HLA-B27陽(yáng)性與陰性葡萄膜炎患者外周血中炎癥因子表達(dá)研究

王洪亞，鄭 文，戴永剛，周瑋琰，孫進(jìn)學(xué)

作者單位：1(250031)中國(guó)山東省濟(jì)南市，山東省立第三醫(yī)院檢驗(yàn)科；2(250021)中國(guó)山東省濟(jì)南市，山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院眼科

0引言

葡萄膜炎是一種臨床上可以導(dǎo)致嚴(yán)重視力下降的疾病，是全球排名第五位的致盲眼病。該病發(fā)病年齡多較為年輕，對(duì)個(gè)人家庭以及國(guó)家影響較大。因此，葡萄膜炎的診斷、治療及發(fā)病機(jī)制越來(lái)越受到重視。其類型眾多，確切發(fā)病機(jī)制至今尚不完全清楚，目前普遍認(rèn)為自身免疫紊亂所致的葡萄膜炎是其中最為常見和重要的類型[1]。所以目前大量的研究力求從免疫學(xué)的角度探討其詳細(xì)的發(fā)病機(jī)制。近年來(lái)人白細(xì)胞抗原-B27(human leucocyte antigen-B27,HLA-B27)被認(rèn)為與葡萄膜炎的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系[2]，HLA-B27陽(yáng)性的葡萄膜炎患者被認(rèn)為比陰性患者發(fā)病更早且更易復(fù)發(fā)，但是目前這兩類患者的具體發(fā)病機(jī)制區(qū)別尚未明確，因此我們的研究對(duì)這兩類葡萄膜炎患者的外周血中的炎癥因子進(jìn)行相關(guān)研究，旨在探討其可能的發(fā)病機(jī)制，為尋求新的診斷及治療方法提供依據(jù)。

1對(duì)象和方法

1.1對(duì)象回顧性研究。選取2020-01/2022-04山東省立第三醫(yī)院初診的葡萄膜炎患者76例。所有納入研究的病例均具有不同程度的眼紅、眼痛、畏光、流淚、視物模糊等臨床表現(xiàn)，裂隙燈檢查可見不同程度的瞳孔縮小或后黏連、前房閃輝、角膜后見呈塵狀或羊脂狀的沉著物(keratic precipitates，KP)、睫狀體充血、晶狀體表面色素沉著。納入標(biāo)準(zhǔn)：初發(fā)病例，經(jīng)專業(yè)眼科醫(yī)生確診為葡萄膜炎。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)近1mo內(nèi)服用免疫抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑、糖皮質(zhì)激素、抗生素等者；(2)合并眼部外傷史或其他眼部疾病反復(fù)發(fā)作史者；(3)合并感染性疾病者。本研究采用廢棄的檢測(cè)后標(biāo)本，經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合倫理要求。研究期間所有研究對(duì)象的個(gè)人信息均保密，征得患者及家屬知情同意。

1.2方法采集所有患者空腹靜脈血置于EDTA-K2抗凝試管中，所有標(biāo)本均于當(dāng)天應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)完成HLA-B27的檢測(cè)。將剩余標(biāo)本提取全血RNA，用RT-qPCR方法檢測(cè)炎性指標(biāo)：白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、蛋白酶激活受體2(PAR2)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素增強(qiáng)因子3(ILF3)。

1.2.1儀器與試劑HLA-B27檢測(cè)使用的流式細(xì)胞儀為美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司生產(chǎn)8色(CytoFLE)。HLA-B27-FITC/HLA-B7-PE檢測(cè)試劑盒和溶血素為美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特生產(chǎn)的配套試劑。采用Trizol試劑提取全血總RNA，炎癥因子mRNA檢測(cè)引物合成于上海生工，具體序列如表1所示，RT-qPCR使用的是羅氏LightCycler 480Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR儀器及其配套試劑。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HLA-B27 向檢測(cè)管中依次加入10μL檢測(cè)抗體和50μL的EDTA-K2抗凝外周血，振蕩混勻后置于室溫避光處孵育15min，然后每管加入0.5mL溶血素，混勻后避光孵育10min，加入0.5mL 0.9%生理鹽水，振蕩混勻后2000r/min離心5min，棄掉上清液，加2mL 0.9%生理鹽水，振蕩混勻后2000r/min離心5min，棄掉上清液，每管加0.5mL 0.9%生理鹽水，振蕩混勻后流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)分析。CytoFLEX流式細(xì)胞儀通過(guò)FSC和SSC雙參數(shù)圖圈定淋巴細(xì)胞亞群設(shè)門，然后分析淋巴細(xì)胞中HLA-B7-和HLA-B27+細(xì)胞群的百分比，比例≥90%判讀為陽(yáng)性，比例≤5%判讀為陰性。

