菊苣酸調控p38 MAPK/NF-κB/NLRP3信號通路對缺血性腦卒中大鼠神經元凋亡及炎癥反應的影響

張富慧， 郝靜峰， 張自艷， 王志海， 律 靜

缺血性腦卒中可導致患者肢體殘疾或認知功能障礙，腦缺血會引起神經細胞凋亡，炎癥反應、氧化應激等是缺血性腦卒中的病理損傷機制，減少神經細胞凋亡、抑制炎癥反應對缺血性腦卒中具有保護作用[1,2]。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(NLRP3)與神經炎性損傷發生發展密切相關，核因子-κB(NF-κB)是激活NLRP3炎癥小體的重要因子，p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)可通過NF-κB通路調節炎癥因子表達，介導炎性損傷，p38 MAPK/NF-κB/NLRP3信號通路對炎癥性疾病發揮重要的調控作用[3]。

菊苣酸(chicoric acid，CA)是從菊苣葉中提取的酚類物質，具有抗氧化、抗炎、抗病毒、心肌保護的作用[4]。研究顯示CA可通過抑制p38 MAPK和NF-κB信號通路，改善炎癥誘導的小鼠認知功能障礙，通過調節抗炎抗氧化作用保護神經損傷[5]。CA對缺血性腦卒中的影響及其機制尚不清楚，本研究探索CA對缺血性腦卒中大鼠神經元凋亡、炎癥反應及p38 MAPK/NF-κB/NLRP3信號通路的影響，初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 動物 SPF級健康雄性SD大鼠，6～8周齡，體質量(230±20)g，購自中山大學實驗動物中心，動物生產許可證號：SCXK(粵)2020-0006，大鼠飼養環境為：(23±2)℃，濕度(60±5)%， 12 h明/暗循環，自由飲水進食。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.1.2 主要藥物和試劑 CA(原料藥，純度99.95%，批號C7243)購自武漢東康源科技有限公司；p38 MAPK激活劑(Anisomycin)(批號SC0132)購自美國MCE公司；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色液(批號T8877)、尼氏(Nissl)染色液(批號SF3627)、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(批號C1917)、大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)(批號KS40173)、白細胞介素(IL)-1β(批號KS41256)、IL-6(批號KS50197)酶聯免疫吸附檢測試劑盒、蛋白裂解液(批號KL10647)均購自上海碧云天生物技術有限公司；兔抗鼠磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)(批號9215)、p38 MAPK(批號9212)、磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)(批號3039)、NF-κB p65(批號8242)、NLRP3(批號15101)、β-肌動蛋白(β-actin)(批號01247)單克隆抗體、羊抗兔二抗(批號06211)均購自美國CST公司。

1.1.3 主要儀器 組織切片機(型號YD-315)、熒光顯微鏡(型號JS-750T)、凝膠成像系統(型號JS-M6PH)均購自上海玉研科學儀器有限公司；酶標儀(型號SY96A)購自山東方科儀器有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 缺血性腦卒中模型制備、分組及給藥 采用改良線栓法[6]制備缺血性腦卒中大鼠模型，操作如下：異氟烷麻醉大鼠，將大鼠固定，沿頸部切開皮膚，分離頸內動脈、頸外動脈和右側頸總動脈；將頸外動脈和頸總動脈結扎，夾閉頸內動脈，將線栓插入頸外動脈直至到達頸內動脈，向內插入約18 mm，固定2 h后抽出線栓，縫合傷口。術后24 h對造模大鼠進行Zea Longa評分，Zea Longa評分1～3分表示造模成功[7]。將造模成功的大鼠隨機分為：模型組、CA組、CA+Anisomycin組，每組12只。另取12只大鼠作為假手術組，假手術組操作同模型組，但不進行線栓操作。CA組大鼠使用10 mg/kg CA腹腔注射給藥[8]；CA+Anisomycin組大鼠使用10 mg/kg CA和2 mg/kg Anisomycin[9]腹腔注射給藥；假手術組與模型組腹腔注射等量的生理鹽水；每天1次，連續給藥2 w。

