氮肥對大豆結瘤固氮、籽粒產量和蛋白質含量的影響

鄒 獅，嚴 君，韓曉增，鄒文秀，陳 旭，陸欣春

（1 中國科學院東北地理與農業生態研究所，黑龍江哈爾濱 150081；2 中國科學院大學，北京 100049）

大豆生長發育所需要的氮素主要來源于土壤氮、肥料氮和根瘤固氮，僅依靠根瘤固氮只能為大豆提供50%～60%的氮素，還無法滿足大豆高產的需求，因此在生產上還需要施用氮肥[1-2]。然而不合理的施用氮肥會抑制大豆結瘤和固氮，對大豆產量和蛋白質含量亦會產生不利影響，因此在生產上需要協調好氮肥—結瘤固氮—產量和蛋白質含量之間的關系[1,3]。

與禾本科作物相比，大豆是需氮較高的作物，但不同生長發育階段的需氮量有差異[4-8]。有研究表明，在大豆V4期施氮根瘤數量減少52%，地下生物量降低19%[9]。Gan等[7]研究表明，V2期和R1期是最佳的氮肥施用時期，其中V2期施氮不同基因型大豆在R1階段根瘤干重較不施N處理提高了16%～23%，而R1期施氮更有利于增加植株對氮素的吸收和產量的增加，武引9、油91-19和巨豐3種基因型R1期施氮大豆產量提高了21%～27%；等量氮肥在R3期施用抑制大豆結瘤，對大豆產量亦無顯著的促進作用[7-8]。V6期和R2期施氮大豆籽粒蛋白質含量顯著下降[10]。因此氮肥施用時期和施用量對大豆根瘤固氮能力、產量和籽粒蛋白質含量有直接的影響。生產1 t/hm2大豆籽粒需要80 kg/hm2的氮，其中50%～80%來自于共生固氮[1]。此外Tamagno等[11]研究表明，大豆籽粒產量與大豆植株酰脲相對豐度(固氮能力評價的指標)和蛋白質含量呈負相關關系，酰脲相對豐度與蛋白質含量呈正相關關系。因此大豆固氮能力的高低與產量和籽粒蛋白質含量存在一定的內在關系。

東北黑土區是我國重要的大豆產區，該地區在生產上大豆的氮肥(尿素)施用量通常＞120 kg/hm2[12]。前人的研究大多注重不同施氮時期不同施氮量對大豆固氮、生長、產量及蛋白質含量的影響，但缺少結瘤固氮與籽粒產量和蛋白質含量之間關系的研究[13-14]。因此本研究選擇在大豆氮肥最佳施用的V2期和R1期施用不同量的氮肥，研究與大量氮肥施用相比，減少氮肥施用對大豆結瘤固氮、產量和籽粒蛋白質含量的影響以及它們之間的內在相互關系，為大豆高產優質高效栽培提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料及方法

盆栽試驗于2021年5—10月在中國科學院東北地理所溫室進行。供試土壤為黑土，土壤有機碳含量為38.6 g/kg、全氮含量為2.96 g/kg、堿解氮含量為192.2 mg/kg、全磷含量為0.7 g/kg、速效磷含量為34.2 mg/kg、全鉀含量為23.7 g/kg、速效鉀含量為130.7 mg/kg。供試大豆品種為‘東生35’。

試驗設施氮(N)量設3個水平： N 0、5、100 mg/(kg, 土)，分別表示為N0、N5、N100；2個施用時期：大豆生長發育的V2期(第二片三出復葉全展期)和R1期(始花期)，氮肥溶于水中施入，共5個處理，每個處理4次重復。供試氮肥為尿素(N 46%)，除此之外，在土壤裝盆前，將過磷酸鈣(15% P2O5)、硫酸鉀(K2O 52%)均按3 mg/(kg, 土)的量與土壤混合。供試容器為PVC盆，直徑20 cm、高45 cm，每盆裝土5.5 kg。每盆扎4個淺穴，每穴內播2粒種子，覆土3～4 cm，齊苗后每盆保留2株。

