共代謝條件下熒蒽降解菌的差異蛋白質組學分析

鐘 琦,王紅旗,姜茹菡,肖雅倩,吳梟雄

共代謝條件下熒蒽降解菌的差異蛋白質組學分析

鐘 琦,王紅旗*,姜茹菡,肖雅倩,吳梟雄

(北京師范大學水科學研究院,北京 100875)

以課題組篩選出的多環芳烴高效降解菌--蠟樣芽孢桿菌()DQ01菌株為研究對象,以熒蒽為目標污染物,以牛肉膏蛋白胨培養基(LB培養基)為共代謝基質,基于同位素相對和絕對定量技術(iTRAQ)比較細菌在無機鹽培養基(MSM培養基)和MSM-LB培養環境中降解熒蒽的全蛋白表達水平,旨在揭示蠟樣芽孢桿菌在共代謝過程中分子代謝水平上的變化.結果共檢測到64個差異表達蛋白質,其中上調表達的蛋白質有28個,下調表達的蛋白質36個.鑒定到差異蛋白的功能集中在代謝、應激反應、信息傳遞和調控等方面,同時對比KEGG通路富集分析的結果,也顯示細菌有關能量代謝和信息傳遞、調控的通路產生的變化.比較細菌在是否處于共代謝下的差異蛋白表達,推測細菌在降解多環芳烴過程中的關鍵環節是小分子代謝和適應外界環境的通路.

共代謝；差異蛋白質組學；多環芳烴；微生物降解；蛋白質功能分析

多環芳烴(PAHs)是指兩個或兩個以上的苯環連在一起組成的一類有機化合物[1],廣泛存在于土壤、水體和大氣中.它們通常是由化石燃料和其他有機物質的不完全燃燒形成的[2],具有“三致”效應(致癌、致畸、致突變),被視作典型的持久性有機污染物[3].PAHs具有強疏水性,容易與土壤沉積物中的有機質結合,與許多其他有機污染物相比難以降解[4].對于環境中的PAHs污染,常用的降解手段包括物理、化學和生物法[5],其中,生物法因具有無二次污染和經濟效益高等優點而受到廣泛關注[3].根據目前研究報道,包括假單胞菌屬()[6]、紅球菌屬()[7]和芽孢桿菌屬()[8]等在內的微生物已被證明具有良好的PAHs降解能力.

