線粒體自噬參與NLRP3介導的炎癥反應在腦卒中康復中的作用

王 維， 李振東， 張誠誠， 張月娟

神經炎癥是整個腦卒中康復過程中一個關鍵而復雜的病理生理過程，涉及早期損傷到缺血后組織修復[1]。研究表面，Nod樣受體蛋白-3(Nod-like receptor pyrin domain3，NLRP3)炎癥小體可能對介導炎癥反應和誘導卒中后細胞損傷和死亡至關重要[2,3]。NLRP3炎癥小體由NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白(包含caspase激活的招募域和前體caspase-1)組成，通過caspase-1激活觸發IL-1β和IL-18的釋放，在缺血性腦卒中發揮重要作用[4]。隨后，IL-1β和IL-18都參與炎癥反應的啟動和放大[4]。然而，NLRP3炎性體在缺血性卒中中的具體細胞位置和信號通路仍不清楚。據報道，線粒體功能障礙在一些炎癥性疾病中激活NLRP3炎癥體，如代謝綜合征、動脈粥樣硬化、神經退行性變和腎病[5,6]。然而，目前還沒有明確的證據表明線粒體自噬與NLRP3炎癥體在腦卒中中的關系。本研究旨在闡明這些問題，以揭示神經炎癥在介導缺血性卒中損傷中的更多細節。

1 材料與方法

1.1 動物模型建立和分組 健康的雄性280～320 g Sprague-Dawley大鼠從廣東省醫學實驗動物中心[許可證號：SCXK(粵)2018-0029]獲得。將大鼠飼養在溫度(25±2)℃和濕度可控制的房間中。使動物保持在12 h：12 h的光/暗循環下，自由進食和飲水。大鼠隨機分為6組，每組8只：假手術組(Sham)、Sham+雷帕霉素(Rapamycin，RAPA)組、再灌注后6 h組(I/R 6 h)、I/R 6 h+RAPA組、再灌注后24 h(I/R 24 h)和I/R 24 h+RAPA組。參照文獻方法建立短暫性大腦中動脈閉塞(Transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO)模型，以刺激大鼠的缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷[7]。大鼠通過腹腔注射戊巴比妥(100 mg/kg)誘導麻醉，在頸部做中線切口以暴露右頸外動脈。然后，將一條單絲(北京西濃科技有限公司)插入頸內動脈中，經過頸外動脈，直至感覺到輕度阻力，表明該細絲已正確地放置在近端大腦前動脈的一部分，并阻塞了流向大腦中動脈的血液。將單絲放置在原位120 min，然后抽出以誘導再灌注。當大鼠恢復意識時，出現左前肢麻痹或打圈運動，并且當單絲移開大腦時沒有觀察到腦出血的梗死組織，表明模型成功建立。假手術作為對照，除沒有插入單絲和隨后的再灌注，其余操作同tMCAO方法。藥物組在再灌注后立即以4 mg/kg的劑量腹腔注射RAPA(一種典型的自噬誘導劑，在使用前先溶解在無菌的DMSO溶液中，劑量參照文獻報道[8])。其余組動物接受等體積的DMSO溶液。

1.2 免疫熒光分析 再灌注6 h和24 h后取腦，4 ℃下用4%多聚甲醛固定過夜。蔗糖梯度脫水后進行冰凍切片。然后，將10 μm厚的冠狀切片在室溫下用含0.5%Triton X-100的10%山羊血清封閉30 min，然后用小鼠抗caspase-1(英國Abcam公司，1∶50)抗體和兔抗Iba1抗體(美國Wako公司，1∶250)或兔抗NeuN抗體(Abcam，1∶50)或兔抗GFAP抗體(Abcam，1∶250)在4 ℃過夜。切片用PBS洗滌3×10 min，然后用Alexa-Fluor 488共軛山羊抗鼠IgG(上海Beyotime公司，1∶500)和Alexa-Fluor 555共軛驢抗兔IgG(Beyotime，1∶500)的混合物在室溫下孵育1 h，再用DAPI染色5 min。使用lx71熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)采集缺血核心皮質區域的圖像。不同類型神經細胞中caspase-1陽性細胞的百分率。

1.3 腦組織線粒體形態分析 取1 mm3缺血核心皮質區域腦組織，分別用4%戊二醛、四氧化鋨固定。用PBS沖洗后，組織經梯度酒精脫水。將包埋劑和100%丙酮按1∶1比例孵育1 h，將組織塊進行超薄切片，枸櫞酸鉛染色。采用H-7700透射電鏡(日本Hitachi公司)對切片進行超微結構檢查。