1.2.3全血RNA的提取混勻全血后，吸取200μL全血和1mL Trizol試劑充分混合，反復(fù)用槍吹打和劇烈震蕩以裂解細(xì)胞，在15℃～30℃下放置20min；在上述體系中加入200μL氯仿，用力震蕩15s，充分混勻，在15℃～30℃放置5min，4℃、12000g離心15min；將上層水相置于新EP管中，加入等量遇冷的異丙醇，在-20℃放置2h以上，4℃、12000g離心30min充分沉淀RNA；棄上清，每管加入1mL預(yù)冷的DEPC水配制的75%乙醇進(jìn)行洗滌，渦旋混合，4℃、12000g離心15min，棄上清，讓沉淀的RNA在室溫在自然干燥；用Rnase-free water溶解RNA沉淀，并用A260/A280檢測(cè)RNA純度。純度在1.800～2.000之間，濃度在200～500ng/μL。

2結(jié)果

2.1兩組患者一般資料比較本研究共納入葡萄膜炎患者76例，采集靜脈血分離有核細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)(直接免疫熒光法)檢測(cè)HLA-B27(圖1)，分成HLA-B27陽(yáng)性組(≥90%)35例(男19例，女16例)，平均年齡44.26±14.31歲，HLA-B27陰性組(≤5%)41例(男15例，女26例)，平均年齡42.46±13.71歲。兩組患者一般資料比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.39，P=0.12；t=0.56，P=0.58)。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HLA-B27 A：陽(yáng)性；B：陰性。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物一覽表

2.2兩組患者外周血中炎癥因子mRNA表達(dá)量的比較采用RT-qPCR檢測(cè)GAPDH和各炎癥因子的mRNA，得到△Ct，公式為△Ct=各炎癥因子Ct-GAPDH Ct，故△Ct越小，基因表達(dá)量越高。HLA-B27陽(yáng)性組比HLA-B27陰性組中IL-6 mRNA的表達(dá)高，HLA-B27陽(yáng)性組比HLA-B27陰性組中ILF3 mRNA的表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，IL-1β、IL-10、PAR2、TNF-α mRNA表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 兩組患者外周血中炎癥因子mRNA表達(dá)量(ΔCt)的比較

