卒中后抑郁患者外周血miR-23a和miR-378表達對其診斷價值*

卒中后抑郁(Post-Stroke Depression, PSD)是腦卒中后最常見的并發癥之一[1]。卒中后抑郁可在缺血卒中后2周內發生，即早發型PSD，可持續數月甚至數年。根據不同的研究對象、評價標準和發病時間，PSD的患病率從25%到70%不等[2～4]。研究表明，PSD與腦卒中患者神經功能恢復差、復發率高、病死率高有關[2, 3]，因此，及時診斷和治療PSD對其預后有重要意義。然而，PSD的發病機制尚不清楚。目前，有關PSD的假說主要有神經解剖學、神經生物化學和神經遺傳學等。盡管學者認為PSD的發病機制不同，推測PSD可能是多種機制共同作用的結果，臨床因素和血液標志物的結合可能是預測早發型PSD的潛在方法。microRNA(miRNA或miRs)是一類小的非編碼RNA，主要參與基因轉錄后調控表達，包括調節腫瘤的發生發展、炎癥反應等[5～7]，此外有研究發現miRNA在抑郁癥等精神疾病中發揮關鍵作用[8]。有研究報道，miR-140-5p是遲發型PSD的獨立危險因素，miR-140-5p對遲發型PSD的預測具有較好的敏感性和特異性，miR-140-5p可能參與了遲發型PSD的發病機制，有望作為一種新的早期預警生物標志物[9]。此外，重度抑郁癥患者體內let-7b、let-7c、miR-1202、miR-124-3p表達水平顯著改變，PSD患者體內 miR-137、miR-92a-3p、miR-211和miR-300表達水平亦顯著改變[10～12]。越來越多的證據表明，循環miRNAs可以作為疾病狀態、特征的潛在生物標志物，或者可以作為抑郁癥治療的潛在靶點。研究發現，miR-23a和miR-378水平的升高主要參與腫瘤的生長侵襲、轉移與炎癥反應調控[13～16]，但目前尚無有關miR-23a和miR-378水平變化與PSD的研究。本研究主要探討PSD患者血清中miR-23a和miR-378的表達水平，并分析其對PSD的診斷及預后評估的作用。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2018年3月～2021年8月深圳市康寧醫院和湖南省腦科醫院收治的128例腦卒中患者。其中男72例，女56例；年齡37～82歲，平均(60.59±12.06)歲，中位數年齡62歲。依據住院及隨訪時間內患者是否發生PSD癥狀分為PSD組(48例)和非PSD組(80例)。納入標準：(1)年齡≥18歲；(2)經頭顱磁共振成像(MRI)診斷為腦卒中；(3)首次發病，12 h內入院；(4)PSD診斷符合《ICD-10精神與行為障礙分類》診斷標準，同時由2名受過量表評估培訓的精神疾病專科醫生對所有患者進行17項漢密爾頓抑郁量表(Hamilton Depression Scale-17，HAMD-17)評估，HAMD-17≥7分為抑郁癥；(5)能夠配合完成量表評估及臨床資料完整；(6)簽署患者知情同意書。排除標準：(1)發病之前有抑郁癥等精神癥狀；(2)有認知、意識障礙疾病；(3)服用精神藥物史；(4)合并心、腦、肝、腎等慢性病史；(5)病例失訪。

1.2 方法

1.2.1 試劑和材料 無水乙醇、氯仿和異丙醇等購自德源化工公司，TRIzol購自武漢谷歌生物公司，逆轉錄試劑和熒光定量PCR試劑盒購自日本Takara公司，U6內參、miR-23a和miR-378引物購自廣州銳博生物公司。

1.2.2 逆轉錄-聚合酶鏈反應檢測患者血清中miR-23a和miR-378的表達 所有患者均于入院次日清晨采集空腹靜脈血10 ml，3 000rpm離心10 min，取上層血清用于試驗。向上述血清中先后加入TRIzol，氯仿和異丙醇等提取總的RNA。采用RT-qPCR檢測將RNA逆轉錄為cDNA進行擴增。反應條件如下：加熱 95 ℃， 時間30 min，變性 94 ℃，時間15 s， 退火55 ℃，時間 30 s， 延伸70 ℃，時間30 s，共 40個循環。操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，以U6為內參， 采用2-△△Ct法計算miR-23a和miR-378相對表達量。miR-23a引物：上游：5’-GCCGATCACATTGCCAGGG-3’，下游：5’-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3’；miR-378引物：上游：5’-GAGCGGAGAGTACTGGATCG-3’，下游：5’-GTTCGGGCTGATGTACCAGT-3’；U6 內參：上游：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。

1.2.3 隨訪 由醫生采用電話回訪和門診復診相結合方式隨訪患者預后情況，隨訪開始診斷為腦卒中確診時間，隨訪截止時間為2021年8月發病后1年，發生PSD即為終點事件。隨訪內容主要為參考《ICD-10精神與行為障礙分類》診斷標準和HAMD-17。

1.2.4 觀察指標 患者的一般臨床資料包括性別、年齡、吸煙史、飲酒史、高血壓病史、糖尿病史、心臟病史及體質量指數(BMI)等。實驗室指標包括患者入院次日清晨空腹血液送檢的白細胞計數(WBC)、空腹血糖(FBG)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)及空腹血糖等實驗室檢查。腦卒中患者TOAST病因分型、梗死灶位置及入院時美國國立衛生研究院卒中量表(National Institute of Health Stroke Scale，NIHSS) 評分結果。