1.2.2 Zea Longa評分與腦梗死體積百分比檢測 Zea Longa評分：給藥周期結束后，各組均未出現大鼠死亡，采用Zea Longa評分法[7]對各組大鼠進行神經功能缺損評分，評分區間為0～4分，得分越高表示神經功能缺損越嚴重。腦梗死體積百分比檢測：斷頭處死大鼠，迅速取出整腦，選擇其中6只大鼠，-20 ℃冰箱冷凍，沿冠狀面切成6片厚度為2 mm的切片，使用2% TTC溶液37 ℃避光染色30 min，正常腦組織顯色紅色，梗死組織為白色，Image Pro Plus 6.0軟件分析并計算腦梗死體積百分比(腦梗死體積百分比=腦梗死體積/整腦體積×100%)。另外6只大鼠的海馬組織于-80℃保存。

1.2.3 Nissl染色檢測大鼠海馬組織神經元損傷 取出凍存的海馬組織，石蠟切片經脫蠟至水，加入Nissl染色液37℃染色10 min，蒸餾水洗滌，95%酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察尼氏體。

1.2.4 TUNEL法檢測大鼠海馬組織神經元凋亡 取海馬組織冰凍切片，0.5%聚乙二醇辛基苯基醚通透30 min后，加入TUNEL染色液，避光孵育1 h，DAPI避光孵育5～10 min復染細胞核，熒光顯微鏡觀察海馬組織神經元凋亡，計算神經元細胞凋亡率(神經元細胞凋亡率=凋亡神經元細胞數/總神經元細胞數×100%)。

1.2.5 酶聯免疫吸附法檢測大鼠海馬組織TNF-α、IL-1β和IL-6水平 將海馬組織(組織：生理鹽水=1∶9)在冰浴條件下研磨勻漿，15000 r/min離心10 min，分離上清，酶聯免疫吸附法檢測海馬組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.2.6 蛋白免疫印跡法檢測大鼠海馬組織p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-NF-κB p65、NF-κB p65、NLRP3蛋白表達 蛋白裂解液提取各組大鼠海馬組織中總蛋白，蛋白經定量后，取30 μg樣品經電泳、轉膜與封閉，加入兔抗鼠p-p38 MAPK(1∶300)、p38 MAPK(1∶300)、p-NF-κB p65(1∶500)、NF-κB p65(1∶500)、NLRP3(1∶1000)、β-actin(1∶1000)一抗稀釋液，4 ℃孵育過夜，羊抗兔二抗(1∶3000)室溫孵育2 h，放大顯色后，以β-actin為內參，分析各蛋白相對表達。

2 結 果

2.1 各組大鼠Zea Longa評分和腦梗死體積百分比比較 與假手術組比較，模型組大鼠Zea Longa評分和腦梗死體積百分比顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，CA組大鼠Zea Longa評分和腦梗死體積百分比顯著降低(P<0.05)；與CA組比較，CA+Anisomycin組大鼠Zea Longa評分和腦梗死體積百分比顯著升高(P<0.05)(見表1、圖1)。

圖1 各組大鼠腦梗死體積觀察(TTC染色)

表1 各組大鼠Zea Longa評分和腦梗死體積百分比比較

2.2 各組大鼠海馬組織神經元損傷比較 假手術組大鼠神經元形態規則，結構完整，細胞染色加深，尼氏體數目豐富；模型組大鼠神經元形態不規則、染色較淺，尼氏體數目明顯減少；CA組大鼠神經元形態較模型組明顯改善，形態較飽滿，染色均勻，尼氏體密集；CA+Anisomycin組較CA組神經元損傷嚴重，細胞皺縮，尼氏體數目減少(見圖2)。

圖2 各組大鼠海馬組織神經元損傷觀察(Nissl染色，×400)

2.3 各組大鼠海馬組織神經元凋亡比較 神經元凋亡顯示為綠色，所有細胞核顯示為藍色，假手術組大鼠幾乎無神經元凋亡。假手術組、模型組、CA組、CA+Anisomycin組大鼠神經元細胞凋亡率分別為(1.83±0.45)%、(34.21±6.33)%、(18.56±3.58)%、(23.59±4.42)%。與假手術組比較，模型組大鼠神經元細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，CA組大鼠神經元細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)；與CA組比較，CA+Anisomycin組大鼠神經元細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)(見圖3)。

圖3 各組大鼠海馬組織神經元凋亡情況(TUNEL染色，×200)

2.4 各組大鼠海馬組織TNF-α、IL-1β和IL-6水平比較 與假手術組比較，模型組大鼠海馬組織TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，CA組大鼠海馬組織TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著降低(P<0.05)；與CA組比較，CA+Anisomycin組大鼠海馬組織TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著升高(P<0.05)(見表2)。

