眼科疾病的生物信息學研究進展

章 爽，高桂平，曾 云

作者單位： 1(448000 )中國湖北省荊門市第二人民醫院眼科；2(330006)中國江西省南昌市，南昌大學第一附屬醫院眼科

0引言

生物信息學是使用計算機對生物信息進行存儲、檢索和分析的科學。重點研究基因組學和蛋白質組學，具體來說就是從核酸和蛋白質序列出發，分析序列中表達的結構功能的生物信息。數據庫是生物信息學的主要內容，常用的數據庫有基因表達綜合(Gene Expression Omnibus，GEO)數據庫，可以利用生物信息學分析方法對GEO數據庫下載的疾病基因和正常人基因庫數據進行差異表達基因(differentially expressed genes，DEGs)分析，并對其進行功能聚類分析、功能富集分析和蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡分析，然后通過蛋白印跡法(Western-blot)和逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)加以驗證，從而得到相應的靶基因并分析其生物學功能以及與臨床之間的聯系。在過去的幾十年中，微陣列技術和生物信息學分析被廣泛應用于篩選基因變化，這有助于我們識別差異表達基因參與眼科疾病發病機制的發生和發展過程。由于基因芯片技術具有高通量、微型化和自動化等特點，能夠對大量生物樣品中的基因平行、快速、敏感、高效地分析，因而在 DNA序列測定、基因表達分析、基因組研究、疾病診斷等方面應用廣泛，這有利于深入了解各種眼科疾病發生、發展所涉及的分子機制，篩選可作為診斷的關鍵基因和藥物治療靶點[1]，特別是為一些眼科腫瘤疾病、遺傳性及炎性眼部疾病的發病機制提供了新的思路。

1生物信息學在眼部腫瘤中的應用

1.1視網膜母細胞瘤視網膜母細胞瘤(retinoblastom，RB)是嬰幼兒最常見的眼內惡性腫瘤，由于致盲率較高，因此也是眼科關注的重點疾病之一。既往研究認為RB基因的缺失或失活是RB發生的重要機制[2]，Cao等[3]通過生物信息學方法分析發現RB是一種高度異質性腫瘤，細胞周期相關基因表達水平與RB的進展相關，而 LRRC39基因可能是RB進展亞型生物標記物。Huang等[4]通過生物信息學方法發現DGPDC1、NDC80、SHCBP、TOP2A和DLGAP5可能參與RB的發生、侵襲及復發過程，這進一步揭示了RB發病及轉移可能發生的機制。Wu等[5]研究發現，在RB抑癌基因失活的情況下人類MYCN的過度表達會引起糖體相關基因的過度表達，從而促進細胞過度增殖，導致具有間變性變化的RB，證明除了RB基因的缺失或失活外，MYCN的過度表達也是發病的一大因素，這進一步完善了RB的發病機制。而張艷等[1]通過RB基因表達譜芯片進行生物信息學分析研究發現，在篩選出的正常視網膜組織與RB組織間下調的DEGs中，CNGA1、CNGB1、RHO、SAG等差異基因主要與光傳導信號通路有關，這可能為RB發病機制提供了思路。因此，我們考慮RB與正常視網膜組織差異基因傳導通路可能與光信號傳導有關，這進一步引發思考，與正常視網膜相比，這種差異表達基因所引起的光感受器表達減少是否與疾病的嚴重程度相關值得深入探索。因此通過生物信息學技術幫助篩選除RB基因以外的其他診斷的關鍵基因，不僅完善了RB的發病機制，還為尋找RB生物診斷標記物及藥物治療靶點提供了幫助。

