高粱GATA基因家族的全基因組鑒定及表達分析

宋迎輝，朱燦燦，代書桃，秦娜，王春義，張真，李君霞，平西栓

(1.河南省農業科學院糧食作物研究所，河南 鄭州 450002；2.洛寧縣農業技術推廣服務中心，河南 洛寧 471700；3.河南省農業技術推廣總站，河南 鄭州 450002)

GATA轉錄因子是一種轉錄調節蛋白，包含一個典型的Ⅳ型鋅指DNA結合域CX2CX17~20CX2C和一個后續保守區域，這類鋅指的一些成員在基因的調控區域特異性地結合DNA序列(A/T)GATA(A/G)，從而調節基因的轉錄水平。從細胞黏菌到脊椎動物的生物體中都發現了該基因家族成員[1]。

Reyes等[2]對擬南芥和水稻的GATA家族基因進行研究發現，GATA家族基因DNA基序與光依賴和硝酸鹽依賴的轉錄調控有關。真菌GATA因子調控氮代謝、光誘導、鐵載體生物合成和配對類型轉換[3]。旁系同源GATA轉錄因子GNC和CGA1/GNL受光、氮和細胞分裂素的調控，同時也受赤霉素信號的抑制[4]。在許多研究報道中對不同作物GATA轉錄因子家族進行了全基因組的鑒定分析，分別在擬南芥(Arabidopsis thaliana)[5]、水稻(Oryza sativaL.)[6]、大豆(Glycine max)[7]、棉花(Gossypium genus)[8]、甘藍型油菜(Brassica napus)[9]、谷子(Setaria italica)[10]、番茄(Solanum lycopersicon)[11]、葡萄(Vitis viniferaL.)[12]、蓖麻(Ricinus communisL.)[13]和毛竹(Phyllostachys edulis)[14]中鑒定出了29、28、64、179、96、33、30、19、19、31個成員，為其在其他作物中的結構和生物學功能研究提供了參考。

高粱(Sorghum bicolor)是世界第五大禾谷類作物，廣泛種植于全球干旱和半干旱地區。也是我國主要的雜糧作物之一，是傳統釀造業，尤其是高端白酒釀造的主要原料。高粱具有光合效率高、抗旱耐澇、耐鹽堿等諸多優良性狀，同時也是研究甘蔗、玉米和柳枝稷等能源作物的重要模式作物[15]。2009年，高粱全基因組測序完成；2017年，高粱基因組序列得到進一步完善[16]，許多基因家族的鑒定和功能研究迅速展開[17－21]。但目前尚未見有關高粱GATA家族全基因組鑒定的報道。本研究利用分子生物學技術在全基因組水平上鑒定高粱GATA家族成員，并對其進行生物信息學分析，為探究高粱GATA家族基因功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 高粱GATA基因家族成員的鑒定

GATA基因家族典型鋅指結構域種子序列(PF00320)從Pfam網站(http://pfam.xfam.org/)下載，并以PF00320的HMM模型為探針序列，利用HMMER 3.3軟件搜索高粱基因組功能蛋白序列數據庫，E值小于1×10－10。當同一基因對應多個蛋白序列時，僅保留氨基酸長度最長的序列作為GATA基因家族成員。進一步利用SMART(http://smart.embl.de/)在線工具驗證GATA保守結構域的完整性，利用DNAMAN軟件(https://www.lynnon.com)分析保守結構蛋白序列。利用ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)對最終篩選出的氨基酸序列進行在線分析，以確定蛋白的氨基酸長度、分子質量、等電點、疏水性平均值等理化特性。

1.2 高粱GATA家族基因的染色體分布

提取高粱GATA家族基因的已知基因組位置信息，利用Mapinspect軟件繪制染色體分布圖。

1.3 高粱GATA家族基因系統進化與基因結構分析

將所有的高粱GATA蛋白與從PlantTFDB網站下載的擬南芥、玉米和谷子GATA蛋白序列通過ClustalX 2.0軟件進行多重序列比對，然后用MEGA 11.0軟件以鄰接法(Neighbor joining，NJ)構建進化樹，Bootstrap replications設置為1 000，其他參數默認。

從數據庫中提取鑒定到的GATA基因結構注釋信息，利用GSDS(http://gsds.gao－lab.org/)在線軟件分析高粱GATA基因的結構。

1.4 高粱GATA蛋白保守基序(Motif)分析

利用在線保守基序分析軟件MEME(http://meme-suite.org/tools/meme/)進行Motif分析，參數中預測數目設置為8，其余均為默認設置。