1.2 樣品采集與分析

在大豆生長發育的盛花期(R2期)和鼓粒始期(R5期)采集植株樣品。將完整的大豆根系從盆栽土壤中取出洗凈后，分別測定大豆地上干重、根瘤數量、根瘤干重及固氮酶活性。根瘤固氮酶活性的測定采用乙炔還原法[15-16]。成熟期(R8期)取樣，測定大豆籽粒產量和蛋白質含量，大豆籽粒蛋白質含量采用凱氏定氮法[17]進行測定，測定全氮后換算為籽粒蛋白質含量。

1.3 數據分析

采用SPSS 2020軟件對不同氮肥施用時期和施用量處理下大豆地上干重、根瘤數量及干重、固氮酶活性、籽粒產量和蛋白質含量進行雙因素有交互作用的ANOVA方差分析，并采用Duncan多重比較進行0.05水平上的顯著性差異檢驗。使用Amos Graphics軟件對大豆根瘤數量、干重、固氮酶活性和大豆籽粒產量及蛋白質含量建立結構方程模型圖(Structural Equation Model，SEM)。

2 結果與分析

2.1 不同氮肥施用時期和施用量對大豆地上部干物質積累的影響

不同氮肥施用時期和施用量對R2期和R5期的大豆地上部干重的影響有差異(圖1)，N0處理的地上干重均最低，而N100處理R2期的地上干重最高，R5期N5處理地上干重最高。V2期施氮，N100處理在R2期和R5期的地上干重分別較N0處理增加了66.6%和10.6%；R1期施等量氮，則分別增加了37.2%和24.3%。在R2期時大豆地上干重表現為V2期施氮＞R1期施氮，在R5期時則呈R1期施氮＞V2期施氮。整體上氮肥施用量和氮肥施用時期對大豆地上干重均有顯著影響(P＜0.05)。

圖1 氮肥施用時期和施用量對大豆地上部干物質積累量的影響Fig.1 Effects of N fertilizer application time and rate on aboveground dry weight of soybean

2.2 不同氮肥施用時期和施用量對大豆根瘤特性的影響

V2期和R1期施用氮肥，大豆根瘤數量均隨著施氮量的增加呈下降的變化趨勢(圖2)。V2期施氮，N5和N100處理較N0處理R2期大豆根瘤數量分別下降了18.0%和59.9%,在R5期分別下降了16.5%和28.2%。R1期施氮，N5和N100處理較N0處理在R2期大豆根瘤數量分別下降了21.0%和42.3%；在R5期分別下降了7.1%和27.8%。V2期和R1期兩個施氮時期，大豆根瘤數量R5期N5處理表現為R1期施氮＞V2期施氮，兩者無顯著差異；R2期N100處理表現為R1期施氮＞V2期施氮(P＜0.05)。方差分析結果表明，施氮量對R2期和R5期根瘤數量均有顯著影響，而施氮時期對根瘤數量均無顯著影響，施氮時期和施氮量交互作用對R2期根瘤數量有顯著影響。

圖2 不同氮肥施用時期和施用量下大豆的根瘤數量Fig.2 The nodule number of soybean as affected by N fertilizer application time and rate

隨著生育時期的推進，大豆根瘤干重與根瘤數量的變化趨勢基本一致，均以N100處理的大豆根瘤干重最低(圖3)。V2期施氮，R2期和R5期大豆根瘤干重N100處理較N0處理分別下降了81.9%和49.0%；而在R1期施用等量氮肥時，分別下降了32.8%和47.8%。V2期和R1期施氮，N5處理在R2期的大豆根瘤干重無顯著差異，在R5期大豆根瘤干重表現為R1期施氮＞V2期施氮；而N100處理下大豆根瘤干重在R2期表現為R1期施氮＞V2期施氮(P＜ 0.05)，在R5期的大豆根瘤干重無顯著差異。方差分析結果表明：施氮量、施氮時期及兩者的交互作用均對R2期大豆根瘤干重有顯著的影響，而施氮量對R5期大豆根瘤干重有顯著影響。

圖3 不同氮肥施用時期和施用量下大豆根瘤干重Fig.3 The nodule dry weight of soybean as affected by N fertilizer application time and rate