1.2脈絡膜黑色素瘤脈絡膜黑色素瘤(choroidal melanoma，CM)是成年人最常見的眼內惡性腫瘤，由于惡性程度高，易發生轉移，危害性大，因此研究其發病機制對于CM的及時有效治療非常有意義。劉然等[6]運用生物信息學方法對CM基因進行篩選及驗證發現，miR-147a可以通過靶向調控微小染色體維持蛋白3(minichromosome maintenance protein 3，MCM3)的表達，從而抑制人侵襲性脈絡膜黑色素瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。聶愛芹等[7]通過生物信息學方法分析發現BAPI可以作為轉錄因子進而調控脈絡膜黑色素瘤細胞的遷移。此外，應曼曼等[8]研究發現，miR-9-5p也能抑制脈絡膜黑色素瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，從而促進脈絡膜黑色素瘤細胞凋亡，并通過調節CDH1、CTNNA1和ITGA6表達發揮調控作用，上述研究進一步完善了CM的發病機制，并為評估CM增殖程度提供幫助。Zhao等[9]通過生物信息學和相互作用分析方法分析轉移相關富集信號通路發現，上調的DEGs主要通過核糖體和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑參與蛋白質合成和細胞增殖過程；下調的DEGs主要通過磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K-Akt)信號通路參與減少細胞間黏附和促進細胞在細胞外基質中遷移的過程，這一發現為葡萄膜黑色素瘤轉移機制提供了參考。聶愛芹等[7]研究發現，轉移葡萄膜黑色素瘤差異表達基因主要富集在血液凝固途徑，且與腫瘤轉移呈正相關，以往認為腫瘤的轉移與新生血管有關，這一發現進一步揭示了凝血級聯過程與腫瘤浸潤轉移也有聯系，為腫瘤轉移途徑提供了新思路。因此通過生物信息學先篩選出差異基因后，再與分子驗證相結合的模式，可避免盲目的實驗，費時費力，生物信息學有助于有效分析差異基因的表達情況及相應蛋白表達通路，從而確定臨床信息的相關性。

1.3淚腺腺樣囊性癌淚腺腺樣囊性癌(adenoid cystic carcinoma of the lacrimal gland，LACC)是最常見的惡性上皮性淚腺腫瘤，通常由于骨和神經周圍浸潤而預后不良[10]，研究表明約50%的患者在5～10a內發生局部復發和遠處轉移[11-12]，然而淚腺癌中的分子遺傳學機制仍有待闡明。Jiang等[13]通過生物信息學方法分析發現miR-140-3p及其靶基因可能在LACC高級別轉化發病機制中起著重要作用；此外，該研究構建了一個基于微陣列競爭性內源性RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)的circRNA-miRNA-mRNA-ceRNA網絡，這可能有助于確定LACC高級別轉化中新的針對微小RNA(microRNA，miRNA)的治療靶點。此外，有研究表明miR-24-3p在LACC組織中下調，并通過下調蛋白激酶C表達促進P53/P21途徑，從而抑制LACC細胞增殖、遷移和侵襲[14]。Hao等[15]研究表明，與健康人相比，LACC患者的組織和血漿中miR-93-5p過度表達，且miR-93-5p通過調節Wnt信號通路靶向下調乳腺癌轉移抑制因子-1蛋白，從而促進LACC細胞遷移、侵襲和增殖。這些差異基因的過度表達與細胞增殖、遷移、侵襲相聯系，這為研究LACC的惡性程度提供了新的見解，并為診斷或治療策略的確定提供了潛在的生物標志物，有助于進一步分析LACC的分子遺傳學機制。