2 結果

2.1 兩組一般資料比較 兩組性別、年齡、高血壓病史、糖尿病史、心臟病史、吸煙史、飲酒史、BMI、實驗室檢查、梗死灶位置、TOSAT分型比較差異均無統計學意義(P>0.05)，PSD組NIHSS評分高于非PSD組(P<0.05)。見表1。

表1 兩組一般資料及實驗室檢查比較

2.2 兩組血清中miR-23a和miR-378相對表達量 PSD組血清miR-23a的相對表達量(2.15±0.97)高于非PSD組(1.18±0.64)(t=9.95，P<0.01)。PSD組血清miR-378的相對表達量(1.38±0.32)高于非PSD組(1.06±0.12)(t=3.06，P<0.05)。見圖1。

注：*P<0.05,**P<0.01

2.3 影響卒中患者發生抑郁的危險因素 單因素分析結果顯示NIHSS評分增高、miR-23a和miR-378升高是影響卒中患者發生抑郁的危險因素(P<0.05)。見表1，圖1。多因素Logistic回歸分析顯示NIHSS評分增高、miR-23a和miR-378升高是影響卒中患者發生抑郁的獨立危險因素(P<0.05)。見表2。

表2 卒中后發生抑郁的多因素Logistic回歸分析

2.4 PSD患者外周血miR-23a和miR-378對PSD患者發病診斷價值 ROC曲線分析結果顯示，PSD患者血清中miR-23a的曲線下面積為0.907(95%CI：0.859～0.955，P<0.000 1)，最佳診斷為1.81，特異性為0.938，敏感性為0.725。PSD患者血清中miR-378的曲線下面積為0.835(95%CI：0.766～0.903，P<0.000 1)，最佳診斷為1.51，特異性為0.896，敏感性為0.600。見圖2。

圖2 PSD患者外周血miR-23a和miR-378表達水平診斷PSD的ROC曲線

3 討論

卒中目前是全球第三大死亡原因，也是老年人口的主要健康問題，不僅會導致殘疾等身體損傷，還會導致社交與心理疾病[1, 17]。其中，PSD是最常見的神經精神損傷，常伴有冷漠、疲勞、自我感覺價值低、睡眠改變和快感缺失，PSD是導致卒中患者生活質量低下的最重要因素[18, 19]。然而，迄今為止，PSD的發病機制尚不清楚。研究表明PSD可能與解剖學、神經生物學、遺傳因素和社會因素有關[1]。研究表明腦額皮層下回路(FSC)和腦邊緣-皮質-紋狀體-蒼白球丘腦回路(LCSPTC)與腦卒中后抑郁的發生有關[20, 21]。腦卒中后，機體釋放大量炎癥因子進而影響下丘腦-垂體-腎上腺軸功能。在細胞中，5-羥色胺(5-HT)、多巴胺(DA)和去甲腎上腺素的表達水平降低，從而導致抑郁的發生[22]。此外，有報道稱5-HT轉運體編碼SLC6A4基因[23]和腦源性神經營養因子(BDNF)Val66Met基因多態性[24]與PSD相關。

早期識別PSD的相關危險因素并對其進行預測對PSD患者預后具有重要意義。一些生物學標志物如DA、5-HT、炎癥因子等與抑郁癥相關。然而，仍缺乏PSD患者的臨床預測因素。近年來，研究發現miRNAs與腦卒中發病率之間存在密切關系。例如，miR-124、miR-140-5p、miR-210和其他miRNAs已被確定為潛在的重要角色。此外，先前的研究也表明，異常表達的miRNA可能促進或誘導PSD的發生，并可能促進PSD的進展。研究者發現卒中患者的血清miR-223-3p 相對表達量降低及高遷移率族蛋白B1(HMGB1)水平升高是 PSD 發病的獨立危險因素，早期將兩指標聯合檢測可有效預測PSD的發病[25]。此外，研究結果表明，miR-140-5p在PSD中上調，受試者ROC曲線顯示，miR-140-5p預測遲發型PSD的發生，最高敏感性為83.3%，特異度為72.6%[9]。

本研究結果顯示，兩組性別、年齡、高血壓病史、糖尿病史、心臟病史、吸煙史、飲酒史、BMI、實驗室檢查、梗死灶位置、TOSAT分型比較差異均無統計學意義，PSD組NIHSS評分高于非PSD組，這與其他研究結果一致[26]。PSD組血清中miR-23a和miR-378的相對表達量高于非PSD組，多因素Logistic回歸分析顯示NIHSS評分增高、miR-23a和miR-378升高是影響卒中患者發生抑郁的獨立危險因素，提示miR-23a和miR-378可能參與PSD的發病。本研究還采用ROC曲線分析了miR-23a和miR-378對卒中患者PSD發病的診斷價值。結果發現血清miR-23a和miR-378診斷PSD時ROC的曲線下面積分別為0.907和 0.835，提示miR-23a和miR-378對PSD具有較高的診斷價值，可作為血清標志物篩查PSD。

綜上所述，本研究結果提示PSD患者血清中miR-23a和miR-378表達升高是PSD發病的獨立危險因素，同時對PSD的診斷也具有一定的價值，有望作為PSD早期診斷的潛在分子標志物。