基于HPLC法同時測定人血清中4種抗癲癇藥物濃度且與CLIA法檢測值的一致性評價

趙 娜，史永志，曹 賢，肖 音，韓曉燕，牛藝璇，肖 斌（.鄂爾多斯市中心醫院臨床藥學實驗室，內蒙古鄂爾多斯 07000；.鄂爾多斯市中心醫院重癥醫學科，內蒙古 鄂爾多斯 07000；.鄂爾多斯市中心醫院醫學檢驗科，內蒙古 鄂爾多斯07000；.海口市人民醫院/中南大學湘雅醫學院附屬海口醫院，海南 海口 57008）

癲癇屬于慢性神經系統疾病，目前預防癲癇發作的基本手段是藥物治療，目標是在無明顯不良反應前提下完全控制癲癇發作[1]，大部分癲癇患者需要長期甚至終身服藥[2]，不少患者需同時服用兩種或兩種以上抗癲癇藥物。傳統觀念認為治療效果與藥物劑量直接相關，但許多臨床實踐證明劑量與療效之間并不完全平行，存在明顯的“化學上等價而生物學上不等價”現象。抗癲癇藥物體內代謝大多呈非線性藥動學特點、藥物間相互作用復雜，難以通過藥效學指標來確定最佳劑量，因此治療藥物監測（therapeutic drug monitoring，TDM）就顯得尤為重要。TDM是將藥代動力學原理與血藥濃度監測相結合，指導臨床合理用藥[3-4]。卡馬西平（carbamazepine，CBZ）、苯巴比妥（phenobarbital，PB）、苯妥英鈉（phenytoin sodium，PHT）、拉莫三嗪（lamotrigine，LTG）是臨床中常用的抗癲癇藥物，筆者采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）建立同時測定人血清中上述4種藥物的濃度方法，旨為臨床治療提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津高效液相色譜儀（日本島津公司）、雅培ARCHITECT i1000sr全自動免疫分析儀（美國雅培公司）、HMS-350小型漩渦振蕩器（天津恒奧科技發展有限公司）、TGL-16G離心機（上海安亭科學儀器廠）、 GM-1.0A隔膜真空泵（天津津騰實驗設備有限公司）、KQ-500DE數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、PRACTUM5101-1CN分析天平（德國賽多利斯公司）。

1.2 試藥

CBZ對照品（德國Dr.Ehrenstorfer GmhH，批號：CDCT-C10968500，含量：99.5%），PB對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：171222-201206，含量：99.7%），PHT對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100210-201303，含量：99.0%），LTG對照品（加拿大Toronto Research Chemicals lnc，批號：CDDML173250-50mg，含量：98.0%），甲醇（天津市康科德科技有限公司，批號：2019MH007，HPLC色譜純，含量：99.9%），水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與血清樣品預處理

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相：甲醇-水（44∶56），柱溫：37 ℃，檢測波長：218 nm，流速：0.9 mL·min-1，進樣量：20 μL，全自動進樣。精密量取空白血清200 μL，置5 mL離心管，加甲醇600 μL作為蛋白沉淀劑，渦旋振蕩2 min，15 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液，經孔徑0.22 μm有機微孔濾膜過濾2次，取20 μL進樣分析。

2.2 試液的制備

2.2.1 對照品儲備液的制備精密稱取CBZ、PB、PHT和LTG各對照品適量，甲醇溶解并定容至25 mL量瓶，配制成濃度為1.0、5.0、1.0、1.0 mg·mL-1的儲備液，分別用移液槍精密移取各對照品儲備液適量，用甲醇稀釋成標準系列濃度，置– 20 ℃冰箱保存。

2.2.2 標準血樣的制備取上述CBZ、PB、PHT和LTG的標準系列濃度儲備液，加入適量空白血清，配成CBZ 1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、48.0 μg·mL-1，PB 1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00 μg·mL-1，PHT 1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、48.0 μg·mL-1，LTG 0.63、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00 μg·mL-1的系列濃度混合標準血樣。

2.3 患者血樣的獲取

采集服用此類藥物的癲癇患者血清樣本，嚴格控制在藥物達到穩態血藥濃度后（一般為給藥后5 ～ 6個半衰期）[3]的谷濃度時采血，即下一周期給藥前。取靜脈血2 ～ 3 mL于黃色生化采血管，盡快送檢。

2.4 實驗方法

2.4.1 化學發光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）依據雅培ARCHITECT i1000sr全自動免疫分析儀的標準操作規范測定血藥濃度。測定每批次樣本時，用質控樣品進行平行測定，若質控樣本超出標示范圍，校正標準曲線，并于當日測定患者血清樣本濃度。