2生物信息學在眼底病中的應用

2.1糖尿病視網膜病變糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是最常見的視網膜血管病，是50歲以上人群主要的致盲疾病之一，然而目前用于DR早期檢測的生物標志物仍然缺乏。Liu等[16]在生物信息學分析的基礎上確定DR涉及的關鍵分子特征，在糖尿病大鼠和高糖處理的視網膜細胞模型中獲得743個DEGs，這些差異基因多與晶狀體分化、胰島素抵抗和高密度脂蛋白膽固醇代謝相關，通過富集通道及PPI網絡分析發現氯離子通道、視黃醇代謝和脂肪酸代謝的動態基因表達改變參與大鼠DR過程，且H3K27m3修飾在DR早期調節多數DEGs的表達，這一探索及發現將為DR提供不同的治療策略。Shi等[17]通過RNA測序結合生物信息學工具發現miR-26a-5p是早期視網膜神經變性的潛在生物標志物，它可能通過影響視網膜細胞的功能參與DR的發展，這一發現為視網膜神經病變的靶向治療提供了思路。Liang等[18]通過生物信息學中的RNA測序和qRT-PCR確定了早期檢測DR的特異性循環miRNA生物標記物，并驗證miRNA(hsa-let-7a-5p、hsa-miR-novelchr5_15976、hsa-miR-28-3p)在區分糖尿病伴DR與不伴DR患者中，其敏感性和特異性較強，同時推測這3個miRNA標記物可以作為DR的非侵入性生物診斷標記物。這一發現對內分泌醫生及糖尿病患者提供了幫助，通過血清學基因標記物提前篩選糖尿病患者眼部并發癥，這將有助于早期進行眼科醫生會診，從而發現DR病變并防止DR的進展。Pan等[19]研究中，通過生物信息學的方法篩選出增殖型DR與非增殖型DR血液樣本差異表達基因，并從中挑選了6個基因，并基于這6個基因的表達構建了一個組合分子標記，發現這一標記物可作為早期檢測糖尿病患者增殖型DR的潛在生物標記物，可見生物信息學在眼科的應用為相關研究的開展提供了便利。Trotta等[20]研究發現血清中的一些循環miRNA(hsa-miR-195-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-20b-5p、hsa-miR-27b-3p和hsa-miR-451a)與視網膜內高反射點之間的相關性，通過生物信息學分析發現這些miRNA與屬于“腫瘤壞死因子α信號”通路的靶基因相關聯，這些miRNA被證實為預后生物標記物，這一發現對于DR預后判斷及探索潛在的藥理學靶點提供了幫助。通過生物信息學的方法將基因與具體的發病機制聯系起來，有利于探索疾病進展后相應功能及解剖形態變化，這將為未來確定DR早期診斷標記物提供幫助，同時有利于基因靶向藥物的研發，為治療DR提供了新思路。

2.2視網膜色素變性視網膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)是一組遺傳性眼病，屬于光感受器細胞及色素上皮營養不良性退行性病變。臨床上以夜盲、進行性視野縮小、色素性視網膜病變和光感受器功能不良為特征。RP具有遺傳異質性和臨床異質性，隨著基因組學的發展，越來越多的手段用于RP致病基因的篩查。周曉敏等[21]通過眼科基因芯片測序方法快速排除了RP常見候選基因，雖然未定位致病基因，但為進一步分析奠定了研究基礎。Dan等[22]通過生物信息學分析、Sanger測序的方法對中國76個無血緣關系的RP變異基因進行篩選，發現43個家族的15個基因中存在致病變異，基因測序的廣泛應用進一步揭示了RP的發病機制。Ng等[23]通過全外顯子組測序分析發現了RP患者13個新的變異體，8個新的錯義變異體，且這些變異在不同物種中保持不變。Zhang等[24]通過全外顯子組測序發現SNRNP200的過度表達可能會導致視網膜受損，這一基因突變可能與RP發病機制相關。另有研究通過Sanger測序及PCR技術發現CYP4V2基因復合雜合突變與RP發病機制相關聯[25]。此外，二代測序技術(next-generation sequencing，NGS)的廣泛應用在腫瘤臨床診斷及遺傳性疾病篩查中發揮著積極作用[26-27]。Carrigan等[28]使用NGS技術觀察發現SLC24A1等基因突變與RP相關。因此測序技術不僅是基因組學的重要研究手段和工具，也是驅動精準醫學得以實現的技術之一。因此，測序技術的迅速發展將為遺傳性視網膜疾病的早期診斷提供幫助，也可以使得更多的先天性疾病的發生被合理避免。