1.5 高粱GATA基因啟動子順式調控元件分析

從NCBI基因組數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)獲取每個SbGATA基因起始密碼子上游2 kb序列，上傳至PlantCARE服務器(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)搜索預測，分別統計每個SbGATA基因啟動子檢測到的順式作用元件數量，利用MeV4.9軟件繪制熱圖。

1.6 高粱GATA家族基因在不同組織中的表達模式分析

高粱不同組織中GATA轉錄組測序數據來自Phytozome(https://phytozome.Jgi.doe.gov/pz/)，用FPKM(fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments)值表示基因相對表達水平，利用MeV 4.9軟件繪制熱圖。

1.7 干旱處理下的基因表達分析

選擇常規種豫粱10號在溫室中用Hoagland營養液進行水培，待幼苗長至三葉一心時，在處理中加入PEG6000模擬干旱處理，并分別于0、12、24、36 h取樣，通過轉錄組測序的方法獲得基因相對表達量，變化倍數用FC表示，用Log2FC表示基因相對表達量變化情況。

2 結果與分析

2.1 高粱GATA家族基因的鑒定、理化性質及染色體定位分析

經比對共鑒定出30個高粱GATA基因，根據其染色體位置分別命名為SbGATA1~SbGATA30。高粱GATA基因編碼的氨基酸數量差異較大，最多可以編碼547個氨基酸(SbGATA23)，最少編碼125個氨基酸(SbGATA9)，平均編碼345個氨基酸。高粱GATA基因編碼蛋白分子質量在13 611.44~59 298.79 ku，平均為36 559.86 ku。等電點平均值為8.02，SbGATA4、SbGATA5、Sb-GATA11、SbGATA13、SbGATA16、SbGATA20、Sb-GATA26、SbGATA30等電點小于7.0，呈酸性；Sb-GATA2等電點約為7.0，接近中性；其余21個高粱GATA蛋白等電點大于7.0，呈堿性。不穩定系數50.54~80.91，均為不穩定蛋白(>40)；疏水性平均系數均為負數，表明高粱GATA蛋白均為親水性蛋白(表1)。

表1 高粱GATA基因家族成員基本信息

30個高粱GATA基因家族成員不均勻地分布在8條染色體上，2號和7號染色體上無SbGATA基因分布(圖1)。其中，1號染色體上的基因數量最多，有8個基因；其次是3、4、8、9號染色體，各有4個基因；5、6、10號染色體上各有2個基因。根據Holub[22]對基因簇的界定，本研究中30個SbGATA基因沒有形成基因簇分布，說明串聯重復不是SbGATA基因家族擴展的主要因素。

圖1 高粱GATA基因在染色體上的分布

2.2 高粱GATA蛋白系統進化、保守序列分析

將鑒定到的高粱GATA基因家族成員氨基酸序列與擬南芥、玉米和谷子的GATA基因家族成員氨基酸序列進行比對(圖2)，根據已知擬南芥GATA基因家族成員進化分類信息對高粱GATA基因家族進行分類(圖3)，可將高粱GATA基因家族分為4組(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)，其中Ⅰ組包含15個家族成員，占總數的1/2，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組分別包含9、4、2個家族成員，同組內GATA成員之間蛋白序列一致性較高。Ⅲ組4個成員SbGATA3、SbGATA4、SbGATA18、SbGATA30的保守鋅指結構域為CX2CX20CX2C，其他基因家族成員保守鋅指結構域為CX2CX18CX2C；Ⅳ組兩個成員SbGATA5和SbGATA20保守結構域蛋白序列完全一致。

圖2 SbGATA蛋白家族保守序列比對分析

2.3 不同作物GATA蛋白系統進化分析

對4種不同作物的126個GATA基因家族成員，包括高粱30個、擬南芥29個、玉米36個和谷子31個，構建系統進化發育樹，如圖3所示，可將GATA基因家族分為4個分支，分支Ⅰ含有高粱GATA家族成員15個，擬南芥GATA家族成員14個，玉米GATA家族成員20個，谷子GATA家族成員15個；分支Ⅱ中高粱、擬南芥、玉米、谷子GATA家族成員分別為9、10、10、9個；分支Ⅲ含高粱和谷子GATA家族成員各4個，擬南芥、玉米GATA家族成員各3個；分支Ⅳ中高粱、擬南芥、玉米、谷子GATA家族成員分別為2、2、3、3個。

