金納米團簇在生物成像中的應用研究*

羅 杰，趙靈芝，楊 曦，楊改玲，高 瑞，胡毓琛

(西安醫學院藥學院，陜西 西安 710021)

金(Au)是一種貴金屬，在自然界中常以單質存在，具有化學性質穩定、易于處理和制造、極高的抗腐蝕性等特點。當其直徑降低到2 nm 時，被稱為金納米團簇(Au nanoclusters，Au NCs)，簡稱金簇。金簇是一種由幾個到幾十個金原子組成的納米材料，由于其直徑接近電子的費米波長，具有獨特的光學、電學和化學性質，如：斯托克位移大、光穩定性好、和較長的熒光壽命等。此外，金簇低毒性、生物相容性好，從而使其在生物成像和生物傳感領域具有明顯優勢[1-4]。本文將對金簇與尺寸相關的發光原理、合成方法，以及金簇作為納米探針應用于生物成像研究進行綜述。

1 金簇與尺寸相關的發光原理

金屬的物理和化學性質與其尺寸大小有著密切的聯系。大塊金是良好的光學反射器和導體，但是通常表現出非常微弱的發光，這是由于塊狀金屬的電子能級是連續的，從而導致沒有能量間隙以及有效的非輻射衰減造成的[5]。當金的尺寸減小1～100 nm成為金納米粒子[6](Gold nanoparticles,Au NPs，簡稱納米金)時，電子的運動受到納米粒子尺寸的限制，并且主要與表面發生相互作用。納米金由于表面等離子體共振效應而呈現出強烈的顏色，其光學特性來自于傳導電子與光相互作用后發生的集體振蕩。納米金通常具有較強的吸光性，但它們并不或僅表現出微弱的發光。如直徑為5～20 nm的納米金水溶液呈現酒紅色，其特征吸收波長在520 nm左右，表現出微弱的熒光。當金納米粒子尺寸繼續降低(約2 nm)，變成僅有幾個原子構成的金納米團簇[7]時，其連續能級譜帶分裂成離散能級，電子的集體振蕩受到阻礙，因而金簇不再引起表面離子體共振效應，但電子仍在能級間躍遷與光相互作用，顯示出明亮的熒光。金簇的發光一般與電子躍遷有關：其一，在已占據的 d 軌道和費米能級之間的電子躍遷；其二，最高占用軌道(HOMO)和最低占用軌道(LUMO)之間的電子躍遷[8]。不同尺寸的金簇具有不同的能級間隙，因而需要不同能量的激發光，從而得到不相同的熒光發射光譜。近期，關于金簇的熒光性質與其尺寸和表面配體密切相關的報道顯示，通過改變它們的核心尺寸可使金簇的熒光發射波長發生改變，粒徑越大，發光光譜逐漸紅移。Dickson等[9]通過此法將金簇的熒光發射波長從近紅外區域調整到紫外區域，他們制備出組成和其對應熒光發射波長分別為Au5(385 nm), Au8(455 nm), Au13(510 nm), Au23(760 nm), 和Au31(866 nm)的納米簇。與銅簇和銀簇相比，金簇的熒光強度十分穩定，不易受環境中的還原劑和氧化劑等物質的影響。這些優越的光學性質使金簇多次應用于分析檢測和生物成像方面，為多個領域的開發和實際應用提供可行方案。

2 金簇的制備方法

貴金屬光致發光已被發現多年[10]，但由于量子產率極低(僅有10-10)，一直未引起人們的重視。近年來，研究人員開發了多種方法用來制備量子產率在10-3～10-1范圍內具有熒光顯著增強的水溶性金簇，從而使其具有足夠的亮度用于熒光標記應用。一般情況下，通過將水溶液中金離子還原為零價金原子產生的是納米金而非金簇，這是由于金簇易聚集造成的。此外，用于覆蓋金簇表面的配體的性質也顯著影響其發光性能。因此，選擇合適的穩定劑能穩定金簇防止其聚集并增強其熒光至關重要。通常使用一些配體作為模板對金簇進行表面改性，這其中包括硫醇分子[11-14]、樹枝狀大分子[15-16]、聚合物[17]、DNA 寡核苷酸[18-19]、肽以及蛋白質[20-22]等物質。由于金簇的光學性質與其尺寸有著密切關系，覆蓋在金簇表面的模板或配體不僅影響金簇的幾何形狀，還提供合適的條件以避免金簇聚集成大納米粒子從而改變結構影響其熒光性能。因此，合成高量子產率的金納米團簇，關鍵是選擇合適的模板或配體。所選模板或配體不僅要防止金納米簇團聚，還要考慮到它們對金簇熒光的影響。