2.4.2 HPLC法采用“2.1”項下建立的測定方法學，使用高、中、低濃度質控樣本平行測定，測定值RSD＜ 15%，最低檢測限RSD ＜ 20%，以保證同一分析批次測定值準確性，于當日測定患者血清樣本濃度。

2.5 結果

2.5.1 專屬性實驗由圖1可知，血清中內源性物質不干擾同時測定CBZ、PB、PHT以及LTG血藥濃度。CBZ、PB、PHT、LTG保留時間分別為27.6、10.4、22.4、8.6 min，四者分離度良好。

圖1 HPLC色譜圖A – 空白血清，B – 血清樣本，C – LTG對照品，D – PB對照品，E – PHT對照品，F – CBZ對照品；1 – 拉莫三嗪，2 – 苯巴比妥，3 – 苯妥英鈉，4 – 卡馬西平Fig 1 HPLC chromatogramA – blank serum, B – serum samples, C – LTG reference substance, , D – PB reference substance, E – PHT reference substance, F – CBZ reference substance; 1 – LTG, 2 – PB, 3 – PHT, 4 – CBZ

2.5.2 線性關系及最低檢測限分別精密量取CBZ、PB、PHT和LTG對照品系列濃度儲備液各20 μL，加入空白血清120 μL，配制成系列標準血樣濃度，按照“2.1”項下方法沉淀蛋白，以被監測藥物對應的峰面積Y與相應濃度X進行線性回歸，見表1。

表1 4種抗癲癇藥物線性范圍、標準曲線、相關系數和最低檢測限Tab 1 Linear range, standard curve, correlation coefficient and minimum detection limit of the 4 antiepileptic drugs

2.5.3 精密度與回收率實驗空白血清加入適量系列標準品儲備液，制成含4種抗癲癇藥物的低、中、高濃度標準血清樣本溶液各5份，按“2.1”項下方法處理，所得樣本溶液分別連續進樣分析；在不同天內分別制備低、中、高5批樣本，每個樣本連續進樣5次并連續進樣5 d；分別考察相對回收率及日內、日間精密度。檢測結果均符合方法學要求，見表2。

表2 CBZ、PB、PHT、LTG精密度和回收率. n = 5Tab 2 Precision and recovery of CBZ, PB, PHT and LTG. n = 5

2.5.4 穩定性實驗分別考察4種抗癲癇藥物低、中、高濃度質控樣品在不同保存條件下的穩定性。結果表明，質控樣品在室溫放置0、2、4 h，–4 ℃保存12 h，–20 ℃保存一周并反復凍融3次，含藥血清樣本穩定性良好。見表3。

表3 CBZ、PB、PHT、LTG穩定性考察Tab 3 Stability investigation of CBZ, PB, PHT and LTG

2.6 臨床應用及檢測方法對比分析

筆者采集了24例使用CBZ的癲癇患者血清標本，分別采用HPLC法與CLIA法測定，詳見表4。使用SPSS 17.0和MedCalc 19.1.3統計軟件進行分析。兩種方法CBZ測定值經K-S正態性檢驗均近似正態分布；二者相關系數r= 0.955，經雙側Pearson檢驗，P＜ 0.001，差異有統計學意義，可見使用免疫法與色譜法檢驗的結果高度相關；經F顯著性檢驗，F=228.411，P＜ 0.001，差異有統計學意義，即此回歸方程可建立，回歸方程為Y= 1.371 + 0.856X，r= 0.912。

表4 使用CBZ患者的血藥濃度分析. mg·L-1Tab 4 Analysis of blood concentration of patients with CBZ. mg·L-1

進一步考察兩種方法檢測結果差異，首先對所得數據進行配對t檢驗分析，兩種方法測定值間差異有統計學意義（t= 3.216，P＜ 0.01）。Bland-Altman偏差分析顯示，兩種方法測定值RE絕大多數為正偏差，平均值0.64%（95%CI：–1.27% ～ 2.56%）。上述結果均說明CLIA法與HPLC法檢測值差異有統計學意義，且CLIA法檢測值稍高于HPLC法檢測值。朱旭等[5]研究熒光偏振免疫（fluorescence polarization immunoassay，FPIA）法檢測值顯著高于HPLC法，可見CLIA法與HPLC法檢測結果較FPIA接近。免疫法檢測值高于HPLC法，初步考慮可能由于CBZ的活性代謝產物10,11-環氧卡馬西平的化學結構與原藥相似，且有著類似的抗原表區，均可發生抗原抗體反應，采用免疫法較難將其完全分開，從而導致檢測藥物濃度與實際濃度存在一定偏差[5-7]。但由于樣本量有限需要在臨床上繼續收集大量樣本進行深入研究。