對4種作物GATA家族成員保守結構域分析發現，分支Ⅲ中全部GATA家族成員均為CX2CX20CX2C鋅指結構，而其他分支GATA家族成員保守結構域為CX2CX18CX2C鋅指結構。

除分支Ⅰ中SbGATA6和擬南芥GATA蛋白AT3G45170.1親緣關系較近外，其他擬南芥GATA家族成員多單獨聚為一類，表明高粱GATA家族基因與單子葉植物玉米和谷子GATA的親緣關系較近，與雙子葉植物擬南芥GATA的親緣關系較遠。

2.4 高粱GATA基因結構分析

高粱GATA家族基因含有1~8個外顯子(圖4)，其中Ⅰ組SbGATA13和SbGATA17含有1個外顯子；SbGATA15、SbGATA19含有3個外顯子，其他11個GATA基因含有2個外顯子。Ⅱ組GATA基因含有2~3個外顯子。Ⅲ組中SbGATA18含有3個外顯子，SbGATA3、SbGATA4和SbGATA30含有7~8個外顯子。Ⅳ組中SbGATA5和SbGATA20分別含有6個和8個外顯子。說明同組中GATA家族成員基因具有很強的一致性。

圖4 高粱GATA家族基因結構分析

2.5 高粱GATA蛋白的保守基序(Motif)分析

如圖5所示，將鑒定的8個保守基序命名為Motif1~Motif8。Motif1為CX2CX18~20CX2C鋅指結構域，所有高粱GATA蛋白均含有Motif1。同一組的高粱GATA家族成員具有相似的保守基序，除Motif1外，Ⅰ組中15個GATA家族成員均含有Motif2；Ⅱ組中9個家族成員只含有Motif1；Ⅲ組中SbGATA3、SbGATA4和SbGATA30含有Motif4和Motif7，SbGATA18含有Motif4的部分保守序列(結果未展示)；Ⅳ組中SbGATA5和SbGATA20均含有Motif5和Motif8。

圖5 高粱GATA家族蛋白保守基序分析

2.6 高粱GATA順式調控元件分析

如圖6所示，鑒定到的脅迫相關順式元件主要包括ABRE(脫落酸響應元件)、ARE(厭氧誘導響應元件)、CAT－box(分生組織表達)、CGTCAmotif(茉莉酸甲酯響應元件)、G－box(光響應元件)、LTR(低溫響應元件)、MBS(干旱誘導響應元件)、O2－site(醇溶蛋白代謝調控元件)、RY－element(種子特異調控元件)、TC－rich(防御措施響應元件)、TCA－element(水楊酸響應元件)、WUNmotif(機械傷害響應元件)和circadian(晝夜節律控制元件)。

圖6 高粱GATA家族基因順式調控元件分析

多數高粱GATA家族成員都含有ABRE、ARE、CGTCA－motif和G－box元件。SbGATA2和SbGATA26中G－box和ABRE檢測量高于其他家族成員，SbGATA5中未檢測到ABRE和G－box，SbGATA6中未檢測到ABRE，其他GATA家族成員中均至少有一個ABRE和G－box。SbGATA11檢測到RY－element元件7個，SbGATA22中CATbox和SbGATA15中LTR分別檢測到5個，明顯高于其他家族成員。

30個SbGATA家族成員中共檢測到492個主要順式調控元件，其中，光響應元件G－box數量最多，共檢測到116個；其次為ABRE，檢測到105個；CGTCA－motif和ARE分別檢測到70個和48個；CAT－box、LTR、MBS、O2－site、RY－element、TC－rich、TCA－element、WUN－motif、circadian分別檢測到24、23、24、12、21、9、16、17、10個。表明高粱GATA家族基因可以響應低溫、干旱、光強和光周期等多種逆境條件。