3討論

葡萄膜炎是一種作用于虹膜、睫狀體、玻璃體以及視網(wǎng)膜等多個(gè)眼內(nèi)組織器官的中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病，是目前最為復(fù)雜和疑難的眼科疾病之一，其治療多較為困難，若治療不及時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致患者視力的永久喪失[3]。人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)是目前發(fā)現(xiàn)的具有多態(tài)性的一類抗原系統(tǒng)，包括A、B、C、D、DR、DP和DQ7個(gè)位點(diǎn)[4]。自1973年首次報(bào)道葡萄膜炎與HLA-B27有關(guān)系以來(lái)，人們對(duì)HLA-B27抗原與葡萄膜炎研究越來(lái)較多，目前發(fā)現(xiàn)多類葡萄膜炎和HLA有著密切關(guān)系[5-6]。其中非感染性葡萄膜炎可以分為HLA-B27抗原陽(yáng)性和陰性兩大類。HLA-B27抗原陽(yáng)性葡萄膜炎因病程進(jìn)展快、易復(fù)發(fā)、并發(fā)癥多且多伴有脊柱關(guān)節(jié)病變等原因[7]，得到了眼科醫(yī)生的極大重視。關(guān)于其流行病學(xué)和臨床特征已有不少的報(bào)道，但是其具體發(fā)病機(jī)制原因及相關(guān)危險(xiǎn)因素研究不是很多，其確切的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全清楚。目前已知炎癥因子與葡萄膜炎發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，本研究主要分析了白細(xì)胞介素(interleukin，IL)、蛋白酶激活受體2(protease activated receptor 2，PAR2)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素增強(qiáng)因子-3(interleukin enhancer-binding factor -3，ILF3)在HLA-B27抗原陽(yáng)性和陰性兩組葡萄膜炎患者中的表達(dá)情況，我們通過(guò)流式細(xì)胞儀將來(lái)我院就診的葡萄膜炎患者分為HLA-B27抗原陽(yáng)性和陰性兩組進(jìn)行相關(guān)分析，兩組患者年齡及性別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，我們通過(guò)檢測(cè)外周血中的上述炎癥因子來(lái)試圖找到兩組患者的發(fā)病機(jī)制區(qū)別。通過(guò)研究我們得出：(1)IL-6上調(diào)。HLA-B27陽(yáng)性組IL-6的mRNA ΔCt為9.27±1.29,較陰性組10.51±1.32明顯降低(P<0.05)，表明IL-6基因表達(dá)HLA-B27陽(yáng)性組明顯高于陰性組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL是一種在體內(nèi)調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)的炎癥因子，其中IL-6是一種多功能細(xì)胞因子，在炎癥和免疫反應(yīng)中和IL-1具有類似的作用，在急性炎癥初始階段IL-1分泌產(chǎn)生，然后刺激IL-6的分泌，兩種因子共同作用促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，引起炎癥劇烈反應(yīng)[8]，是炎癥反應(yīng)的正相關(guān)因子。Kramer等[9]發(fā)現(xiàn)急性期葡萄膜炎患者外周血IL-6水平明顯升高，治療穩(wěn)定后其水平明顯下降。Shim等[10]發(fā)現(xiàn)下調(diào)IL-6表達(dá)可以使Behcet小鼠模型炎癥反應(yīng)降低。以往有文獻(xiàn)報(bào)道，在兒童葡萄膜炎及多種類型葡萄膜炎中，患者眼內(nèi)液均可檢測(cè)出IL-6的表達(dá)升高。我們的研究也驗(yàn)證了上述的結(jié)論。在研究發(fā)現(xiàn)IL-6較IL-1β及IL-10在HLA-B27陽(yáng)性的葡萄膜炎患者中起著更重要的作用，可以作為陽(yáng)性患者治療的一個(gè)新的靶點(diǎn)及指導(dǎo)病情發(fā)生發(fā)展變化的作用因子。(2)ILF3下調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)HLA-B27陽(yáng)性組患者ILF3 mRNA ΔCt為8.21±0.83,明顯高于HLA-B27陰性組7.26±0.54，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。該因子在葡萄膜炎患者中的表達(dá)及相應(yīng)作用目前尚未見報(bào)道。ILF3是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種與免疫相關(guān)的新基因，文獻(xiàn)報(bào)道在一些免疫相關(guān)疾病中其表達(dá)異常，是一類免疫增強(qiáng)因子[11]。ILF3蛋白在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用，是白細(xì)胞介素起作用所需重要的轉(zhuǎn)錄因子，白細(xì)胞介素依賴其來(lái)發(fā)揮相應(yīng)作用[12-13]。文獻(xiàn)報(bào)道在CD4+T細(xì)胞上誘導(dǎo)ILF3基因DNA甲基化，會(huì)引起血液中IL6等炎性因子的濃度降低[14]，意味著抑制ILF3的活性，可能會(huì)降低人體內(nèi)的炎癥反應(yīng)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)敲除巨噬細(xì)胞上的ILF3基因，能夠顯著降低IL-6和TNF-α等炎癥因子的產(chǎn)生。而ILF3的過(guò)度表達(dá)則可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子。另外，葡萄膜炎中多種炎癥因子形成一個(gè)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，各個(gè)因子互相間有著影響，我們的研究結(jié)果表明在HLA-B27陽(yáng)性患者中ILF3起著一定作用，結(jié)合我們發(fā)現(xiàn)IL-6在陽(yáng)性患者中表達(dá)升高，我們猜測(cè)，ILF3表達(dá)的降低可能與IL-6升高后對(duì)ILF3的反向抑制有關(guān)系，當(dāng)然，具體的原因可能需要在后期的進(jìn)一步研究中證實(shí)。(3)IL-1β、IL-10、TNF-α、PAR2表達(dá)量沒(méi)有明顯差異。IL-1的主要生物學(xué)作用由存在于體液中的IL-1β介導(dǎo)[15]。IL-1β是由巨噬細(xì)胞分泌的炎性因子，可以對(duì)體內(nèi)大部分細(xì)胞產(chǎn)生炎性反應(yīng)、免疫應(yīng)答[16]，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生多種炎癥因子，然后增強(qiáng)炎性因子的活性,加重炎性反應(yīng)。已有文獻(xiàn)報(bào)道IL-1β在葡萄膜炎中的作用十分關(guān)鍵，因子檢測(cè)可以發(fā)現(xiàn)葡萄膜炎患者中其水平明顯增高，同時(shí)伴隨疾病的進(jìn)展其表達(dá)可以反應(yīng)性增高[17]。IL-10是由炎癥細(xì)胞分泌產(chǎn)生的一種具有免疫抑制活性的細(xì)胞因子，可以減輕炎癥反應(yīng)。能有效抑制Th1細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL、TNF等細(xì)胞因子，從而降低單核巨噬細(xì)胞的抗原呈遞作用[18-19]。文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)IL-10在葡萄膜炎后期升高，這可能與炎癥的消退有著關(guān)系，而應(yīng)用重組IL-10蛋白治療大鼠葡萄膜炎模型，發(fā)現(xiàn)治療組大鼠玻璃體內(nèi)IL-6和IL-8明顯下降[20]。Commodaro等[19]觀察發(fā)現(xiàn)恢復(fù)期小柳原田綜合征患者外周血中IL-10明顯表達(dá)升高。但是這三種白細(xì)胞介素在HLA-B27抗原陽(yáng)性的葡萄膜炎患者中的表達(dá)變化情況目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。PAR2是G蛋白耦聯(lián)受體(protease activated receptors，PARs)的家族成員，目前被認(rèn)為在調(diào)控炎癥反應(yīng)中起著作用，幾乎表達(dá)于所有細(xì)胞，其生理功能廣泛，參與血栓形成、止血、誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生發(fā)展，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)其在感染、免疫炎癥性疾病、纖維化疾病中有著重要作用。有文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中，PAR2激動(dòng)劑可以促進(jìn)患者的外周血單核細(xì)胞分泌的IL-6表達(dá)顯著升高。同時(shí)在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中發(fā)現(xiàn)PARs可通過(guò)成纖維細(xì)胞、單核細(xì)胞、T細(xì)胞、肥大細(xì)胞等多種細(xì)胞發(fā)揮促炎作用，而抑制PARs活化可緩解該免疫性疾病發(fā)生發(fā)展[21]。但是目前該因子在非感染性葡萄膜炎中尤其是HLA-B27抗原陽(yáng)性的葡萄膜炎患者中的表達(dá)情況及作用尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。兩組表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示在該疾病中此因子可能并非和IL-6為同一通路。TNF是一種Garswell等于1975年發(fā)現(xiàn)的炎癥因子，其中TNF-α主要由單核巨噬細(xì)胞合成、其分泌后可以逆向激活單核巨噬細(xì)胞，誘使單核巨噬細(xì)胞分泌炎性介質(zhì)殺滅病原體，同時(shí)其還可以提高性中粒細(xì)胞吞噬功能[22]。TNF-α被發(fā)現(xiàn)在葡萄膜炎發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，應(yīng)用外源性TNF-α可加重大鼠葡萄膜炎的病程。Pérez-Guijo等[23]發(fā)現(xiàn)葡萄膜炎患者房水和血清中TNF-α水平明顯高于對(duì)照者。大量的文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)在急性期Behcet病患者血清及房水中TNF-α水平明顯高于緩解期患者和健康對(duì)照者，其水平變化與炎癥嚴(yán)重程度相關(guān)。該因子在葡萄炎中有著重要作用，但是我們的研究發(fā)現(xiàn)在HLA-B27抗原陽(yáng)性及陰性兩組患者中TNF-α mRNA均有表達(dá)，但是兩組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并無(wú)明顯差異。證實(shí)該因子可能并非HLA-B27抗原陽(yáng)性葡萄膜炎患者的獨(dú)特致病因素。

