響應面法優化東革阿里中蛋白質的提取工藝*

張遠芳，郭雨璐，王桂霞，夏娟娟，邱繼雙，劉 芳

(湘南學院藥學院，湖南 郴州 423000)

東革阿里(Eurycomalongifolia)是苦木科東革阿里屬植物[1]，又稱為天然偉哥、鄉土人參、馬來西亞人參等，被當地視作國寶級藥材之一，主要分布在東南亞國家，比如印度尼西亞、馬來西亞、越南等國家，一般生長于海邊森林以及海拔在700 m以下的原生從林或者次生從林。其作為傳統藥材，藥用歷史悠久，東革阿里整株具極高的藥用價值，但常常以其根部入藥，東南亞民間主要用于治療男性性功能障礙[2]、抗瘧疾[3]以及抗癌[4]等，現代藥理研究表明，東革阿里還具有降血壓、降血糖、抗焦慮及抗骨質疏松等多種功效[5-7]。東革阿里主要化學成分有萜類和生物堿類，除此之外還含有揮發油、甾醇、蛋白質、木脂素等成分[8]。

蛋白質是人體重要的基礎物質，其中植物蛋白較一般谷物、豆類氨基酸種類多，具有較高的食用價值，有必要進行深入研究[9]。目前蛋白質的提取方法工藝主要有堿提酸沉法[10]、微波法[11]、鹽溶法[12]等，其中堿提酸沉法因其成本低，操作簡便而應用廣泛。目前，關于東革阿里的研究主要集中在生物堿類、萜類等成分及其生物活性的研究[13]，而對于東革阿里中蛋白質的組成、功能性質研究未見報道。因此，本文以東哥阿里為原料，采用堿提酸沉法提取東革阿里中的蛋白質，以單因素實驗數據為基礎，再結合利用響應面法優化其提取工藝，為東哥阿里的綜合利用和深入開發研究提供參考依據。

1 材 料

1.1 藥物和主要試劑

東革阿里，購自馬來西亞藥材市場，由湘南學院劉鵬老師鑒定為苦木科東革阿里屬東革阿里，標本保存于湘南學院的湖南省教育廳醫藥微生物組學重點實驗室(標本編號：20130916DGAL)。酪蛋白、考馬斯亮藍，阿拉丁試劑有限公司；乙醇、氫氧化鈉、鹽酸、磷酸均為分析純；水為超純水。

1.2 主要儀器

YB-2000A高速多功能粉碎機，永康市速鋒工貿有限公司；752紫外可見分光光度計，上海元析分析儀器有限公司；TDZ4A-WS臺式低速離心機，濟南好來寶醫療器材有限公司；FA1604電子天平，上海精科天平儀器廠；HH-2數顯恒溫水浴鍋，江蘇科析儀器有限公司。

2 試驗方法

2.1 東革阿里粉末的制備

取東革阿里藥材切片通過鼓風干燥箱進行烘干，粉碎，過篩(60目)，得到藥材粉末，備用。

2.2 考馬斯亮藍染液配制

精確稱取50 mg考馬斯亮藍試劑，用95%乙醇溶液25 mL進行溶解，然后加入85%的濃磷酸100 mL，蒸餾水稀釋至200 mL得儲備液，存于棕色瓶。臨用前用超純水按1:5的比例稀釋，配制成考馬斯亮藍染液。

2.3 酪蛋白標準曲線的繪制

標準酪蛋白溶液的配制：準確稱取75 mg酪蛋白于50 mL容量瓶中，用 0.01 mol/L氫氧化鈉溶液定容，得1.5 mg/mL的標準蛋白溶液。取不同體積的標準蛋白溶液稀釋成系列標準蛋白質溶液，依次吸取系列標準蛋白質溶液各1 mL，分別加入考馬斯亮藍染液5 mL，混勻后靜置2 min，測定在波長595 nm下的吸光度值A595，以酪蛋白標準溶液濃度為橫坐標，以吸光度值為縱坐標，繪制酪蛋白的標準曲線。

2.4 東革阿里蛋白質等電點(pI)的測定

參考文獻[14]，利用蛋白質在溶劑中溶解度最低時的pH為蛋白質等電點原理。如表1所示，取7支規格相同的干燥試管，分別編號，按下表順序準確地加入各種試劑，加入每種試劑后混合均勻。靜置20 min，觀察每支試管溶液的渾濁度，以+、++、+++、++++、+++++表示溶液的渾濁程度。結果發現4號試管最渾濁，因此測定pH=4.7為東革阿里蛋白質等電點。

