57份小麥微核心種質苗期耐鹽鑒定及分子標記評價

宋楠，陳家婷，郭慧娟，常利芳，張樹偉，陳芳，李欣，張曉軍，暢志堅，喬麟軼

（1.山西大學 生命科學學院，山西 太原 030006；2.山西農業大學 農學院，山西 太原 030031）

小麥（Triticum aestivumL.）是世界上種植面積最大的糧食作物之一，為人類生存提供基本食物保障[1]。目前，育種家采用品種改良方法可使小麥單產每年提高約0.9%，但隨著全球人口增長以及對糧食需求的增加，小麥單產增長速率需要達到2%以上[2-3]，才能滿足人類社會發展需求，因此，進一步發掘小麥增產潛力迫在眉睫。土壤鹽漬化是影響小麥生長發育和產量形成的主要非生物脅迫之一。當前，全球土壤面積有10%發生鹽漬化，其中，我國土壤鹽漬化面積達3.6×107hm2[4]，嚴重制約小麥增產，因此，廣泛發掘耐鹽種質用于小麥品種抗逆性改良是利用鹽堿地擴大小麥種植面積和提高鹽堿地小麥單產的最經濟有效途徑之一。近年來，國內外小麥耐鹽種質篩選與品種改良逐漸被科學界重視。KHAN等[5]對24份小麥種質進行鹽脅迫處理，篩選出了7份苗期具有較強耐鹽性的種質V-8001、LU26s、Bhittai、C-228、KTDH、KTDH-22和DS-17；HUSSAIN等[6]利用苗期鹽脅迫試驗鑒定了40份小麥品種，選出3份耐鹽材料S-24、LU-26S和Pasban-90；OYIGA等[7]從150份小麥品種中鑒定出3份 耐 鹽 材 料Altay2000、14IWWYTIR-19和UZ-11CWA-8；張巧鳳等[8]評價了293份小麥種質的苗期耐鹽性，篩選出5份耐鹽新種質Marmin-Minhardi×H44-Minturki、圓白殼小麥、花樹蒲、和尚麥和頂籽；劉旭等[9]從400份小麥種質中篩選出3份耐鹽材料：紅螞蚱、希望、科遺26。上述種質的篩選為小麥品種的耐鹽性改良提供了重要資源，但仍有大量高耐鹽性種質仍未得到鑒定和利用。

為了高效發掘小麥耐鹽種質，本研究在YU等[10]利用芽期耐鹽指數評價核心種質的基礎上，以郝晨陽等[11]利用分子標記篩選的小麥微核心種質為材料，開展苗期鹽脅迫鑒定，并利用鹽害指數（Salt injury index，SI）篩選耐鹽種質，同時利用分子標記分析其可能攜帶的耐鹽位點，以期為小麥抗鹽育種提供一定的理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

57份小麥微核心種質[12]包括42份農家種、12份育成品種和3份引進品種，由作物遺傳與分子改良山西省重點實驗室保存。另設置小麥品種旱選10號作為耐鹽對照、中國春作為鹽敏感對照。

1.2 鹽脅迫處理

每份種質選取20粒飽滿種子，經1%雙氧水消毒后用去離子水沖洗，將其置于鋪有濾紙的培養皿內，籽粒腹溝朝下，加水萌發。當胚根生長至2～3 cm時，從中選取8粒生長勢一致的種子轉移至盛有1/2霍格蘭氏營養液的培養皿，置于恒溫培養箱，設置參數：16 h光照/22℃，8 h黑暗/16℃；7 d后，待幼苗長至兩葉一心，用含NaCl的1/2霍格蘭氏營養液進行鹽脅迫處理，14 d后進行表型鑒定，3次生物學重復。

利用200、250、300、350、400 mmol/L等5個鹽濃度分別測試對照品種旱選10號和中國春的苗期耐鹽性，將二者鹽害指數差異最大時對應的鹽濃度作為鑒定微核心種質的鹽脅迫濃度。