3生物信息學在青光眼疾病中的應用

3.1青光眼早期階段青光眼早期主要表現為視野改變(鼻側階梯狀缺損，旁中心暗點，生理盲點擴大)、眼底改變(神經纖維層局限性缺損，盤沿局限性切跡及視乳頭放射狀出血)及眼壓升高。早期青光眼臨床癥狀可能不明顯從而容易被患者忽視，如何早期發現青光眼，對于預防青光眼的發生發展非常重要。方娜[29]研究通過青光眼基因芯片進行生物信息學分析，篩選出與該疾病相關的DEGs，并對其進行功能注釋、通路分析和PPI網絡分析，最終篩選出5個關鍵基因(Alb、Ⅱ4、C3、Anxa1、Gnai2)，推測這5個關鍵基因通過補體及凝集途徑參與早期青光眼過程，這一生物信息學分析為探索青光眼發生、發展的分子機制提供了理論基礎。此外，劉靜坤等[30]通過生物信息學方法推測Tyrp1基因可能是青光眼早期高眼壓的生物學指標，這為探索早期青光眼高眼壓對視乳頭損害的發病機制及相關通路提供了思路。Liao等[31]從GEO數據庫下載GSE2378基因表達庫對有青光眼和無青光眼供體的星形膠質細胞進行分析，并經過基因功能及富集分析，同時使用MSigDB檢測轉錄因子的潛在靶點，結果發現這些DEGs主要參與細胞表面、分子結合、蛋白質活性變化和信號轉導，涉及最重要的途徑是癌癥途徑。同時發現小分子萬古霉素可以模擬青光眼的細胞狀態，推測青光眼可能不僅由視神經細胞病變本身引起，而且可能是由免疫力下降引起的感染所致，這一發現為青光眼的治療及靶向藥物的研究提供了新的突破。

3.2原發性開角型青光眼原發性開角型青光眼(primary open angle glaucoma，POAG)是一種由于眼壓升高而致視盤、視網膜神經纖維層損害，視野缺損的眼病，是不可逆性致盲性眼病之一[32]，由于多數患者早期可無任何自覺癥狀，常常到晚期視功能嚴重損害時才發現。Zhou等[33]利用生物信息學GEO數據庫篩選出DEGs，相互作用網絡由PPI網絡分析列出，通過Western-blot和RT-PCR加以驗證，結果發現腺苷A3受體的過度表達降低了小梁網組織的活力和遷移，但上調了細胞外基質蛋白的表達，腺苷A3受體的過度表達可能會加重小梁網氧化應激損傷，這一發現可能為POAG的發生、發展提供了分子理論基礎。Zhang等[34]使用GSE2378數據集對比青光眼患者及正常人視神經組織基因，發現青光眼患者的3種基因(重組骨形態發生蛋白-1、杜氏肌營養不良癥基因、有絲分裂原誘導的GTP結合蛋白基因)表達較正常人降低，而這些基因參與某些重要代謝過程。Zhou等[35]利用GEO數據庫研究發現，POAG患者與健康對照者之間存在差異表達的lncRNAs及mRNAs。Vishal等[36]采用全基因組方法發現，MPP-7在小梁網細胞中大量表達，且在循環機械應力下，小梁網中MPP-7顯著下調，這一發現使得MPP-7成為POAG的一個新的候選基因。此外，也有研究證實肌纖蛋白(MYOC)基因過表達可能和小梁網細胞外基質相結合，增加房水外流阻力，從而使得眼壓增高，導致POAG的發生[37]。這些基因在POAG的異常表達可引起小梁網的損害，提示可進一步分析更詳細的蛋白通路，從而阻斷該過程的發生，這也為POAG發病機制的研究提供了新的思路。

4生物信息學在白內障疾病中的應用

4.1先天性白內障先天性白內障是兒童視力障礙或失明的常見原因，具有遺傳異質性和臨床異質性。先天性白內障是指出生前后即存在或出生后1a內逐漸形成的先天性或發育障礙導致的白內障。兒童視覺發育的關鍵時期是0～3歲，由于先天性白內障發現較晚，是導致兒童失明和弱視的重要原因。Shao等[38]通過生物信息學分析發現，免疫反應、防御反應可能在tudor結構域-7缺陷所致先天性白內障的發生發展中具有重要作用。Yuan等[39]通過外顯子組測序和Sanger測序在periaxin基因中發現了1個錯義突變體，該突變可能與先天性白內障有關，這一發現為先天性白內障患者晶狀體發育異常的發生機制提供了理論基礎。Ma等[40]通過目標基因的富集和Sanger測序鑒定先天性白內障家族中的致病突變，發現先天性白內障家族中GJA3基因發生重復雜合非同義突變。另有研究通過靶向外顯子測序發現先天性白內障存在c.443C突變[41]及p.K228fs230X[42]突變，這為先天性白內障的研究提供了遺傳分子依據，拓展了變異譜，有助于更好地理解先天性白內障發病的分子機制。莊曉彤等[43]通過生物信息學方法對DNA和蛋白質序列及空間結構分析，探討先天性白內障的可能發生機制，結果發現CRYGD基因堿基第452位插入GACT 4個堿基，發生了移碼突變，突變后等電點的變化影響晶狀體細胞內的pH值，導致功能結構域變短，蛋白質內部重復性變化，從而影響晶狀體蛋白功能，該突變為首次報道的由插入突變引起先天性白內障的CRWD基因移碼突變。靶向外顯子組測序是一種快速、經濟高效、高通量的基因篩選方法，可用于先天性白內障的常規基因診斷，為研究其功能及其參與白內障的發病機制提供了思路。

