沼液替代化學氮肥對濱海稻田土壤有機氮和細菌群落的影響

李 瑞，張 巡，楊 陽，湯逸帆，申建華，韓建剛*

[1 南京林業大學生物與環境學院, 江蘇南京 210037；2 南京林業大學江蘇省南方現代林業協同創新中心,江蘇南京 210037；3 中糧家佳康(江蘇)有限公司, 江蘇東臺 224200]

近年來，關于長期和不合理施用化肥導致作物產量不穩定[1]、土壤板結[2]、酸化[3]、養分利用率低[4]等問題已有諸多報道。而沼液由于富含氮素等營養成分[5]，且重金屬污染風險低[6-7]，已成為最具潛力的化學氮肥替代品，在農田得到廣泛應用。研究表明，沼液替代化肥可顯著提升作物產量[8]，同時可改善土壤結構和提高土壤持水性能[9]，提高土壤有機質含量和氮素等養分含量[10]。

土壤有機氮(SON)是土壤氮素的主要存在形式，占土壤全氮(TN)的90%以上[11]。可分為酸解氮(THN)與非酸解氮(NHN)兩大部分[12]，酸解氮易礦化，能為當季作物供應無機氮[13]。非酸解氮難礦化，是維持土壤氮庫穩定性的保障[14]。由于絕大部分SON礦化后才可被微生物和植物吸收利用[15]，所以礦化作為SON參與氮素循環的重要途經，一直是土壤氮素研究的焦點。研究表明，SON礦化過程不僅與土壤pH[16]、有機碳含量[17]等土壤性狀密切相關，同時受肥料施用種類和施用量[18]等管理措施的影響。SON礦化過程主要受土壤細菌群落的驅動[19]，一些研究認為SON礦化主要與芽孢桿菌(Bacillus)[20]、叢毛單胞菌科(Comamonadaceae)[17]等密切相關；并且證實，長期的不同施肥措施(如化肥和有機肥施用)會引起土壤微生物活動和群落發生變化，從而影響SON的礦化過程[21]。盡管沼液中的氮素主要以無機氮為主，但由于同時含有大量、小分子有機物、礦質離子等組分[22]，因此，長期大量施用必定會通過對養分離子、pH以及微生物等直接或間接的影響，進而對SON組分及礦化過程產生影響[23]。然而，目前有關沼液施用對SON的影響及其機理的相關認識仍不明確，尤其有關沼液替代化肥措施下，土壤細菌群落是否發生改變，如何改變，以及這些變化與SON礦化之間的關系仍需進一步探討與深入研究。

本研究以沼液廣泛應用的江蘇濱海稻田為對象，設置4個不同沼液替代化肥水平處理，通過對比不同水平沼液與化肥配施模式下SON礦化和SON組分變化的差異，結合微生物群落結構與多樣性分析，探討沼液替代化學氮肥對SON礦化的影響及其微生物學機理，為沼液應用過程中對土壤氮素的高效管理與調控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

研究區位于江蘇省東臺市弶港鎮黃海原種場(32°38'26″N，120°54'15″E)。氣候屬于暖溫帶與亞熱帶過渡區，季風顯著，年均日照時間2231.9 h，年均氣溫15.0℃，降水量1061.0 mm。該區域農田為濱海鹽堿地改良而成，屬粉砂質壤土，砂粒、粉粒和黏粒含量分別為36.2%、56.7%和7.1%。試驗樣地布設前，土壤pH為8.28，土壤電導率(EC)為102 μS/cm，土壤有機碳(SOC)、全氮(TN)、全磷(TP)和全鉀(TK)含量分別為4.58、0.48、0.6和16.92 g/kg。

1.2 試驗設計與樣品采集

于2017年6月布設田間小區試驗。在總氮量225 kg/hm2(該水平為當地常規用量)水平下，設置沼液提供0 (BS0)、33% (BS33)、66% (BS66)和100%(BS100)的氮4個處理，每個處理3次重復，共12個小區，各小區完全隨機排列，各小區間壘土埂，并鋪設防滲布進行隔離。