2.3 不同氮肥施用時期和施用量對大豆根瘤固氮酶活性的影響

V2期和R1期施用氮肥，大豆總固氮酶活性均隨施氮量的增加呈先增加后下降的變化趨勢，即N5處理的根瘤固氮酶活性最大，V2和R1兩個施肥期分別達到 14.15 和 23.4 μmol/(g·h) (圖4)。V2 期施氮，R2期和R5期的大豆固氮酶活性N5處理較N0處理分別增加了15.3%和27.1%，而N100處理較N5處理分別下降了17.7%和40.1%，較N0處理分別下降了5.1%和23.9%。N100處理下兩個施氮時期在R2期固氮酶活性表現為V2期施氮＞R1期施氮，在R5期則表現為V2期施氮＜R1期施氮；N5處理下，兩個施氮時期在R2期和R5期根瘤固氮酶活性均表現為V2期施氮＜R1期施氮。方差分析結果表明：施氮量、施氮時期及兩者的交互作用均對R2期大豆根瘤固氮酶活性有顯著的影響，而施氮量對R5期大豆根瘤固氮酶活性有顯著影響。

圖4 氮肥施用時期和施用量對大豆根瘤固氮酶活性的影響Fig.4 Effects of N fertilizer application time and rate on soybean nodule nitrogenase activity

2.4 不同氮肥施用時期和施用量對大豆籽粒產量和蛋白質含量的影響

氮肥施用量對大豆籽粒產量和蛋白質含量均有顯著影響(表1)。V2期和R1期施氮，大豆籽粒產量均以N5處理最高，分別達21.70和21.48 g/pot，而N100處理大豆籽粒產量顯著低于N5，甚至與N0無顯著差異。V2期施氮，N5處理大豆籽粒蛋白質含量較N0處理增加了6.3%，N100的蛋白質含量與N0無顯著差異；R1期施氮，N5處理大豆籽粒蛋白質含量較N0處理增加了9.4%，而N100的蛋白含量與N0無顯著差異。大豆籽粒產量的變化表現為V2期施氮＞R1期施氮，大豆籽粒蛋白質含量表現為R1期施氮＞V2期施氮，但整體上施氮時期對大豆籽粒產量和蛋白質含量無顯著影響。

表1 氮肥施用時期和施用量對大豆籽粒產量和蛋白質含量的影響Table 1 Effects of N application time and rate on yield and protein content of soybean seed

2.5 大豆根瘤數量、干重、固氮酶活性、籽粒產量和蛋白質含量之間的關系

通過對大豆根瘤數量、干重、固氮酶活性、籽粒產量和蛋白質含量之間的相關性分析，結果(表2)表明大豆根瘤數量和干重極顯著正相關，固氮酶活性與大豆籽粒產量和蛋白質含量顯著正相關。大豆籽粒的產量與蛋白質含量極顯著正相關關系。

表2 大豆根瘤數量、根瘤干重、固氮酶活性、籽粒產量和蛋白質含量之間的相關關系（r）Table 2 Correlation among nodule number, root dry weight, nitrogenase activity, seed yield and protein content

進一步通過結構方程圖(SEM)模型來評估不同施氮量和施氮時期條件下大豆結瘤數量、干重和固氮酶活性與大豆籽粒產量和蛋白質含量之間的關系(圖5)。SEM模型擬合度較高，能夠有效解釋大豆籽粒產量和蛋白質含量的變異，結構方程模型解釋大豆籽粒產量總變異的77.5%，解釋籽粒蛋白質含量總變異的77.9%。施氮量對籽粒蛋白質含量負向調控(P＜0.001)，對產量正向調控(P＜0.05)，還通過影響根瘤數量和固氮酶活性對大豆產量和蛋白質含量進行調控，其通徑系數分別為-0.78和0.90。施氮時期對籽粒產量負向調控，正向調控籽粒蛋白質含量，但對根瘤干重和固氮酶活性無直接的調控關系。根瘤數量對大豆籽粒蛋白質含量進行負向調控，固氮酶活性對大豆籽粒蛋白質含量進行正向調控，其通徑系數分別為-0.60和0.45。根瘤干重和固氮酶活性對大豆籽粒產量進行正向調控，其通徑系數分別為0.53和 0.66。

圖5 施氮量和施氮時期下根瘤特性、固氮酶活性、籽粒產量和蛋白質含量之間的結構方程圖Fig.5 Structure equation map (SEM) of nodule characteristics, nitrogenase activity, yield and protein content with various N application time and rate