4.2糖皮質激素性白內障糖皮質激素引起的白內障多見于長期口服或滴用糖皮質激素所致。白內障的發生與用藥量和時間有密切關系，糖皮質激素可通過促進晶狀體上皮細胞向間質細胞轉化，從而導致后囊下白內障的形成。閆楚凡等[44]關于糖皮質激素性白內障的生物學分析發現，1μmol/L地塞米松可對人晶狀體上皮細胞株HLE-B3細胞的增生產生負性調控作用，而miR-15abc、miR-214、miR-23abc、miR-129-5p、miR-132和miR-24基因可能是糖皮質激素作用的靶點，表明激素對晶狀體細胞增生的調控作用可能與濃度有關。此外，有研究表明，miR-29a可以靶向抑制糖皮質激素受體mRNA的表達，同時其本身的表達量又依賴糖皮質激素受體的激活，形成一個負反饋回路，這一特點在糖皮質激素治療過程中有助于減緩糖皮質激素受體水平的降低[45]，為糖皮質激素性白內障的治療提供了新思路。

5生物信息學在葡萄膜炎疾病中的應用

Vogt-小柳原田綜合征(Vogt-Koyanagi-Harada syndrome，VKH綜合征)是一種涉及自身免疫的全葡萄炎疾病，主要影響全身黑色素細胞，包括眼睛、腦膜、耳朵、皮膚和頭發[46]，該綜合征中的葡萄膜炎主要表現為反復發作的慢性肉芽腫性炎癥[47]。近些年，蛋白質組學為識別參與正常和病理過程的分子提供了重要工具[48]。Mao等[49]使用無標記蛋白質組學方法研究了活動性VKH綜合征患者中差異表達的膜蛋白，Western-blot技術用于驗證，蛋白質組學結果顯示活動性VKH綜合征患者CD4+T細胞中CD18和AKNA的表達顯著降低。張新橋等[50]研究通過生物信息學方法篩選出的差異表達的miRNA基因本體注釋(gene ontology analysis，GO)及 KEGG富集通路分析結果顯示，差異表達miRNA參與多種信號通路，其中 miR-106b、miR-130b等處于較為核心位置，而這些基因與一些風濕免疫疾病相關聯，這進一步揭示了VKH綜合征與免疫疾病相關，研究具體的關聯基因為今后的治療拓展了思路。此外，可以通過生物信息學方法檢測VKH綜合征患者治療前后相應基因的表達及轉錄情況，這將進一步揭示VKH綜合征的發病機制，但需要更多的臨床試驗加以驗證。