供試沼液取自中糧肉食(江蘇)有限公司黃海沼氣站。沼液pH為8.47，全氮、含量分別為1.06、0.90 g/L，有機碳含量為1.55 g/L。作物種植實行稻麥兩熟制度，水稻、小麥采用當地常用品種淮稻5號、揚麥16號。參照當地耕作習慣，兩季作物種植期沼液及尿素均按基肥、分蘗肥和穗肥2∶1∶2的比例進行分期施用，種植方式及其他管理同于當地。

于2019年10月水稻計產收獲完成后，在各小區隨機3點采集0—20 cm土層土壤進行混合，每個樣品3個重復。所采土壤樣品一部分置于-80℃冰箱保存，用于土壤細菌群落的測定，另一部分在室內風干后過2 mm篩，用于土壤理化性質的測定。

1.3 測定方法

1.3.1 土壤有機氮(SON)礦化的測定 SON的礦化測定采用間歇淋洗淹水培養法[24]。稱取10.00 g過2 mm篩風干土樣置于100 mL離心管中，加入25 mL去離子水形成穩定淹水層，在30℃下培養，分別在培養的第 0、7、14、21、28、42、56、84、112 天進行淋洗，每次淋洗后取上清液通過AA3流動分析儀測定含量，其中第0天淋洗還需測定含量。SON礦化符合一級動力學模型[25]，模型公式及其積分形式如下：

1.3.2 土壤有機氮組分測定 SON各組分采用Bremner法測定[12]，其中，酸解氮(THN)采用6 mol/L HCl酸解—蒸餾法測定；酸解銨態氮(AN)采用MgO蒸餾法測定；酸解銨態氮(AN)與氨基糖態氮(ASN)之和采用磷酸鹽-硼酸緩沖液(pH 11.2)蒸餾測定；氨基酸態氮(AAN)采用茚三酮氧化、磷酸鹽-硼酸緩沖液蒸餾測定；非酸解氮(NHN)、氨基糖態氮(ASN)、酸解未知態氮(UN)由差減法求得。

1.3.3 土壤細菌群落結構與多樣性的測定 采用16S rDNA高通量測序技術進行土壤細菌群落的測定。使用E.Z.N.A ? Soil DNA Kit試劑盒(Omega Biotek, Norcross, USA)對0.5 g解凍后的土壤樣品進行總DNA提取，DNA的提取質量檢測由瓊脂糖凝膠電泳完成，同時使用紫外分光光度法進行定量。使用引物341F (5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3')與805R (5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3')對細菌16S rDNA基因的V3～V4區域進行PCR擴增[26]。PCR擴增產物的驗證由2%瓊脂糖凝膠電泳完成。AMPure XT beads (Beckman Coulter Genomics,Danvers, MA, USA)和Qubit (Invitrogen, USA)分別用于PCR產物的純化與定量。隨后通過Illumina NovaSeq平臺進行測序，通過Divisive Amplicon Denoising Algorithm進行“去重復”(相當100%相似水平的聚類)[27]，隨后構建類OUTs表[28]，最終生成Feature特征表以及特征序列。物種α多樣性的計算由QIIME2平臺完成。

1.3.4 土壤其他性狀指標的測定 土壤pH使用pH計(雷磁PHSJ-5)測定(水土比 2.5∶1)；土壤電導率(EC)用電導率儀(FE30 Plus)測定(水土比 5∶1)；土壤有機碳(SOC)使用TOC分析儀(耶拿multiN/C 3100)測定；土壤全氮用凱氏法測定[29]；土壤全磷用鉬銻抗分光光度法測定[30]；土壤全鉀用火焰光度法測定[31]。

1.4 數據分析

使用Origin 2017軟件進行繪圖以及SON礦化數據的一級動力學模型擬合。使用SPSS 23軟件進行統計分析，其中單因素方差分析和Duncan法多重比較用于檢驗各處理SON組分、礦化參數以及作物產量等指標的顯著性。采用冗余分析(Redundancy analysis，RDA)探究不同SON組分及土壤氮礦化勢(N0)與相對豐度在1%以上的土壤細菌屬間的關系。