2.7 高粱GATA家族基因的表達分析

2.7.1 不同生長發育時期組織中的表達 由圖7可知，Ⅰ組SbGATA19在各組織中無表達；SbGATA15在花分化期至成熟期下部葉片和葉鞘中表達量較高；SbGATA16除在幼苗期葉片、花分化期花序梗和成熟期干籽粒中表達量較低外，在其他組織中表達量均較高。Ⅱ組中SbGATA29在幼苗期和花分化期葉片中表達量較高；SbGATA9和Sb-GATA25除在圓錐花序、花序梗和干籽粒中表達量較低外，在其他組織中表達量均較高；SbGATA1和SbGATA12花分化期圓錐花序和花序梗中表達量較高。Ⅲ組中SbGATA30在成熟期干籽粒中表達量較高。Ⅳ組中SbGATA5和SbGATA20兩個基因除在成熟期干籽粒中幾乎無表達外，在其他組織中均有不同程度表達，SbGATA20在不同組織中表達量均較高。總體上，Ⅲ組和Ⅳ組中SbGATA基因家族成員表達量較高。表達分析表明SbGATA基因家族在高粱生長發育中發揮著重要作用。

圖7 高粱GATA家族基因在不同生長發育時期組織中的表達分析

2.7.2 干旱脅迫下的表達 轉錄組分析發現，只有當高粱幼苗模擬干旱處理36 h時，與對照相比，SbGATA11和SbGATA26上調表達，其他時間段其他GATA家族基因表達無差異，說明SbGATA11和SbGATA26基因可能在高粱響應干旱脅迫時發揮重要作用(圖8)。

圖8 高粱GATA家族基因在干旱處理下的表達分析

3 討論與結論

本研究從高粱基因組中鑒定出30個GATA成員，其中，26個蛋白序列包含CX2CX18CX2C鋅指結構域，與擬南芥[23]和水稻[24]等作物的研究結果一致，而SbGATA3、SbGATA4、SbGATA18和Sb-GATA30的保守鋅指結構域為CX2CX20CX2C。這些基因不均勻地分布在8條染色體上，1號染色體上基因數最多(8個)，2號、7號染色體上未鑒定到SbGATA基因。

SbGATA蛋白均為不穩定的親水蛋白，有21個呈堿性，8個呈酸性；編碼125~157個氨基酸，

分子質量13 611.44~59 298.79 ku。這些差異可能使其具有不同的生物功能。系統進化分析發現，高粱GATA家族成員可分為4組，與單子葉植物玉米和谷子的GATA親緣關系較近，與雙子葉植物擬南芥的GATA親緣關系較遠；同一組的SbGATA基因結構和蛋白保守基序一致性高，而不同組的SbGATA基因外顯子數量差異較大，UTR結構長度差異明顯。

SbGATA蛋白含有多種順式作用元件，可以調控對低溫、干旱、厭氧、光強和光周期等非生物脅迫的響應，并參與調控脫落酸、茉莉酸甲酯、水楊酸等激素信號傳導。部分基因在分生組織表達、醇溶蛋白代謝調控、防御措施響應、機械傷害響應及種子特異調控元件有響應位點，但不能說明都可以有效結合并影響表達，而且調控方向未明。

表達分析發現，SbGATA15在花分化期至成熟期下部葉片和葉鞘中表達量較高；SbGATA29在幼苗期和花分化期葉片中表達量較高；SbGATA1和SbGATA12在花分化期圓錐花序和花序梗中表達量較高；SbGATA30在成熟期干籽粒中表達量較高；SbGATA16、SbGATA9、SbGATA25和SbGATA20在多數組織中表達量均較高。Zhang等[25]在水稻中發現一個GATA轉錄因子，可以增加水稻耐冷性，在所有組織中均有表達，在圓錐花序中表達量最高。本研究也發現多個SbGATA基因有低溫響應位點，SbGATA16和Ⅲ組、Ⅳ組的6個基因在圓錐花序中表達量較高。馬鈴薯GATA基因的組織定位研究也發現，StGATA9基因主要表達于葉維管束的韌皮部和莖維管束系統[26]，StGATA12基因在馬鈴薯根、莖、花和葉中均有表達，在花中的表達量最高[27]。盧成達等[10]研究發現，谷子GATA家族成員可以響應干旱脅迫、缺氧脅迫、光強及光周期等多種逆境條件，參與生長素、赤霉素、水楊酸等激素信號傳導調控。玉米GATA家族成員在熱脅迫處理后，表達上調的基因有9個，可能在應答熱脅迫過程中發揮重要作用[28]。以上研究說明GATA轉錄因子對植物的抗逆性調控具有重要作用，進一步研究高粱GATA基因功能，對充分了解高粱抗逆性及抗逆育種都具有重要意義。