6生物信息學在翼狀胬肉疾病中的應用

翼狀胬肉是一種常見的眼表疾病，受多種因素的影響。翼狀胬肉的病因尚不清楚，而遺傳因素和環境因素均是導致翼狀胬肉的原因。研究表明，除了紫外線暴露、風塵等因素，TLR3表達、核轉錄因子-κB(NF-κB)活化[51]也是翼狀胬肉發生的因素。此外，有研究發現RhoA/ROCK信號可以通過MRTF-A調節轉化生長因子(TGF)-β1誘導的人翼狀胬肉成纖維細胞纖維化作用，這對翼狀胬肉的發生也起著一定的作用[52]。Jiang等[53]通過免疫沉淀測序、RNA測序和生物信息學分析發現N6-甲基腺苷修飾對翼狀胬肉的發育具有重要作用，這一發現可能成為未來翼狀胬肉治療的潛在新靶點。Xu等[54]基于生物信息學分析對翼狀胬肉功能基因進行鑒定，發現LINC00472在競爭性內源性RNA網絡中可以通過調控PID FOXM1通路從而參與翼狀胬肉的發生發展。He等[55]采用微陣列及生物學分析發現TGF-β和表皮生長因子(EGF)可以通過miR-199a-3p/5p-DUSP5/MAP3K11軸誘導結膜上皮細胞的上皮-間質轉化。徐玉亭等[56]研究發現，miR-486-3p基因在翼狀胬肉組織中的相對表達量相對正常結膜組織明顯升高，通過生物信息學方法對其靶基因進行預測發現miR-486-3可能通過Axon guidance通路導致翼狀胬肉的新生血管異常。此外，Zhang等[57]通過基因表達薈萃分析發現翼狀胬肉和瞼板腺功能障礙數據集之間存在重疊DEGs，其在角質化、細胞周期調節、細胞凋亡途徑中顯著富集，表明翼狀胬肉和瞼板腺功能障礙具有共同基因特征，角質化相關通路可能在這兩種疾病的發展中發揮重要作用。上述生物信息學分析有助于對翼狀胬肉相關基因進行進一步蛋白通路分析，為進一步開展的關于翼狀胬肉的研究奠定了基礎。

7展望與小結

目前，生物信息學通過對疾病組織和正常組織進行DEGs篩選，并對其進行功能注釋信號通路分析和PPI網絡分析，從而揭示疾病的發生、發展和預后的分子機制。通過生物信息學研究，眼科疾病中越來越多的靶向基因被發現，如非編碼RNA可作為年齡相關性黃斑變性(ARMD)生物標志物和治療靶點，有益于未來靶向藥物的研發[58]；同時，越來越多的眼科疾病發病過程中所涉及的信號通路及代謝改變被發現[1，30，44，56]，利用生物信息學方法富集出差異表達基因的功能及代謝通路，了解眼科疾病狀態下基因表達高低所調節的功能改變方向，有利于更精準地分析疾病發生過程中所涉及的異常信號傳導通路。雖然生物信息學為實驗研究提供了簡單快捷的方法，有助于從基因及蛋白質層面研究生命的本質，但是目前仍然存在諸多不足：(1)由于不同的軟件或數據庫會得出不同的研究結果，很難評估研究結果的準確性及優缺點；(2)蛋白質或RNA的高級結構很難預測，多數方法只能分析一對蛋白質是否相互作用，只有一小部分方法能夠精確構建其三元結合復合物；(3)一些陰性數據可能被忽視或丟棄，而沒有被收集到公共存儲庫中，這可能出現假陰性的概率[59]，故生物信息學所研究的結果可能并不能完全反映真實信息。生物信息學并不是萬能的，在探索的道路上還有很多盲區，需要大量研究去證實，未來可通過公開及融合多種數據資源，部署高性能計算模型去構建更有效的生物信息學在線預測平臺。此外，如何利用生物標志物系統性研究蛋白質與蛋白質間的相互作用也依然是個挑戰[60]，因此，未來也需要從多分子層面出發，了解基因、mRNA、蛋白質和小分子之間的相互作用，從而更好地探索眼科疾病的發病機制[61]。

綜上所述，生物信息學技術在眼科疾病應用廣泛，特別體現在相應眼科疾病靶基因和早期診斷標志物的篩選上，相應疾病由于早期癥狀不明顯，往往不利于疾病的發現，而在這些癥狀出現前，體內的一些信號通路可能在相關基因驅動下已表現出異常。因此，可以首先對某疾病進行生物信息學分析，在明確有關靶基因的表達情況、相應蛋白通路后，先做理論推測，再行實驗驗證，最終應用到臨床實踐。此外，生物信息技術還有利于靶向藥物的精準給藥，從而降低藥物的無效使用及藥物毒副作用，使得基因組科技成果能夠更好地服務于精準醫學實踐。