2 結果與分析

2.1 不同沼液替代水平對土壤有機氮礦化的影響

如圖1所示，隨著培養時間的延長，不同處理累計氮礦化量逐漸增長并達到平穩，各處理培養前14天累計氮礦化量占到112天的89.0%～94.5%。采用式(2)一級動力學模型對SON礦化累積量隨時間的變化進行擬合，分別計算土壤氮礦化勢(N0)和礦化速率常數(k0)，結果如表1。隨沼液替代水平的提高，土壤N0顯著升高(P＜0.05)，與BS0處理相比，BS33、BS66、BS100處理土壤N0升高幅度分別為26.5%、39.7%、42.2%，但BS66與BS100處理間差異不顯著。培養前14天的礦化速率也表現為隨沼液替代化肥水平的增大而提升，BS0、BS33、BS66、BS100處理的均值分別為2.17、2.68、2.88、3.06 mg/(kg·d)，但BS66與BS100處理間差異不顯著。因此，不同沼液替代水平下SON礦化能力表現為BS100和BS66處理大于BS33和BS0處理。

圖1 土壤有機氮礦化曲線Fig.1 Mineralization curve of soil organic nitrogen

表1 土壤有機氮礦化擬合參數Table 1 Fitting parameters of soil organic nitrogen mineralization

2.2 不同沼液替代水平對土壤有機氮組分的影響

如圖2所示，不同SON組分受沼液替代化肥水平影響。與BS0處理相比，3個不同沼液替代處理的酸解氮(THN)、非酸解氮(NHN)、氨基酸態氮(AAN)含量均顯著增加(P＜0.05)，增加幅度分別為8.0%～23.0%、46.9%～73.9%和25.6%～39.2%。其中THN、AAN和氨基糖態氮(ASN)含量以BS66處理的增加幅度最高，較BS0處理分別增加21.8%、39.2%、40.9%。而NHN含量則以BS100處理增加幅度最高，較BS0處理增加幅度達73.9%。對于酸解銨態氮(AN)含量，BS33和BS100處理均顯著高于BS0處理，但BS33、BS66和BS100 3個處理間無明顯差異。酸解未知態氮(UN)含量則表現為僅BS100處理較BS0處理差異顯著。

圖2 土壤有機氮組分含量變化特征Fig.2 Change in soil organic nitrogen fractions

如圖3所示，BS0處理下，SON各組分占比大小順序為AAN＞AN＞UN＞NHN＞ASN，占比分別為26.9%、25.2%、24.4%、16.7%、6.7%。與BS0處理相比，BS33處理下AAN和NHN占比的上漲幅度分別為11.3%、28.3%，而UN占比下降幅度為26.6%，BS66處理下AAN、ASN和NHN占比均有所上漲，漲幅分別為11.6%、13.0%、11.4%，AN占比下降12.5%，BS100處理下AN和AAN占比分別下降12.5%、4.5%，NHN占比上漲32.3%。BS100處理下SON各組分占比大小順序為AAN＞UN＞NHN＞AN＞ASN。

圖3 土壤有機氮組分占比Fig.3 Proportion of soil organic nitrogen (SON) fractions

2.3 不同沼液替代水平對土壤細菌群落結構與多樣性的影響

各處理土壤中，共檢測到13個菌門，其中Proteobacteria (變形桿菌門)、Acidobacteria (酸桿菌門)、Chloroflexi (綠彎菌門)和Actinobacteria (放線菌門)為相對豐度較高的4類群，占細菌總豐度的70%以上(圖4)。其中，沼液處理下有3個土壤細菌菌門的相對豐度發生顯著變化(P＜0.05)，分別為Chloroflexi(綠彎菌門)、Actinobacteria (放線菌門)、Nitrospirae(硝化螺旋菌門)。Chloroflexi與Actinobacteria的相對豐度均以BS100處理最高，分別為13.5%、7.4%。而Nitrospirae (硝化螺旋菌門)則以BS0處理最高，比BS100處理高25.8%。

圖4 不同處理下土壤細菌門相對豐度Fig.4 Relative abundance of soil bacterial phyla as affected by biogas slurry treatment