1.4 BV2小膠質細胞培養和處理 BV2細胞購自美國典型培養物保藏中心。將BV2細胞接種在含有10%熱滅活胎牛血清(美國Gibco公司)和1%青霉素/鏈霉素(美國HyClone公司)的DMEM/F12培養基(Gibco)中培養。使用Lipo3000(美國Invitrogen公司)將si-NLRP3 siRNA(正向，5’-GUACUUAAAUCGUGAAACAdTdT-3’；反向，3’-dTdTCAUGAAUUUAGCACUUUGU-5’)或si-NC(核糖核酸)轉染BV2細胞。轉染24 h后，將BV2細胞進行氧-糖剝奪/復氧(Oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)處理。具體操作：用無葡萄糖DMEM培養基(美國Gibco公司)代替培養基，然后將培養板放入含有95%N2和5%CO2的混合氣體的MIC-101缺氧培養箱(美國Billups Rothenberginc公司)，孵育4 h，然后恢復正常氣體和培養基，誘導OGD/R模型。將siRNA轉染和OGD/R處理組分為以下幾組：對照組(NC)、OGD/R組(OGD/R)、OGD/R+si-NC組(si-NC轉染)、OGD/R+si-NLRP3組(用si-NLRP3轉染)、NC+RAPA組和OGD/R+RAPA組。需要藥物治療的細胞組在復氧后用含25 nmol/L RAPA的DMEM/F12培養基處理，其他組用PBS作為對照。

1.5 線粒體膜電位測量(Δψm) 用JC-10染色法測定神經細胞線粒體膜電位。JC-10是一種親脂性陽離子菁染料，在線粒體基質中呈現紅色熒光聚集體。當失去膜電位時，這些聚集體分解成綠色熒光單體。細胞與10 μg/ml JC-10在37 ℃黑暗條件下孵育45 min。然后用流式細胞儀(美國BD-FACSVerse公司)對細胞進行分析，激發發射波長為488 nm，發射波長為530 nm。測量聚集體(紅色熒光)和單體(綠色熒光)的百分比。線粒體去極化以綠色熒光強度的百分比表示。

1.6 Western blot分析 用RIPA緩沖液(上海Beyotime公司)裂解缺血皮質或細胞提取總蛋白。通過BCA試劑盒評估蛋白質含量。采用10%SDS-PAGE電泳將蛋白質轉移到PVDF膜上(美國Invitrogen公司)。將膜用5%脫脂牛奶封閉1 h，然后在4 ℃下用以下一抗封閉過夜：NLRP3(1∶1000)、caspase-1(1∶1000)、IL-1β(1∶1000)、LC3-Ⅰ/Ⅱ(1∶800)和GAPDH(1∶1000，均購自英國Abcam公司)。將PVDF膜與抗兔IgG(美國MultiSciences公司，1∶5000)在室溫下孵育1 h。使用蛋白質印跡檢測化學發光試劑盒(南京凱基生物科技發展有限公司)觀察目標條帶。

2 結 果

2.1 在I/R損傷過程中NLRP3炎性體激活的細胞位置變化情況 在缺血損傷區觀察到，I/R損傷后6 h，切割的caspase-1主要在小膠質細胞中表達[(88.4±1.1)%]，在其他細胞類型中很少表達。然后，切割的caspase-1在24 h時主要在神經元[(63.4±2.2)%]中表達，而在小膠質細胞[(12.2±1.1)%]中表達降低(見圖1A、圖1B)。

圖1 在I/R損傷過程中NLRP3炎性體激活的細胞位置變化情況。A：切割的caspase-1在假手術和腦I/R后6 h和24 h小膠質細胞、星形膠質細胞和神經元中的表達(放大倍數：×200，比例尺=100 μm)；B：腦I/R后6 h和24 h切割的caspase-1陽性細胞在不同類型細胞中的百分率。與I/R后6 h相比***P<0.001

2.2 NLRP3激活小膠質細胞的炎癥小體途徑 與NC相比，在OGD/R后，BV2細胞中NLRP3的蛋白水平隨著時間的推移而增加，尤其是在24 h(均P<0.01)。當通過si-NLRP3轉染使BV2細胞中NLRP3表達沉默時，觀察到在OGD/R后，切割的caspase-1和切割的IL-1β表達水平顯著下調(P<0.05)，提示NLRP3介導小膠質細胞的炎癥小體途徑激活(見圖2A、圖2B)。