表1 測定蛋白質等電點情況表Table 1 Isoelectric point of Eurycoma longifolia protein

2.5 東革阿里蛋白質提取

參考文獻[15]，利用堿提酸沉法提取東革阿里蛋白質，稱取適量的東革阿里粉末按照一定料液比(1:10～1:40) g/mL加入超純水，用0.1 mol/L NaOH溶液調節溶液pH至(9～12)，在一定溫度(30～60 ℃)下，提取一段時間(1～2.5 h)，冷卻過濾取濾液，用0.1 mol/L HCl調節pH至東革阿里蛋白質等電點，靜置12 h后，在4000 r/min的條件下離心15 min，取沉淀水洗用0.1 mol/L NaOH溶液調節至中性，得東革阿里蛋白質溶液。

2.6 東革阿里蛋白質提取率的測定

采用Bradford方法對東革阿里蛋白質溶液中的蛋白質進行含量測定。量取“2.4”項下東革阿里蛋白質溶液1 mL于試管中，加入5 mL考馬斯亮藍染液，振蕩混勻，靜置2 min，測量在595 nm下的吸光度值 A595，代入酪蛋白的標準曲線計算提取液中的蛋白質的濃度，根據以下公式計算提取率：

東革阿里蛋白質提取率(%)=提取液中蛋白質質量/樣品的質量×100%

2.7 單因素試驗

以東革阿里蛋白質提取率為指標，分別考察提取時間(0.5、1、1.5、2、2.5 h)、料液比(1:10、1:20、1:30、1:40、1:50 g/mL)、溫度(30、40、50、60、70 ℃)， pH值(9、10、11、12)進行單因素實驗，研究各因素對東革阿里蛋白質提取率影響，確定最優提取工藝參數以進行后續的響應面試驗。

2.8 單因素實驗響應面優化設計試驗

在“2.6”項單因素試驗所得的數據基礎上，根據Box-Behnken試驗理論，選取提取時間(A)、料液比(B)、溫度(C)、pH值(D)這四個單因素為自變量，運用軟件Design Expert 8.0.6進行響應面試驗優化設計，編碼見表2所示。

表2 響應面試驗設計因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface design

3 結果與分析

3.1 酪蛋白標準曲線

圖1 酪蛋白標準曲線Fig.1 Standard curve ofcasein

按照“2.3”項下的方法，得到酪蛋白的標準曲線如圖1所示，回歸方程為：A=0.1603C+0.3058(R2=0.9950)，線性范圍為0.15～1.35 mg/mL，可用于東革阿里蛋白質含量的測定。

3.2 單因素試驗結果

3.2.1 提取時間對東革阿里蛋白質提取率的影響

圖2 提取時間對東革阿里蛋白質提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction rate of protein from Eurycoma longifolia protein from citrus peel

由圖2可見，0.5～1.5 h之間，東革阿里蛋白質提取率呈現逐步上升，1.5～2.5 h之間，提取率逐漸下降，當提取時間到達1.5 h時，東革阿里蛋白質提取率達最大值1.26%，再繼續增加提取時間，可能由于長時間的加熱，對蛋白質的結構和活性產生影響，導致提取的蛋白量減少，降低了提取率。綜上，選取1.5 h為0水平，進行響應面試驗。

3.2.2 料液比對東革阿里蛋白質提取率的影響

圖3 料液比對東革阿里蛋白質提取率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of protein from Eurycoma longifolia protein from citrus peel

由圖3所示，隨著料液比的不斷增加，東革阿里蛋白質提取率存在先升高后下降的趨勢，其中在1:10～1:30(g/mL)之間時，東革阿里蛋白質提取率隨著料液比的增加而顯著升高，在1:30～1:50(g/mL)之間，東革阿里蛋白質提取率反而下降，可能原因是料液比越大，增大了提取液黏度，影響蛋白質的溶出，導致不能充分提取東革阿里中的蛋白質，降低其蛋白質提取率，因此選擇料液比1:30(g/mL)為0水平，進行后續的響應面試驗。

3.2.3 溫度對東革阿里蛋白質提取率的影響

圖4 溫度對東革阿里蛋白質提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction rate of protein from Eurycoma longifolia

由圖4可知，東革阿里蛋白質提取率隨提取溫度的升高，先增大后減小，當溫度在50 ℃時，東革阿里蛋白質提取率最大。最初升高溫度有利于蛋白質的擴散、溶出，故提取率增大，而當溫度高于50 ℃時，可能出現蛋白質受熱變性，黏度增加，或雜質溶解度增大等，導致東革阿里蛋白質提取率減小。因此選擇溫度為50 ℃進行后續的響應面試驗。