總之，本研究證實(shí)了HLA-B27陽(yáng)性相關(guān)的葡萄膜炎患者外周血中IL-6表達(dá)上調(diào)，ILF3表達(dá)下調(diào)，IL-1β、IL-10、PAR2、TNF-α表達(dá)無(wú)明顯差異。提示我們IL-6及ILF3在HLA-B27陽(yáng)性表達(dá)的葡萄膜炎的發(fā)生發(fā)展中有一定作用，可以作為治療靶點(diǎn)來(lái)指導(dǎo)疾病的診療。目前來(lái)說(shuō)針對(duì)病因復(fù)雜，治療困難的葡萄膜炎，單單研究某個(gè)炎癥因子的表達(dá)變化情況雖然可以一定程度反映其機(jī)制及功能，但是所得結(jié)果比較局限，與我們?cè)谂R床診療中有不少的差距。因此，對(duì)復(fù)雜的葡萄炎患者炎癥因子集合及相關(guān)網(wǎng)絡(luò)的研究有著重要的作用，同時(shí)炎癥因子網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性，也提示我們?cè)谂R床診療中，需綜合考慮多種炎癥指標(biāo)的變化。本研究對(duì)炎癥因子在HLA-B27陽(yáng)性葡萄膜炎中的表達(dá)變化情況的研究，不僅能進(jìn)一步揭示該病的免疫學(xué)機(jī)制，而且也為進(jìn)一步探討新的治療方法提供靶點(diǎn)及依據(jù)。

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