理24h；(4)TGF-β1+10 K-115組：10μmol/L K-115預處理2h后，加入10μg/L TGF-β1處理24h。由于無血清饑餓是誘導細胞自噬的刺激因素，故本研究未采用無血清培養基培養細胞，以排除無血清饑餓對細胞自噬水平的影響。所有實驗重復至少3次。

1.2.2CCK-8法檢測細胞增殖能力參考試劑盒說明書操作步驟，對數期生長的HTFs以5×103/孔接種于96孔板，每組設6個復孔，細胞分組處理結束后，每孔中加入CCK-8溶液，孵育2h后應用酶標儀在450nm處測量吸光度。為研究單獨應用K-115對細胞增殖的影響，這部分研究增加了僅添加5μmol/L K-115的5 K-115組和僅添加10μmol/L K-115的10 K-115組。

1.2.3劃痕試驗檢測細胞遷移能力對數期生長的HTFs以4×105/孔接種于六孔板中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養24h后應用10μL Tip頭在六孔板中做垂直劃痕，以PBS沖洗去除細胞殘片后，按上述分組方法處理細胞，置于相差顯微鏡下觀察并記錄劃痕距離后再置于37℃、5%CO2的培養箱培養24h后于相差顯微鏡再次觀察并記錄劃痕距離，計算遷移距離百分數，遷移距離百分數=24h劃痕寬度/0h劃痕寬度×100%。

1.2.4透射電子顯微鏡觀察細胞內自噬小體按上述分組方法處理細胞后用0.1mol/L碳酸氫鈉(pH7.4)緩沖液配制的3%戊二醛固定HTFs 1h，然后0.1mol/L磷酸緩沖液配制的1%鍔酸避光室溫固定HTFs 2h。用分級醇脫水后，將細胞滲透包埋于EMbed 812包埋劑中，并在60℃下聚合48h。樹脂塊在切片機上制作切片后用醋酸鈾酰和鉛染色，并于透射電子顯微鏡下觀察。本研究增加了自噬抑制劑3-MA作為自噬陰性對照組即TGF-β1+3-MA組，采用5mmol/L 3-MA預處理細胞2h后，加入10μg/L TGF-β1處理24h，并增加了自噬激動劑雷帕霉素作為自噬陽性對照組即TGF-β1+Rap組，采用100nmol/L雷帕霉素預處理細胞2h后，加入10μg/L TGF-β1處理24h。

1.2.5Hoechst33342染色法檢測細胞凋亡取對數生長期的HTFs接種于6孔板，按上述分組方法處理細胞，并用PBS將處理過的細胞充分洗滌2～3次。將1mL細胞染色緩沖液、5μL Hoechst 33342染色液、5μL PI染色液依次加入各孔中，輕輕搖勻，然后在4℃冰箱中孵育30min。用PBS溶液洗滌1次，置于熒光顯微鏡下觀察。

2結果

2.1細胞增殖能力CCK-8實驗結果顯示，對照組、TGF-β1組、TGF-β1+5 K-115組、TGF-β1+10 K-115組、5K-115組、10 K-115組吸光度值分別為0.98±0.04、1.31±0.06、1.20±0.03、1.00±0.08、0.89±0.06、0.91±0.05，差異有統計學意義(F=56.78，P<0.001)。與對照組相比，TGF-β1組細胞增殖能力顯著增加(P<0.01)；與TGF-β1組相比，TGF-β1+5 K-115組和TGF-β1+10 K-115組細胞增殖能力均降低(P<0.01)，見圖1。此外，與對照組相比，5、10μmol/L K-115均對細胞增殖存在一定的抑制作用(P=0.013、0.043)。

圖1 K-115對TGF-β1誘導的HTFs增殖的影響 bP<0.01 vs 對照組；dP<0.01 vs TGF-β1組。

2.2細胞遷移能力劃痕24h后，對照組、TGF-β1組、TGF-β1+5 K-115組、TGF-β1+10 K-115組細胞遷移距離百分數分別為22.86%±3.05%、4.39%±3.32%、44.56%±4.87%、58.24±4.15%，差異有統計學意義(F=110.32，P<0.001)。與對照組相比，TGF-β1組細胞遷移能力顯著增加(P<0.01)；與TGF-β1組相比，TGF-β1+5 K-115組和TGF-β1+10 K-115組細胞遷移能力均降低(P<0.01)，見圖2。

圖2 K-115對TGF-β1誘導的HTFs遷移的影響。

2.3細胞自噬情況透射電子顯微鏡觀察顯示，與對照組相比TGF-β1組細胞內自噬小體的數量增加，TGF-β1+5 K-115組、TGF-β1+10 K-115組較TGF-β1組細胞內自噬小體數量進一步增加，自噬激動劑雷帕霉素(陽性對照組)顯著促進了TGF-β1誘導的HTFs自噬，而自噬抑制劑3-MA(陰性對照組)則阻斷了TGF-β1誘導的HTFs自噬，見圖3。