3 金納米簇在細胞成像中的應用

近年來，生物兼容性好、小尺寸且發光性能好的金簇作為新型熒光探針多次應用于細胞成像等方面。通過對其表面配體進行修飾后可得到不同性能的金簇，在配體上連接具有靶向識別功能的分子后，金簇具有靶向檢測癌細胞且可應用于癌細胞成像。例如，葉酸偶聯金簇已被廣泛應用于葉酸過量表達的癌細胞成像。例如：Astilean等[23]采用葉酸功能化金簇對人類卵巢癌細胞靶向熒光成像；此外，Kong等[24]偶聯維生素B12到核糖核酸酶A穩定的金簇，基于該納米探針，對人類結腸癌Caco-2細胞靶向成像。三苯基膦(TPP)是一種離域親脂陽離子，容易通過磷脂雙分子層并在活細胞線粒體中積累。因此偶聯TPP到殼聚糖穩定的金簇可用于對細胞內線粒體成像[25]。Su等[26]基于RGD序列(由精氨酸、甘氨酸和天門冬氨酸組成)對富含整合素的腫瘤細胞具有較高的親和力，將其設計進入多肽序列，并以此為模板合成的金簇可自組裝形成納米纖維結構，該金簇復合材料發光增強了近70倍，具有21.3%的量子效率，同時RGD序列的存在可用于癌細胞靶向成像。Lin等[27]報道了硫辛酸保護的金簇，通過其表面的羧基將含氨基的鏈酶抗生素蛋白修飾于金簇表面，可用于標記肝癌細胞。Ghosh的團隊[28]報道了以苯硼酸和巰基丙酸作為配體合成金簇，由于苯硼酸和癌細胞表面的黏蛋白特異性識別，將其應用于癌細胞選擇性成像。此外，以蛋白質為模板制得的金簇可直接用于選擇性標記被蛋白質特異性識別的細胞。例如，轉鐵蛋白功能化的金簇對過量表示轉鐵蛋白受體的細胞(如A549肺腫瘤細胞)具有高親和力[29]。

利用它們良好的細胞成像特性，金簇也被應用于細胞內環境中重要生理事件的成像。例如，一種通過包裹染料分子二氧化硅顆粒與金簇組裝的新型納米復合材料[30]，被用于活細胞中高活性氧(highly reactive oxygen Species，hROS，·OH, ClO-和 ONOO-) 成像。這種復合材料表現出單一波長激發和雙波長發射, 565 nm波長發射的紅光來自于金簇,其可被存在hROS有效地猝滅；在435 nm波長發射的藍光來自于二氧化硅納米粒子，其熒光發射不受hROS的影響,從而為熒光法實時反映細胞內hROS提供一個內部參考。該金簇納米復合材料載入細胞效率高，選擇性熒光猝滅，光穩定性好可用于長時間成像觀察，這些特性使該金簇復合材料可用于長時間監測活細胞中hROS，顯示出監測細胞內生理事件的巨大優勢。

此外，將腫瘤細胞與氯金酸溶液共孵育，腫瘤細胞內的高還原性物質可實現胞內金簇的原位形成，原理如圖1所示。Wang等[31]原位形成金簇一方面最終集中在細胞核周圍，可提供精確的細胞成像。該現象不會發生在非癌變的細胞里(如：人類胚胎肝細胞)，具有較高的選擇性。這種胞內原位形成金簇無需外界注入納米粒子即可實現腫瘤細胞特異性熒光自標記；另一方面有研究指出[41]胞內原位合成的金簇能顯著抑制PI3K-AKT信號通路，從而有效抑制腫瘤的發展。這種簡便有效的體內腫瘤靶向治療技術，將有助于在未來的臨床應用中有效治愈癌癥。

圖1 細胞內原位合成金簇及其應用于細胞成像 原理示意圖[31]Fig.1 Schematic illustration of in situ biosynthesis of gold nanoclusters in cells imaging[31]

4 金納米簇在活體成像中的應用

與細胞系和體外成像研究相比，使用動物模型的體內成像面臨額外的挑戰。這是由于其復雜性增加，可見光通過生物組織與各種生物分子相互作用，從而導致透射光減少以及發光材料發生降解。生物組織在近紅外光范圍僅表現出微弱的吸收/散射和自發熒光，因而金簇的近紅外發光性能使它們作為新型造影劑多次用于活體腫瘤熒光成像。在早期的研究中，Wu等[32]第一次報道了近紅外發射牛血清蛋白修飾的金簇BSA-AuNCs用于體內腫瘤成像。研究表明，這些BSA-AuNCs在腫瘤區域積累到高水平，表現高度的腫瘤靶向性，這歸結于腫瘤細胞和正常細胞通透性和保留性的差異。鑒于此，金簇被多次應用于活體小鼠腫瘤組織成像研究。Sancey等[33]評價超小型金簇在光學圖像引導手術中的應用潛力。他們合成了以兩性離子或聚乙二醇為配體包覆的金簇，對荷瘤小鼠靜脈注射金簇用于測定其藥代動力學特性以及研究金簇在荷瘤小鼠身體的分布情況。研究情況表明，表面缺乏特異性靶向配體的金簇，細胞載入率低；但在體內，靜脈注射后能快速到達腫瘤部位，說明金簇在影像引導腫瘤手術研究中十分有潛力。