3 討論

3.1 抗癲癇藥物濃度監測的必要性

目前全球癲癇患者約5000萬例，我國癲癇患者約有1000萬例，且以每年45萬例的速度增長[8]。盡管新型抗癲癇藥物不斷涌現，但是我國仍有25%患者因未能實施個體化用藥指導，導致癲癇控制不理想[9]。CBZ、PB、PHT為傳統抗癲癇藥物，治療窗窄且為肝藥酶誘導劑，藥物代謝易受基因多態性的影響[10]，藥物間相互作用較復雜，又具有非線性藥動學特點，利用藥效學指標較難制定個體化用藥方案。因此在臨床使用中傳統抗癲癇藥物均應開展TDM[11-13]。LTG屬于新型抗癲癇藥物，此類藥物安全性較傳統藥物高[14]，研究[15-17]表明，雖然LTG安全性較高，但其體內藥動學較復雜，且受年齡、性別、體重、合并用藥、特殊生理狀態及葡萄糖醛酸轉移酶影響[18]，因此達到有效血藥濃度所需劑量個體差異也較大，有必要進行TDM[19-20]。筆者選用HPLC法建立同時監測臨床常用傳統抗癲癇藥物與新型抗癲癇藥物濃度的方法學，檢測成本較低，且有助于進一步研究藥物間相互作用，更深入指導臨床合理用藥，還可為藥物濫用以及藥動學研究提供科學思路與依據。

3.2 生物樣品預處理技術選擇與考察

血藥濃度檢測中，生物樣本預處理常用方法有提取法和蛋白沉淀法。提取法中液-液萃取法應用較多，其優點在于其較強選擇性，一定程度上可以保護色譜柱，缺點是容易發生乳化，引起藥物損失，而且操作復雜耗時[21]。筆者曾嘗試使用二氯甲烷、正己烷等作為提取劑，發現在渦旋振蕩時易發生乳化，故最終選用蛋白沉淀法，該方法簡便、快速，滿足臨床血藥濃度監測需要[22]。常見的蛋白沉淀劑是乙腈和甲醇。有研究表明當含藥的血清或血漿與水性有機溶劑的體積比為1∶（1 ～ 30）時，可以將90%以上蛋白質去除[23]，故選用血清:甲醇=1∶3比例，此條件下可去除95%以上蛋白質[23]。樣品離心后取上清液經孔徑0.22 μm微孔濾膜過濾2次，經驗證發現處理后樣品干擾較少。

3.3 檢測波長及流動相考察

通過查閱2020年版《中華人民共和國藥典》發現，在各自適宜條件下，CBZ在238 nm與285 nm波長處有最大吸收；PB吸收波長220 nm；PHT在248 nm波長處存在最大吸收；LTG最大吸收峰在波長（306±2）nm。筆者分別考察了210、215、218、220、240 nm等波長，經比較，在218 nm處內源性物質干擾較小，且LTG信號響應較強，有利于濃度較低的LTG檢出。文獻[24-25]使用的流動相中均含無機鹽或酸，以及梯度洗脫分析，平衡系統和檢出后色譜柱沖洗時間較長，干擾因素較多，不利于色譜柱保護，實際操作較繁瑣。因此，筆者考察了甲醇-水系統與乙腈-水系統，研究發現二者分離效果相當，乙腈-水系統柱壓雖較小，但藥物保留時間長于甲醇-水系統，綜合考慮各方面因素，筆者選用甲醇-水（44∶56）為流動相。此色譜條件下，上述4種抗癲癇藥物可以很好分離，不受血清內源性物質干擾，各藥物峰型良好，符合方法學要求。

3.4 HPLC法與免疫法在TDM中的對比分析

當前關于血藥濃度監測，HPLC法與免疫法在國內外的醫院都得到了廣泛的應用。HPLC-MS、UHPLC-MS/MS等應用較多，但由于儀器價格較高，在基層醫院具有一定局限性。以往抗癲癇藥物濃度監測多針對方法學建立[4]，少部分學者建立了監測卡馬西平濃度的HPLC法，并與FPIA法進行比較[5,26]。但此類研究僅針對早期FPIA與HPLC法之間的差異，對于CLIA法與HPLC法之間的差異性研究較少。因此筆者建立了同時監測4種抗癲癇藥物的方法學，并收集24例使用CBZ的患者血清樣本，分別采用HPLC法與CLIA法檢測，結果顯示CLIA法與HPLC法的檢測結果較FPIA接近，CLIA法檢測值稍高于HPLC法檢測值，但由于樣本量較少，需擴充臨床樣本量進一步驗證。

綜上，本研究中建立的同時監測4種抗癲癇藥物的方法靈敏度、精密度、準確性均較高，操作簡便，臨床應用成本較低，HPLC法與免疫法各具優缺點，可以根據臨床需求以及本單位實際情況選擇適宜的方法應用。