3 討論

適時適量的施用氮肥能夠改善土壤養分的供應，促進大豆干物質量積累、根瘤固氮能力和大豆產量的提高，因此氮肥施用時期和施用量是決定大豆籽粒產量和蛋白質含量的關鍵因素[18-19]。在本研究中，在大豆V2期和R1期施用不同量氮肥，大豆的干物質積累量和產量與N0處理相比顯著提升，整體上大豆干物質積累量變化表現為V2期施氮＜R1期施氮。同樣Gan等[7,20]在盆栽和田間試驗中的結果表明，在大豆V2期和R1期施氮能夠顯著促進大豆生物量、氮積累總量和產量的提升。在R1期施用氮肥能更有效的促進大豆干物質的積累，主要通過增加作物葉片葉綠素含量和光合能力，進而為大豆高產提供充足的物質保障[21-22]。此外本研究中無論是V2期還是R1期施用氮肥，N100處理R2期大豆的干物質積累量最高，而大豆產量則在N5處理時最高，N5和N100處理對大豆干物質量積累和產量的影響不一致，與大豆生長發育各生育時期對氮素的需求不同有關，在根瘤固氮系統形成前，大豆氮素主要用于生長發育(干物質積累)，施氮量越高大豆干物質積累量越高；在根瘤固氮系統形成后的生殖生長階段，如R1期大豆需要的氮素用于大豆籽粒(產量和蛋白質)的建成，而大豆籽粒的建成還與根瘤固氮有一定的關系。此外Liu等[12]在黑土上的研究表明，N5和N100處理大豆籽粒產量無顯著差異，與本研究結果略有不同，產生差異的原因可能是氮肥施用的時期、選用的大豆品種和土壤基礎肥力不同。

氮肥施用時期和氮肥施用量對大豆根瘤數量和干重有影響[9]。在本研究中V2期和R1期施高氮的N100處理，大豆R2期和R5期根瘤數量較N0處理分別下降了42.3%～59.9%和27.8%～28.2%，根瘤干重較N0處理分別下降了32.8%～81.9%和47.8%～49.0%。N5處理下大豆根瘤數量和干重較N0處理有所下降，但顯著高于N100處理。這主要是由于施用氮肥后土壤有效氮濃度增加，一方面抑制了土壤中大豆根瘤菌的繁殖，進而其對大豆根系的侵染和定殖減少[23]。另一方面大豆進行自我調控，直接吸收消耗能量較少的土壤無機氮供大豆生長發育，減少或降低了消耗能量的根瘤固氮過程，從而導致了大豆結瘤數量和干重降低[24-26]。Akinori等[26]的研究同樣表明，當土壤有效氮濃度低時，大豆更傾向于促進大豆根瘤的生長以及固氮功能的發揮；而土壤有效氮濃度高時，抑制大豆結瘤，則促進側根生長，以便更好的增加氮素吸收。然而在側根形成過程中，根部較高的光合同化物消耗量減少了對根瘤光合同化物的供應，相應的抑制了大豆根瘤的生長和固氮能力[25]。本研究供試的土壤是肥沃的黑土，即本底土壤有效氮濃度和有機質含量較高，施用氮肥(N5和N100)大豆根瘤數量和干重較N0處理均下降，V2期施氮對大豆根瘤數量和干重的抑制作用整體表現為大于R1期施氮處理，即大豆根瘤數量和干重V2期施氮＜R1期施氮。同樣Mccoy等[9]研究表明V4期施氮，根瘤數量減少了52%，且施用低氮(45 kg/hm2)和高氮(135 kg/hm2)處理下的根瘤數量無顯著差異。Marschner等[8]研究表明，在生長發育前期，適量施氮有利于大豆生長，同時有利于根瘤侵染和定殖。此外Gan等[7]研究表明，V2期施用氮肥促進大豆結瘤固氮，R1期施用等量氮肥抑制大豆結瘤固氮。因此掌握大豆關鍵生育時期對氮素需求量，對于研究大豆結瘤固氮和生長發育有重要作用。