圖3 K-115對TGF-β1誘導的HTFs自噬的影響 A：對照組；B：TGF-β1組；C：TGF-β1+5 K-115組；D：TGF-β1+10 K-115組；E：TGF-β1+3-MA組；F：TGF-β1+Rap組。紅色箭頭示自噬小體。

2.4細胞凋亡情況Hoechst 33342/PI染色結果顯示，各處理組幾乎均看不到PI陽性細胞，同時未見明顯的強藍色熒光，提示各組細胞凋亡水平無顯著差異，見圖4。

圖4 K-115對TGF-β1誘導的HTFs凋亡的影響。

3討論

K-115作為一種Rho蛋白激酶的抑制劑，主要通過調控細胞骨架拉伸小梁網進而起到調控眼壓的作用。體外實驗證實K-115可以阻斷TGF-β2誘導的人結膜成纖維細胞活化及膠原表達[7]。另有研究證實局部應用Rho蛋白激酶抑制劑AMA0526可以通過抑制膠原組織在濾過通道的沉積提高實驗性濾過手術的效果[13]。與本研究發現的K-115可能參與調控濾過道瘢痕形成的結論相似。但是針對涉及Rho蛋白激酶抑制劑這一類藥物調控GFS術后瘢痕形成的機制目前還沒有定論，有研究證實Rho蛋白激酶抑制劑Y-27632通過調控TGF-β和MAPK通路抑制GFS術后瘢痕形成[14]，但是細胞因子系統作用錯綜復雜，是否有其他機制參與仍需要進一步研究。

GFS術后濾過道瘢痕形成是影響手術成功率的主要原因。以往研究顯示，在瘢痕形成進程中HTFs起著重要作用，在多種因素的誘導下，HTFs會被誘導活化，活化后細胞的增殖及遷移能力增強，進而加速傷口愈合，促進濾過道的瘢痕形成[11]。在這些刺激因素中TGF-β是促進局部傷口愈合，誘導HTFs活化的重要因子[12]。本研究應用TGF-β1誘導HTFs活化，建立濾過道瘢痕化的細胞模型，進一步觀察K-115對細胞增殖及活化的影響。細胞增殖實驗結果提示K-115可以抑制TGF-β1誘導的細胞增殖，同時劃痕試驗提示K-115可以降低TGF-β1誘導的細胞遷移，提示K-115可能通過抑制細胞增殖、遷移能力進而調控HTFs的活化增殖能力。

本研究發現，TGF-β1組細胞內自噬小體數量較對照組增加，提示在刺激因素TGF-β1的作用下，細胞通過增加自身的自噬能力維持細胞的穩定狀態，同時發現K-115處理組細胞內自噬小體數量較TGF-β1組進一步增多，這與抗代謝藥物雷帕霉素誘導的HTFs內自噬小體增多的現象一致，提示K-115可以增強細胞的自噬能力。自噬是維持自身穩定性的生物學現象，廣泛存在于人體的各個器官。研究證實，細胞的自噬作用在調控器官纖維化的過程中發揮著重要作用，細胞自噬功能缺陷會導致局部膠原大量沉積，促進瘢痕形成，對細胞自噬功能的調控在肝、肺、腎等器官纖維化性疾病的治療中已經顯示出了巨大的潛力[9-11]。自噬在青光眼中的作用也愈來愈受關注，雖然目前的研究多集中在小梁網細胞和神經節細胞[15-18]，但也有部分研究顯示不同藥物可以通過自噬通路調控GFS術后的瘢痕化過程[19-21]。本研究結果提示K-115可以增加TGF-β1刺激而誘導的HTFs自噬，這種自噬功能的增強在維持細胞的穩態及抑制細胞活化方面具有一定的作用，K-115可能參與調控維持HTFs的穩態，進而抑制HTFs的活化增殖及遷移能力。此外，本研究中Hoechst 33342/PI染色實驗未顯示K-115導致細胞凋亡，這和以往抗代謝藥物誘導細胞死亡的抗瘢痕機制不同，為K-115抗瘢痕特性的作用機制提供了參考，但這種抗瘢痕機制還有待進一步在體實驗的研究證實。

綜上，本研究結果證實K-115具有調控HTFs活化的能力，提示其具有調節GFS相關結膜下瘢痕形成的潛在療效，有望成為一種新的抗瘢痕藥物，由于該藥物是一種局部應用的降眼壓藥物，如果抗瘢痕效果能夠得到明確，將成為一種更為簡單便捷的抗瘢痕臨床治療策略。