以相對豐度≥1%或者＜1%作為某一菌屬新增或者消失的標準，與BS0處理比較，BS33處理新出現了2個細菌屬(Subgroup_7_unclassified、Desulfarculaceae_unclassified)，同時消失了2個細菌屬(Anaeromyxobacter、Betaproteobacteria_unclassified)，這4個細菌屬的相對豐度總和為4.58%，占BS0處理主要細菌屬相對豐度總和的11.87%；BS66處理新出現了3個細菌屬(Subgroup_7_unclassified、RB41、TRA3-20_unclassified)，同時消失了3個細菌屬(Anaeromyxobacter、Betaproteobacteria_unclassified、Ellin6067)，這6個細菌屬的相對豐度總和為6.59%，變動比例為17.07%。BS100處理下新出現4個屬(Actinobacteria_unclassified、Haliangium、S085_unclassified、Subgroup_7_unclassified)，同時4個細菌屬消失(Alphaproteobacteria_unclassified、Anaeromyxobacter、Betaproteobacteria_unclassified、Ellin6067)，這8個屬的相對豐度總和為8.70%，變動比例為22.54% (表2)。這說明沼液的施用水平影響了土壤細菌屬的組成。

表2 土壤主要細菌屬的數量與相對豐度變化Table 2 Changes in the number and relative abundance of the main bacterial genera in soil

其中，Subgroup_6_unclassified的相對豐度隨著沼液替代化肥水平升高，呈現逐漸上升的趨勢，Subgroup_17_unclassified的相對豐度呈下降趨勢，而KD4-96_unclassified則表現為在低沼液用量BS33處理下被抑制(其相對豐度較BS0處理下降25.4%)，在BS66與BS100處理下被促進的現象(其相對豐度較BS0處理分別上漲11.1%、43.4%)。此外，在沼液替代化肥模式下，細菌屬Subgroup_7_unclassified的相對豐度增加到1%以上，而Anaeromyxobacter、Betaproteobacteria_unclassified與Ellin6067的相對豐度則下降至低于1% (表3)。不同沼液替代水平的土壤細菌群落的α多樣性變化差異不顯著，各處理的Shannon指數處于10.799～11.056，Simpson指數處于0.9985～0.9991。

表3 各處理中幾個細菌屬的變化Table 3 Changes in several bacterial genera in each treatment

2.4 土壤有機氮組分及氮礦化勢與細菌群落結構與多樣性的關系

采用冗余分析(RDA)對不同SON組分及土壤N0與相對豐度在1%以上的土壤細菌屬的關系進行分析，結果如圖5所示。第1排序軸的解釋量為45.03%，第2排序軸的解釋量為32.75%，前兩軸的解釋量達到77.78%，表明前兩軸能較好地解釋SON組分及土壤N0與相對豐度在1%以上的土壤細菌屬的關系。從圖上可以看出Subgroup_10、Haliangium、Burkholderiaceae_unclassified、Steroidobacteraceae_unclassified和Subgroup_6_unclassified與SON組分及土壤N0的變化呈正相關。Spearman相關性分析結果顯示，土壤N0與Thermodesulfovi brionia_unclassified呈極顯著負相關性(P＜0.01)，非酸解氮與Subgroup_6_unclassified呈顯著正相關(P＜0.05)，與Betaproteobacteria_unclassified呈顯著負相關(P＜0.05)，氨基酸態氮與Proteobacteria_unclassified、氨基糖態氮與KD4-96_unclassified呈顯著正相關(P＜0.05)，酸解未知態氮與Desulfarculaceae_unclassified呈顯著負相關(P＜0.05)。

圖5 SON組分及土壤N0與優勢細菌屬間的冗余分析Fig.5 Redundancy analysis (RDA) on soil dominant bacteria genus constrained by SON fractions and soil N0