1.3 表型鑒定與數據分析

采用張瀟文等[13]方法，將小麥植株耐鹽級別劃分為0～4級，并計算每份種質的鹽害指數（SI）。

其中，N指植株數目，本研究中N=8。依據鹽害指數對小麥種質做總體評價，分別為：高感（80.1%～100%）、敏感（60.1%～80.0%）、中耐（40.1%～60.0%）、耐鹽（20.1%～40.0%）以及高耐（0～20.0%）。

1.4 耐鹽分子標記鑒定

采用改良CTAB法提取小麥葉片基因組DNA。根據文獻[14-17]合成74個耐鹽相關分子標記，擴增微核心種質DNA，從中選擇24個多態性穩定、條帶清晰的標記用于相關性分析（表1）。

表1 24個用于種質評價的耐鹽相關分子標記及序列Tab.1 The sequences of 24 salt-tolerance-related molecular markers for evaluation of germplasm resources

續表1 24個用于種質評價的耐鹽相關分子標記及序列Tab.1（Continued）The sequences of 24 salt-tolerance-related molecular markers for evaluation of germplasm resources

PCR反應體系為：ddH2O 2μL，PCR Mixture 5μL，引物1.5μL，DNA（50 ng/μL）1.5μL。PCR反應程序：95℃30 s；58℃30 s，72℃30 s，36個循環。PCR擴增產物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳，經硝酸銀染色、顯影液顯色后拍照保存。

1.5 數據分析

采用Microsoft Excel 2020軟件對數據進行統計分析，以及作圖。

2 結果與分析

2.1 篩選苗期耐鹽濃度

小麥種質苗期耐鹽鑒定濃度的篩選如圖1所示。

圖1 小麥種質苗期耐鹽鑒定濃度的篩選Fig.1 Screening of concentration for salt-tolerance identification of wheat germplasm at seedling stage

利用5個鹽濃度分別測試對照品種旱選10號和中國春的苗期耐鹽性，結果表明（圖1），隨著NaCl濃度升高，旱選10號和中國春的鹽害指數不斷增加。當NaCl濃度為250 mmol/L時，耐鹽對照旱選10號和鹽敏感對照中國春的鹽害指數差異達到最大。因此，選擇250 mmol/L作為鑒定微核心種質的鹽脅迫濃度。

2.2 57份微核心種質苗期耐鹽鑒定

57份微核心種質苗期鹽害指數分布及耐鹽等級如圖2、3所示。

圖2 57份微核心種質苗期鹽害指數分布Fig.2 Distribution of salt injury index of 57 micro-core germplasms at seedling stage

用250 mmol/L NaCl溶液對57份微核心種質進行苗期鹽脅迫處理，結果顯示，57份小麥微核心種質的鹽害指數呈正態分布（圖2），表現為高感、敏感、中耐、耐鹽、高耐的種質分別有5、21、24、6、1份，占比分別為8.8%、36.8%、42.1%、10.5%、1.8%（圖3），其中，評價等級為耐鹽及以上（SI＜40.00%）的有7份：帶芒紅麥、黃瓜先、半截芒、小偃6號、興義4號、Atlas 66、和尚麥。與此同時，小偃6號與耐鹽對照旱選10號鹽害指數一致，均為30.00%，且帶芒紅麥（14.24%）、黃瓜先（25.00%）和半截芒（28.89%）的耐鹽性明顯高于旱選10號，尤其是帶芒紅麥鹽害指數最小，評價等級為高耐（表2）。

圖3 57份微核心種質苗期耐鹽等級及數目Fig.3 Salt tolerance grades and numbers of 57 microcore germplasms at seedling stage

表2 57份微核心種質苗期耐鹽表型Tab.2 Salt tolerance phenotypes of 57 micro-core germplasms at seedling stage