固氮酶活性是衡量根瘤固氮的重要指標，其活性的高低與氮有密切的關系[16,21]。Daimon等[27]研究表明，施用3.5 mmol/L的硝態氮，豆科植物(花生)根瘤數量、干重和固氮酶活性最高。王樹起等[28]研究表明，不論何種施氮方式均降低了根瘤固氮酶活性，且隨著施氮量的增加抑制作用增強。而本研究中，V2和R1期施氮均以N5處理下的根瘤固氮酶活性(1 g根瘤干重)最高。與本研究結果相似，Lyu等[16]在大豆分根試驗上的研究結果表明，施高氮處理大豆根瘤固氮酶活性低于施用低氮處理。還有研究表明在較長時間給大豆一側根系局部施氮，根瘤固氮酶活性施氮側與未施氮側均隨氮量的增加呈先升高后降低的單峰變化趨勢[29]。這種不一致的情況可能是，在這些研究中，土壤氮和有機質含量較低[30-32]。適量施用氮肥促使根瘤固氮酶活性高峰期向后推移，大豆根系和根瘤的衰老減緩，從而有利于大豆生育后期干物質和養分的積累[33]。在本研究中R1期施氮大豆根瘤固氮酶活性高于V2期施氮，這與根瘤數量和干重的變化趨勢一致(圖2、圖3和圖4)，這也驗證了本研究結構方程模型中，根瘤數量通過影響根瘤干重對固氮酶活性正向調控，而固氮酶活性對大豆產量和蛋白質含量也具有正向調控作用(圖5)。以往的研究中固氮酶活性與氮肥都是負相關的[34-35]，而在本研究中卻是正相關，這主要與所選用的固氮酶活性的評價指標是單個根瘤的固氮酶活性，而不是總的固氮酶活性等因素有關。在以后的研究中還需要進一步增加氮肥施用量以及選用更多的固氮評價指標，才能更好地明確根瘤固氮與氮肥之間的關系。

在大豆生長發育期施氮會提高大豆籽粒產量和蛋白質含量，缺氮會導致大豆籽粒產量及蛋白質含量顯著下降[36]。在開花前施氮肥大豆籽粒蛋白質含量平均增加0.7%，而在開花和結莢期間施用氮肥籽粒蛋白質含量平均增加1.1%[37]。Wilson等[38]研究表明，MG2大豆品種種植期間施用560 kg/hm2的氮肥，籽粒蛋白質含量增加，但對產量沒有顯著影響。本研究中N5處理時大豆籽粒產量和蛋白質含量最高。V2期施氮對大豆籽粒蛋白質含量的影響低于R1期施肥，這可能是由于生殖生長階段大豆根瘤開始衰老，根瘤氮和土壤氮的供應不能滿足豆科植物的生長需求，補充氮肥不僅可以緩解根瘤衰老，還能增加作物葉片葉綠素含量和光合能力，提高葉片蔗糖和淀粉含量和促進干物質向籽粒的轉運[36,39]。在本研究中結構方程模型結果表明，施氮量主要是通過影響大豆根瘤數量和固氮酶活性間接影響大豆籽粒產量和蛋白質含量，其中根瘤數量對大豆籽粒蛋白含量有負向調控作用，而固氮酶活性對大豆籽粒產量和蛋白質含量起正向調控作用。因此要想提高大豆籽粒產量和蛋白質含量需要在適當的生育時期施用適量的氮肥，要在大豆關鍵生育時期氮吸收過程(即生物固氮和礦質氮吸收)的研究方面下功夫[40]。

4 結論

施氮量對大豆籽粒產量和蛋白質含量的影響大于施氮時期，施氮量正向調控大豆產量，負向調控大豆籽粒蛋白質含量。施氮量通過影響大豆根瘤數量和固氮酶活性，間接影響大豆籽粒產量和蛋白質含量，其中根瘤數量對大豆籽粒蛋白含量有負向調控作用，而固氮酶活性對大豆籽粒產量和蛋白質含量起正向調控作用。施氮肥有利于地上干物質積累量的增加，但抑制大豆的結瘤和根瘤的發育。第二片三出復葉全展期(V2期)施用氮肥對大豆產量提升作用顯著，而始花期(R1期)施氮則對大豆固氮和籽粒蛋白質含量的增加作用顯著，但施氮量需要控制在N 5 mg/(kg, 土)為宜。