3 討論

3.1 不同沼液替代水平對土壤有機氮礦化及作物產量的影響

土壤有機氮(SON)礦化不僅與水分[32]、溫度[33]、鹽分[34]等因子密切相關，同時易受施肥影響[35-37]。本研究中，與單施化肥相比，沼液替代化肥不同水平(33%、66%和100%)均顯著提升了土壤氮礦化勢(N0)、SON礦化速率和累計礦化量。當沼液替代化肥水平為66%時，土壤N0達到44.76 mg/kg，較單施化肥顯著升高了39.7%，同時，培養前14天的SON礦化速率達到2.88 mg/(kg·d)，累計礦化量也提高了1.4倍；但當沼液替代化肥水平升高至100%時，對SON礦化的促進作用與66%替代水平處理并無顯著差異。這表明，在相同施氮量下，一定比例沼液與化肥配施可以顯著提升土壤氮素的周轉效率和土壤的供氮能力。這可能主要是由于沼液中有機質及養分含量高，含有多種生物有效性成分，激發土壤微生物活性，進而影響SON礦化[38]。本研究所證實的沼液替代化肥對SON礦化的促進作用與以往稻田長期施用豬糞等常規有機肥的研究結果一致，如施氮量為90 kg/hm2條件下有機肥(豬糞)與化肥配施較單施化肥的礦化速率顯著提高，累計氮礦化量提高可達86.5%[36]；當有機肥替代60%化肥時土壤N0顯著高于單施化肥處理[37]，可見對SON礦化的促進程度，還與有機肥類型及施用量等有關。

相比長期施用化肥處理會導致土壤質量退化[39]，降低水稻田的土壤肥力和降低產量，本研究結果顯示不同沼液替代化肥水平下對水稻產量均有提升作用，僅施化肥處理下水稻產量為4560.05 kg/hm2，而沼液66%替代化肥處理下產量高達6329.18 kg/hm2，增幅最高，與僅施化肥處理相比提高38.8%。這可能與該處理下SON礦化量增加和氮供應能力增強有關。對土壤N0與水稻產量進行Pearson相關性分析，結果顯示二者呈極顯著相關(P＜0.01)，以往研究結果中，冬小麥、夏玉米的產量與土壤凈礦化量也呈現極顯著相關[40]。有機肥與化肥配施作為提高土壤N0的有效手段，進一步使作物產量也得到提升[41-42]。這表明，作物產量與SON礦化能力息息相關，沼液一定比例替代化肥可以顯著提升SON礦化強度，增加作物產量。因此，應提倡沼液合理替代化肥，既可減少化肥的施用，還可增加產量。

3.2 不同沼液替代水平對土壤有機氮組分的影響

有機肥配施化肥同樣會對SON各組分的含量產生影響，由于SON組分之間的礦化難易程度不同，所以SON組分含量的差異也會影響土壤氮素礦化。在本研究中，與僅施化肥相比，沼液化肥配施條件下土壤酸解氮和非酸解氮含量均有所提升，這可能是由于沼液本身富含有機物和養分，一方面直接增加了土壤中易礦化氮庫和難礦化氮庫的庫容，另一方面為氮的釋放提供了更加有利的條件，從而促進了土壤有機氮礦化，這與以往對常規有機肥施用的研究結果[43-45]一致，但土壤酸解氮中各組分對不同比例沼液替代化肥的響應有所差異。在土壤酸解氮中，沼液替代化學氮肥處理，氨基酸態氮與氨基糖態氮的含量有顯著增加，并均以沼液66%替代化肥處理(BS66)的增加幅度最高，分別較化肥處理(BS0)增加39.2%和40.9%；而對于酸解銨態氮含量，施用沼液的處理(BS33和BS100)均顯著高于BS0處理，但BS33、BS66、BS100 3者間無明顯差異；酸解未知氮含量則表現為僅100%沼液施用處理(BS100)較BS0處理差異顯著。這說明，沼液替代化肥更有利于土壤中氨基酸和氨基糖態氮庫的提升。這可能是由于土壤中微生物對沼液施加帶來的有機物質較為敏感[46]，提升了微生物的活性，微生物在分解有機物質與腐殖化過程中，形成了更多的易礦化態氮[47]。