圖2 Western blot檢測NLRP3炎性體在BV2細胞中的表達。A：OGD/R后不同時間點NLRP3在BV2細胞中的表達；B：轉染si-NLRP3對OGD/R處理的BV2細胞中NLRP3、pro-caspase-1、caspase-1、pro-IL-1β和IL-1β的表達。與NC相比*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與OGD/R 24 h+NC相比#P<0.05，##P<0.01

2.3 I/R損傷和OGD/R過程中腦組織線粒體形態學變化和自噬情況 假手術組大鼠線粒體完整，嵴光滑透明，間質均勻。I/R損傷后6 h，線粒體腫脹，嵴斷裂，基質密度降低，線粒體空泡化。I/R損傷后24 h，大量線粒體被破壞，自噬體少見。體外試驗顯示，在OGD/R后，BV2細胞中LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉化隨著時間的推移而減少，尤其是在24 h(均P<0.01)。表明OGD/R抑制了BV2細胞的自噬水平(見圖3A、圖3B)。

圖3 在I/R損傷和OGD/R過程中腦組織線粒體形態學變化和自噬情況。A：透射電鏡顯示假手術和I/R后6 h和24 h大鼠腦組織線粒體損傷的典型圖像(放大倍數：×16000)；B：OGD/R對BV2細胞自噬標記物LC3蛋白表達的影響。與對照組相比*P<0.05，**P<0.01；與OGD/R 4 h組相比###P<0.001

2.4 自噬誘導劑可抑制OGD/R損傷時NLRP3炎性體的激活 用JC-10和流式細胞術檢測各組線粒體膜電位(Δψm)提示，JC-10形成聚集體，在Q2象限顯示紅色熒光。暴露于OGD/R后24 h，BV2細胞中Q3象限細胞比例增加，聚集體分解為綠色熒光單體。細胞表現出低膜電位(綠色熒光)的百分比表明膜電位丟失。與OGD/R組相比，自噬誘導劑RAPA能夠挽救線粒體的損傷(P<0.05)。接下來，研究分析了線粒體功能障礙與NLRP3炎癥體之間的關系，結果顯示，RAPA可抑制OGD/R誘導的BV2細胞中NLRP3、切割的caspase-1和切割的IL-1β表達水平上調(P<0.05)(見圖4A～D)。

圖4 OGD/R后BV2細胞線粒體自噬抑制可激活NLRP3炎性體。A、B：流式細胞術觀察各組低細胞膜電位的百分比及定量分析；C、D：自噬誘導劑RAPA對OGD/R處理的BV2細胞中NLRP3、pro-caspase-1、caspase-1、pro-IL-1β和IL-1β的表達。與NC相比**P<0.01；與OGD/R 24 h相比#P<0.05

2.5 自噬誘導劑抑制腦I/R損傷時NLRP3炎性體的激活 I/R+RAPA組在腦I/R損傷后6 h或24 h時，小膠質細胞[(12.7±1.8)% vs (70.0±2.0)%]和神經元[(11.9±1.9)% vs (70.8±1.7)%]中切割的caspase-1的表達均顯著低于I/R組(P<0.001) 。這些結果表明，自噬誘導劑在腦I/R損傷中能抑制NLRP3炎性體的激活，提示線粒體功能障礙在腦I/R損傷中起重要作用(見圖5A～C)。

圖5 自噬誘導劑可抑制腦I/R后NLRP3炎性體的活化。A：切割的caspase-1在腦I/R后6 h和24 h小膠質細胞和神經元中的表達；B：腦I/R后6 h切割的caspase-1陽性細胞在小膠質細胞的百分率；C：腦I/R后24 h切割的caspase-1陽性細胞在神經元中的百分率。與Sham相比***P<0.001；與I/R后6 h或24 h相比***P<0.001