2.3 分子標記評價

利用74個耐鹽相關分子標記擴增57份微核心種質，有24個標記的等位變異數目＞2個，多態信息含量（Polymorphic Information Content，PIC）在0.28～0.47，多態性穩定，因此，將其用于后續相關性研究。方差結果發現，分子標記Xcfd9在供試種質中具有3種標記型（圖4），其中，標記型為a的種質平均鹽害指數為49.59%，b型種質平均鹽害指數為57.06%，c型種質平均鹽害指數為64.76%，且每種標記型對應的苗期鹽害指數之間存在顯著差異（F＞F0.05，P=0.04），表明Xcfd9與供試種質耐鹽性存在顯著相關（表3、4）。其余23個分子標記與供試種質耐鹽指數之間的相關性不顯著。

表3 Xcfd9在微核心種質中的標記型及鹽害指數Tab.3 Genotype and salt injury index of Xcfd9 in micro-core germplasm

圖4 Xcfd9標記在部分微核心種質中的標記型Fig.4 Genotypes of Xcfd9 in parts of micro-core germplasms

表4 Xcfd9的3種標記型對應表型值方差分析Tab.4 Variance analysis of corresponding phenotypic values of genotypes of Xcfd9

3 結論與討論

耐鹽種質篩選是小麥抗鹽育種工作的重要前提。目前小麥耐鹽鑒定主要采用形態指標、生理指標和產量指標3種方法，其中，形態指標主要指小麥葉片或根系受脅迫前后的各項參數的測定，因其操作簡便、適合室內鑒定，被廣泛用于小麥抗逆性評價[17-18]。葉片鹽害指數法對小麥鹽脅迫評價較為成熟，曾有研究利用該方法從小麥耐鹽品種中確定了耐鹽位點，并分離了耐鹽基因TaSRO1[19-20]。因此，本研究對57份小麥微核心種質3葉期幼苗進行鹽脅迫，隨后根據葉片反應型來計算鹽害指數，并以旱選10號作為耐鹽對照品種[21-22]，結果顯示，供試小偃6號（小麥生產中公認的耐鹽品種）與旱選10號的鹽害指數一致（SI=30.00%），表明所用的評價體系準確，鑒定結果可信。與此同時，從57份微核心種質中鑒定出7份鹽害指數低于40.00%的耐鹽種質，占比為12.3%，表明小麥種質的整體耐鹽性不高，與前人研究結果一致[10]，其中有4份為農家種（帶芒紅麥、黃瓜先、半截芒、和尚麥），2份為栽培種（小偃6號、興義4號），1份為引進種（Atlas 66）。前人研究發現，從美國引進的小麥Atlas 66具有發達的根系[23]，且對高鋁土壤具有很好的耐受性[24]；小偃6號是我國小麥栽培品種的骨干親本之一，可以通過降低地上部組織中Na含量來提高植株耐鹽性[25]；半截芒和和尚麥則分別對鎘和鉛表現出很好的耐受性[26]，但興義4號、帶芒紅麥和黃瓜先尚無與非生物脅迫相關的研究報道，尤其是帶芒紅麥鹽害指數僅為14.24%，后續將有可能成為創制小麥耐鹽材料和改良品種的重要材料。

同時，本研究用24個多態性標記對57份供試微核心種質進行分子評價，重點關注了標記型與種質鹽害指數之間的相關性，結果發現，Xcfd9與供試種質的苗期耐鹽性存在顯著相關（F＞F0.05，P=0.04），標記型為a和b的種質整體耐鹽性為中耐，而標記型為c的種質整體表現為鹽敏感。在中耐標記型中，a型種質（包括帶芒紅麥和小偃6號）表現出最低的平均鹽害指數（49.59%）；其次為b型種質（包括黃瓜先、半截芒、和尚麥、興義4號和Atlas 66），平均鹽害指數為57.06%，表明Xcfd9附近存在1個耐鹽位點，該結果與LIU等[16]的研究結果一致：Xcfd9與小麥3D染色體上的芽期耐鹽相關位點QGT、QAA和QWURH連鎖。

綜上所述，本研究供試微核心種質的耐鹽表型與Xcfd9的a或b標記型連鎖，并且篩選出的7份耐鹽種質均攜帶這個耐鹽位點，在利用這些種質改良小麥品種過程中，可將Xcfd9用于標記輔助選擇。