多模態成像，即兩種或多種提供互補信息的成像模式的結合，具有顯著的優勢。因此，近年來基于金簇作為多模態成像探針應用于體內成像受到了廣泛的關注[34-36]。例如：甲狀腺癌作為最常見的內分泌惡性腫瘤，發病率高，缺乏雙重模式精確診斷的成像方法。對于甲狀腺癌的雙模態熒光/計算機斷層掃描(CT)成像，Chen等[34]以牛血清白蛋白(BSA)和氯胺-T為原料合成碘化BSA-AuNCs復合材料，合成原理如圖2所示，并以此作為雙模態探針。實驗結果表明，這些碘化BSA-AuNCs不僅具有超小的體積和優異的生物相容性，而且表現出優良的熒光/CT成像特性。一方面它們的熒光發射光譜在近紅外區，能夠準確和選擇性地顯示甲狀腺癌，該發光材料可分辨微小的甲狀腺癌，小到2～3 mm；在注射較長時間后仍有熒光信號顯示，且腫瘤和其他組織的熒光對比，腫瘤細胞處的熒光逐漸加強，其他部位的熒光逐漸減弱。另外在CT成像方面，其性能可以與臨床CT造影劑相媲美。碘基制劑在吸收x射線方面是有效的，但它們的循環壽命很短，而且非特異性分布和潛在的腎臟毒性限制了它們的應用。金比碘具有更高的x射線吸收系數，單位質量的對比度約高2.7倍。因此，金簇的強x射線衰減使其成為多模態成像的良好選擇，有望成為一種應用于臨床醫學的納米探針。

圖2 以牛血清白蛋白和氯胺-T為原料合成碘化 BSA-AuNCs復合材料并以此作為雙模態探針 用于活體熒光/CT成像示意圖Fig.2 Schematic illustration of the preparation of AuNCs@BSA-I and biological function for in vivo synergistic dual-modality fluorescence and CT imaging

熒光、CT和MR成像方式各有優缺點，與CT成像相比，磁共振MR成像具有較低的空間分辨率，但對軟組織有較高的敏感性。因此，一個探頭內結合這三種方式可以幫助推進傳統診斷，可準確識別疾病部位，即多模態顯像劑比單模態顯像劑能提供更多的腫瘤信息，因此是腫瘤診斷的理想方法。Peng等[37]以釓離子(Gd3+)介導表面富有羧基的金簇自組裝成單分散球形納米顆粒，基于該納米材料可實現熒光/MR/CT三模態成像。由于金簇和釓離子的共存，形成的納米材料在近紅外熒光成像中熒光強度進一步增強，在CT成像中表現出高的X射線衰減，在磁共振成像中表現出合理的r1弛豫。金簇和釓離子復合材料在體內外均具有良好的生物相容性,并對A549荷瘤小鼠也具有獨特的近紅外熒光/CT/MR成像能力。Xu等[38]以BSA-AuNCs和氧化釓的復合粒子作為三模態顯像劑。經過葉酸修飾后，金簇可以特異性識別腫瘤細胞，并允許異種移植瘤的活體光學、MR和CT成像。通過三種方式的比較可以清楚了解到體內腫瘤的構造和相關信息，這一切均表明金簇在腫瘤和其他組織生物成像有良好的應用前景，在腫瘤多模式臨床診斷中具有巨大的潛力。

5 結 語

金納米團簇作為一類新型的發光納米材料，它們體積小、毒性低，具有良好的生物相容性和熒光特性，逐漸成熟的應用于生物成像研究。隨著金納米團簇在多領域應用的深入，相關技術研究也面臨著較多的挑戰。其一，與半導體量子點和許多有機染料相比，目前報道的大多數金簇量子產率低，還不能夠滿足實際熒光檢測的需要；其二，金簇的光學性質與其尺寸和分散性密切相關，而大多數金簇粗產品常表現出的粒度不均勻性，導致其光學性質的巨大差異。在合成過程中很難做到有效精確調控金簇的組成、尺寸和分散性，進而準確調控金簇的熒光發射峰位置和發光強度。目前，金簇還未進入大規模的投資使用，但是發展簡單、綠色、低成本合成光學性能優異的金簇，并以此為探針研究出更多快速、靈敏度高、特異性強的檢測方法更能適應當代社會高效、快節奏的分析需求。近年來，研究者通過各種策略(包括化學共軛、靜電相互作用、自組裝、配體交換等作用)對金簇進行修飾，以及將金簇與其他納米材料(包括碳納米材料、其他金屬簇、金屬氧化物、金屬有機框架化合物等)進行復合，控制金簇的結構、尺寸和分散性，從而提高金簇發光的量子產率。此外，通過其他材料與金簇復合可使其成為多功能光學探針，使金簇在生物醫學領域具有更多發展和應用潛力。