3.3 不同沼液替代水平對土壤微生物群落結構的影響及其與土壤有機氮礦化和組分的關系

施肥措施會通過改變土壤物理、化學和生物學特征，驅動土壤微生物群落的演變。本研究發現，微生物無論在門或屬水平上，其相對豐度均受沼液替代化肥水平的影響。沼液替代化肥氮的比例在66%以上時，Chloroflexi (綠彎菌門)、Actinobacteria(放線菌門)的相對豐度均增高，而Nitrospirae (硝化螺旋菌門)相對豐度則有所下降。這可能與Chloroflexi (綠彎菌門)更適應厭氧富氨環境有關[48]。而Actinobacteria (放線菌門)被證實在參與土壤有機質的轉化過程中同時分泌抗菌物質，可以增加土壤健康程度[49]。Nitrospirae (硝化螺旋菌門)在僅施化肥處理下相對豐度最高，這與以往研究結果[50-51]一致。屬水平上，施用沼液處理下(33%～100%沼液比例)相對豐度≥1%的細菌屬新增了Subgroup_7_unclassified，而Anaeromyxobacter(厭氧粘細菌)與Betaproteobacteria_unclassified的相對豐度下降至1%以下；Ellin6067則在僅施化肥和沼液替代33%處理下其相對豐度≥1%，而隨著沼液替代化肥比例升至66%以上時，其相對豐度下降至1%以下。這表明沼液的施用對細菌屬Subgroup_7_unclassified有明顯的促進作用，而對Anaeromyxobacter、Betaproteobacteria_unclassified和Ellin6067具有明顯的抑制作用。其中，Anaeromyxobacter(厭氧粘細菌)一般廣泛分布于厭氧沉積環境中[52]，有研究[53]表明，稻田長期施用豬糞或秸稈與化肥條件下其豐度會顯著增加，這與本研究的結果相反，可能主要與沼液偏堿性有關。同時，Ellin6067為有害菌群[54]，其相對豐度的下降也說明沼液替代化肥66%以上時，可在一定程度上提升土壤質量。

土壤微生物數量和群落結構的變化是影響SON礦化和各組分變化的關鍵因素[55]，但同時受不同施肥措施(施肥量、肥料類型)的影響。二者相互影響并存在緊密相關的關系。本研究采用RDA對土壤N0及不同SON組分與相對豐度在1%以上的土壤細菌屬的關系進行分析，結果表明在沼液施用條件下，Thermodesulfovibrionia_unclassified對土壤供氮能力的提升有一定的抑制作用，而Betaproteobacteria_unclassified、Proteobacteria_unclassified和KD4-96_unclassified具有促進作用，更利于易礦化氮庫容的增加，Subgroup_6_unclassified則更有利于增加土壤氮庫的穩定性。土壤微生物群落結構的變化明顯受不同施肥措施的影響。有研究表明，不同化學氮肥梯度下氮礦化速率主要與Alphaproteobacteria和Gammaproteobacteria呈正相關[56]。而豬糞或秸稈與化肥混施條件下，氮礦化速率主要受unclassified Comamonadaceae和Bacillus豐度的影響，而二者均呈負相關[17]。土壤微生物群落結構和功能微生物數量對不同施肥措施響應的差異，可能主要由施肥導致的反應底物及土壤理化性質的差異所決定[53]。

4 結論

1)沼液替代化肥可顯著提升土壤氮礦化勢(N0)，當沼液替代水平高于66%時，土壤氮礦化勢較化肥處理顯著增加39.7%～42.2%，土壤的供氮能力最強。

2)沼液替代化肥顯著提升了土壤有機氮(SON)中的酸解氮(THN)、非酸解氮(NHN)和氨基酸態氮(AAN)含量，不僅提高了土壤有機氮對作物的有效性，還提高了土壤氮庫的穩定性，尤其以沼液替代66%的化肥效果最大。

3)施用沼液改變了土壤微生物群落結構與功能微生物的數量。隨著沼液替代化肥比例的升高，Actinobacteria (放線菌門)與Chloroflexi (綠彎菌門)的相對豐度顯著上升，而Nitrospirae (硝化螺旋菌門)的相對豐度卻顯著下降(P＜0.05)；細菌屬Subgroup_7_unclassified的相對豐度明顯增加，而Anaeromyxobacter、Betaproteobacteria_unclassified與Ellin6067的相對豐度則明顯下降。

4)細菌屬Thermodesulfovibrionia_unclassified、Subgroup_6_unclassified、KD4-96_unclassified、Proteobacteria_unclassified與SON礦化及組分變化關系密切，其相對豐度分別與土壤氮礦化勢(N0)、非酸解氮(NHN)、氨基糖態氮(ASN)和酸解未知態氮(UN)呈顯著相關。