表2 各組大鼠海馬組織TNF-α、IL-1β和IL-6水平比較

2.5 各組大鼠海馬組織p38 MAPK/NF-κB/NLRP3通路相關蛋白表達水平比較 與假手術組比較，模型組大鼠海馬組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65、NLRP3蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，CA組大鼠海馬組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65、NLRP3蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；與CA組比較，CA+Anisomycin組大鼠海馬組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65、NLRP3蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)(見表3、圖4)。

表3 各組大鼠海馬組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65、NLRP3蛋白表達水平比較

注：A：假手術組；B：模型組；C：CA組；D：CA+Anisomycin組圖4 各組大鼠海馬組織p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-NF-κB p65、NF-κB p65、NLRP3蛋白印跡圖

3 討 論

缺血性腦卒中會導致腦組織缺血壞死，引起患者偏癱、失語、記憶力下降等，嚴重影響患者生活質量，缺血缺氧可引起腦組織受損、細胞壞死、神經功能受損、炎癥反應加劇[10]。本研究結果顯示，給予缺血性腦卒中模型大鼠CA治療后，神經功能損傷明顯減輕，腦梗死體積減小，神經元形態較飽滿，染色均勻，尼氏體密集，神經元細胞凋亡率降低，表明CA可減輕缺血性腦卒中大鼠神經功能損傷。

CA是從菊苣和紫錐菊等植物中提取的活性物質，具有抗病毒、抗炎、抗氧化、抑腫瘤、抗衰老、調節糖脂平衡等多種藥理作用[11,12]。高紅藝等[13]研究顯示，CA可上調沉默信息調節因子1(SIRT1)蛋白表達，抑制NF-κB的轉錄活性、海馬氧化應激損傷及炎癥反應，改善膿毒癥相關性腦病小鼠認知功能。另有研究顯示[14]，CA可顯著抑制一氧化氮和前列腺素E2的水平及炎癥因子的釋放，減少腦缺血再灌注損傷大鼠的神經功能缺損和梗死體積。以上研究表明[13,14]CA具有神經保護的作用。腦卒中可引起TNF-α、IL-1β和IL-6等多種促炎因子水平升高，lL-1β與腦組織損傷的程度有關，抑制lL-1β的釋放，可顯著減少腦梗死體積[15]。本研究使用CA治療缺血性腦卒中模型大鼠后，大鼠海馬組織TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著降低，與既往報道結果類似[13,14]，表明CA通過抑制炎癥反應緩解腦損傷。

NLRP3是炎癥反應的活性核心，缺血性腦卒中發生后，NLRP3轉錄激活，催化IL-1β分泌，加重組織損傷，NF-κB是激活NLRP3炎癥小體的重要因子，CA可抑制NF-κB和NLRP3信號通路的激活[16]。Ding等[17]研究顯示，在脂多糖誘導的小鼠急性肺損傷模型中，CA可顯著抑制MAPK和NLRP3活化，減輕炎癥反應。本研究結果顯示，CA可降低缺血性腦卒中大鼠海馬組織NLRP3的表達水平，與Wang等[16]報道結果一致。p38是MAPK信號通路重要的成員，參與神經元的凋亡，腦部缺血缺氧可引起MAPK信號通路的激活，促進神經元凋亡[18]。NF-κB是p38 MAPK的下游分子，p-p38 MAPK可激活NF-κB，通過調節細胞核凋亡相關基因表達，誘導神經元凋亡；而抑制p38 MAPK通路，可抑制NF-κB的激活，從而減弱TNF-α、IL-1β和IL-6等細胞因子的釋放，減輕腦組織損傷[19]。李依玲等[20]研究表明，CA可抑制NF-κB信號通路的激活，減輕脂多糖誘導的H9C2細胞損傷。本研究在使用CA治療缺血性腦卒中模型大鼠后，大鼠海馬組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65、NLRP3蛋白表達水平顯著降低，提示CA可抑制p38 MAPK/NF-κB/NLRP3通路的激活。本研究結果還顯示，CA改善缺血性腦卒中大鼠腦損傷的作用可被Anisomycin逆轉，推測CA可通過抑制p38 MAPK/NF-κB/NLRP3信號通路來抑制炎癥反應，緩解缺血性腦卒中大鼠腦組織損傷，降低神經元凋亡。

綜上所述，CA可通過抑制p38 MAPK/NF-κB/NLRP3信號通路，抑制炎癥反應，降低神經元凋亡，保護缺血性腦卒中引起的大鼠腦損傷。