3.2.4 pH對東革阿里蛋白質提取率的影響

圖5 pH對東革阿里蛋白質提取率的影響結果Fig.5 Effect of pH on extraction rate of protein from Eurycoma longifolia

由圖5所示，東革阿里蛋白質提取率隨著pH的變化先上升后下降，于pH=11 時，東革阿里蛋白質提取率達到最大值1.89%，當溶液pH>11時，東革阿里蛋白質提取率下降，這可能是因為蛋白質于強堿條件下溶解度較大，而當pH>11會破壞蛋白質結構，同時淀粉會糊化，不易于蛋白質的溶出，導致蛋白質提取率下降。故選取pH為11進行后續的響應面試驗。

3.3 響應面優化東革阿里蛋白質提取工藝試驗

3.3.1 響應面優化條件設計及結果

以4個單因素為自變量，以東革阿里蛋白質提取率的值為響應面的響應值，通過利用Box-Behnken方法進行設計優化試驗，具體設計方案及結果見表3所示。

表3 東革阿里蛋白質工藝響應面試驗設計結果Table 3 Experimental design and results for response surface analysis of Eurycoma longifolia protein

3.3.2 響應面模型的建立和分析

通過Design-Expert 8.0.6軟件對響應面結果進行擬合分析，得到以提取時間、料液比、溫度、pH 為自變量，以東革阿里蛋白質提取率為響應面響應值的二元回歸方程：

蛋白質提取率Y=2.06+0.39A+0.093B+0.036C+0.4D+0.012AB-0.13AC+0.083AD-0.045BC-7.5×10-3BD-0.095CD-0.36A2-0.51B2-0.82C2-0.65D2

表4 回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance in regression model

根據表3數據進行相應的方差分析，結果見表4。此模型的回歸系數R2=0.9509，決定系數RAdj2=0.9018，說明提取率的實際值與預測值在試驗范圍內擬合較好，該模型P<0.0001具有極顯著性，失擬誤差P=0.4266>0.05，表示失擬項不顯著，說明該模型擬合度良好，實驗方法設計合理，對響應面的變化具有較好的反映。通過比較各因素的F值，可依次得出對試驗指標影響程度的大小，依次排序為pH(D)>提取時間(A)>料液比(B)>溫度(C)。根據P值大小，可知模型中一次項A、D極顯著，二次項A、B、C、D極顯著，交互項均不顯著，表明各因素之間交互效應較弱，各因素與東革阿里蛋白質提取率之間不是簡單的線性關系。

3.3.3 響應面分析

通過響應面3D圖的曲面坡度程度，直觀反映每兩個因素之間對東革阿里蛋白質提取率的影響程度。響應面曲面越陡，表明兩個因素的交互作用影響越大，對響應值的影響越大，反之影響越小。如圖6a～圖6f所示，其中pH和提取時間的曲面最陡，交互作用較明顯，對東革阿里蛋白質提取率的影響較為顯著。

圖6 各因素交互作用對東革阿里蛋白提取率影響Fig.6 The effect of interaction of various factors on the extraction rate of Eurycoma longifolia protein

3.3.4 最佳工藝條件的驗證試驗

利用Design-Expert 8.0.6軟件對東革阿里蛋白質提取工藝參數進行優化，確定最佳工藝條件為：提取時間為1.8 h、料液比為1:30.99(g/mL)、溫度為49.51 ℃、pH為11，預計東革阿里蛋白質提取率為2.25%。考慮實際的試驗操作性，將工藝參數修正為：提取時間為1.8 h、料液比為1:30(g/mL)、溫度為50 ℃、pH為11。平行進行3次試驗，得到蛋白質的提取率為2.04%。該結果與模型預測值基本一致。可見，此模型適用東革阿里蛋白質提取，方法具有可行性。

4 結 論

本實驗采用堿提酸沉法提取東革阿里中的蛋白質，在單因素基礎上結合響應面法優化其提取工藝，建立的模型能較好的預測東革阿里蛋白質含量，并確定最佳提取工藝為：提取時間為1.8 h、料液比為1:30(g/mL)、溫度為50 ℃、pH為11，東革阿里中蛋白質的提取率為2.04%。此工藝設計合理，方法簡單，重復性好，為東革阿里蛋白質的開發利用提供科學依據。