3 討 論

最近，在I/R損傷后的一些器官中發現了NLRP3炎癥體，如大腦、心臟、腎臟和睪丸[9]。據報道，損傷相關分子模式是激活NLRP3的關鍵初始刺激[10]。NLRP3可激活前半胱氨酸蛋白酶-1裂解成活性片段，然后裂解的半胱氨酸蛋白酶-1誘導形成成熟的促炎細胞因子，即IL-1β和IL-18[4]。這些細胞因子隨后啟動或放大多種下游信號通路，以驅動促炎癥過程，導致細胞損傷，并可能會釋放損傷相關分子以誘導更多炎癥[11]。在小鼠腦內，觀察到LPS刺激后，小膠質細胞中出現NLRP3、ASC和caspase-1的表達，而星形膠質細胞中未檢測到這種表達，表明小膠質細胞可能是參與功能性NLRP3炎癥體形成的主要部位[12]。此外，Zhang等發現，在OGD/R條件下，原代皮質神經元中NLRP3炎癥體蛋白和IL-1β和IL-18的水平上調[13]。相反，在MCAO小鼠模型中，Sun等證明NLRP3在小膠質細胞和血管內皮細胞中表達，但在神經元中不表達[2]。因此，NLRP3炎性體在腦I/R損傷中的特異性表達和分布尚未得出結論。

在本研究中，我們選擇大鼠作為動物模型，因為大鼠的基因與人類的基因相對接近，并動態觀察了I/R損傷后NLRP3炎性體途徑的細胞定位。結果顯示，在tMCAO大鼠中裂解的caspase-1主要在24 h內的缺血核心區域表達，并且活化的炎癥小體在腦I/R損傷后首先在小膠質細胞中形成，但在星形膠質細胞中不形成，然后在24 h內主要在神經元中表達。而當BV2細胞中的NLRP3 siRNA轉染使NLRP3表達沉默時，觀察到在OGD/R后，切割的caspase-1和切割的IL-1β表達水平顯著下調，提示NLRP3介導小膠質細胞的炎癥小體途徑激活。先前的一項研究表明，NLRP3炎性體誘導了caspase-1依賴性焦磷酸化，可能是氯胺酮誘導的海馬神經毒性中與線粒體相關凋亡相關的重要途徑[14]。這些先前的結果與本研究結果一致。因此，小膠質細胞是腦I/R損傷后早期激活的NLRP3炎性小體的主要來源，可能驅動促炎過程，導致細胞死亡和破壞，并在后期主要聚集在神經元中，誘發神經元死亡和血腦屏障完整性障礙[15]。

線粒體對I/R損傷極為敏感。NLRP3炎癥體的升高引起線粒體通透性轉換孔的開放和線粒體極化，導致線粒體膜電位和mPTP開放降低，從而導致線粒體自噬[16]。線粒體自噬不僅選擇性地清除受損的線粒體，而且阻止受損線粒體產生ROS，并可改善炎癥反應[17]。因此，中度自噬是正常代謝中不可或缺的一部分，可清除受損蛋白質，并在腦損傷中發揮神經保護作用。研究表明，氧化苦參堿通過促進SIRT1介導的自噬來減輕缺血性卒中引起的認知障礙[18]。此外，許多神經保護藥物被認為可以通過激活自噬來減輕缺血誘導的繼發性腦損傷[19]。同樣，本研究觀察到，I/R損傷后大量線粒體被破壞，自噬體減少，并且暴露于OGD/R的BV2細胞中LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉化隨著時間的推移而減少，表明OGD/R抑制了BV2細胞的自噬水平。此外，自噬誘導劑RAPA可以通過上調線粒體自噬水平來保護線粒體的功能，這與先前發現RAPA可阻止氧化應激缺血環境中mPTP開放和線粒體去極化的研究一致[20]。因此，我們使用RAPA來確定BV2細胞中線粒體自噬和NLRP3炎性體之間的關系。結果表明，線粒體自噬在OGD/R后BV2細胞NLRP3炎性體途徑的激活中起重要作用，RAPA能有效減輕BV2細胞NLRP3炎性體反應，并且RAPA能抑制I/R損傷后NLRP3炎性體的激活，提示線粒體自噬在腦I/R損傷中起重要作用。

綜上所述，本研究確定了腦I/R損傷后NLRP3炎性體途徑細胞定位的動態變化，表明小膠質細胞是腦I/R損傷早期激活NLRP3炎性體的主要來源，隨著時間的推移，NLRP3炎癥小體在神經元中被激活。此外，線粒體自噬下調是激活小膠質細胞NLRP3炎性體的關鍵，自噬誘導劑可有效減輕OGD/R和腦I/R損傷后小膠質細胞和神經元的NLRP3炎性體反應。