差異蛋白質組學,是研究兩個或多個樣本在不同狀態或不同培養條件下的蛋白質組變化,以分析重要生命過程,找出關鍵的不同蛋白質,作為定性和功能分析的標志物[9].可以通過分析細菌在降解PAHs過程的蛋白質組學結果,推測其降解途徑,有助于認識細菌降解PAHs的機理.Mukherjee等[10]通過對銅綠假單胞菌() ASP-53菌株降解芘的過程中蛋白質組學分析發現,有關蛋白質折疊(分子伴侶)、應激反應等功能的蛋白質表達上調,并鑒定出該細菌遵循水楊酸途徑降解芘.Yun等[11]研究了新鞘脂菌屬(sp.) US6-1菌株在降解PAHs時的蛋白質組學,發現該細菌通過外二醇裂解途徑引導菲的代謝途徑.同時微生物降解PAHs的難易程度取決于其化學結構的復雜性和降解酶的適應程度[12].低環的PAHs(2～3環)能夠被微生物以PAHs作為唯一碳源的方式有效的去除和修復[13],而四環或四環以上的PAHs一般以共代謝的方式被細菌降解[14].1963年Jensen[15]在共氧化[16]的基礎上提出了共代謝(co-metabolism)的概念,即在有其他碳源和能源存在的情況下,微生物能夠增強酶的活性,提高非生長基質的降解效率.前人的研究表明在加入共代謝基質的情況下能夠提高細菌降解非生長基質PAHs的效率,并且有可能產生新的降解機制與途徑.Rentz等[17]研究用水楊酸和琥珀酸作為鞘氨醇單胞菌JAR02菌株(sp.)降解苯并[a]芘的共代謝基質,使得苯并[a]芘的降解率有所提高,并用HPLC/MS聯用技術進行分析,發現能檢測出兩種新的中間產物.Juhasz[18]的研究指出在PAHs的混合體系中,低分子量PAHs的存在改善了五環和七環PAHs化合物的降解效果,混合體系中的苯并[a]芘和六苯并苯相對于它們作為唯一碳源的情況下,降解效率都有所提高.Wang等[19]發現一種假黃單胞菌屬細菌(sp.)可以在20mg/L的葡萄糖存在下在72h時降解超過95%的50mg/L的DDT.同時,氮源的存在可能對共代謝過程也有著影響.Chaudhary等[20]分離出一株鏈霉菌屬(),在添加0.1%酵母提取物作為共底物的培養基中,對芴、菲進行了降解行為研究,發現在100 μg/g的濃度下,該菌株在15d內降解率可達92%和80%.Zhao等[21]的研究指出牛肉膏蛋白胨-無機鹽培養基和玉米淀粉分別配制葡萄糖、甘油、尿素、氯化銨、蛋白胨等不同濃度的混合物可以作為降解實驗的共代謝基質,并且發現氮源對地衣芽孢桿菌B-1共代謝高效氯氰菊酯也有著促進作用[22].目前國內外的研究主要集中在共代謝條件下細菌對于復雜污染物降解效率的改變以及不同的因素(例如溫度和pH值等)對于微生物共代謝復雜污染物的影響[23-25]等.對于應用蛋白質組學分析細菌共代謝PAHs機制的研究還有待進一步發展.

為了科學地指導微生物在降解PAHs方面的應用,提高微生物對PAHs的降解效率,了解細菌在共代謝過程中分子生物學水平上的變化,本研究以課題組篩選出的PAHs高效降解菌--蠟樣芽孢桿菌()DQ01菌株為研究對象,以熒蒽為目標污染物,設置以LB培養基為共代謝基質的實驗條件,比較細菌在LB+熒蒽和細菌將熒蒽作為唯一碳源條件下的差異蛋白表達結果,可以推斷出細菌在降解多環芳烴過程中的控速環節.研究揭示了在一種新的共代謝條件下細菌的共代謝機制,運用蛋白質組學的分析方法研究細菌提升PAHs的降解效率的機制,為細菌更好地應用于PAHs污染降解提供了參考.

1 材料與方法

1.1 實驗材料與培養基、溶液

主要藥品來源:熒蒽(分析純,美國J.T.Baker公司);丙酮(色譜純,美國J.T.Baker公司);乙腈,正己烷(色譜純,美國MREDE公司);NaCl、Na2HPO4、KH2PO4、NH4Cl、MgSO4·7H2O、CaCl2、FeSO4·7H2O、NaNO3等(分析純,天津福晨化學試劑有限公司);蛋白胨、酵母粉(分析純,北京奧博星生物有限責任公司).

無機鹽培養基(MSM培養基)和牛肉膏蛋白胨培養基(LB培養基)的配制方法參考許潔等[26]的研究成果.

熒蒽儲備液:稱取熒蒽100mg,在棕色容量瓶中用丙酮定容至100mL,此時熒蒽濃度為1000mg/L,轉移到藍蓋瓶內,纏上封口膜之后在通風櫥內保存.

以課題組前期從天津石油污染地區篩選得到的PAHs高效降解菌株--蠟樣芽孢桿菌()DQ01菌株為研究靶細菌.

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種培養 將前期純化培養的蠟樣芽孢桿菌的單克隆菌落放入高溫高壓滅菌后冷卻至常溫的LB 培養基中培養,培養箱的設置為溫度30℃,轉速110r/min,24h后蠟樣芽孢桿菌達到對數期.

1.2.2 實驗設置 配置實驗組MSM培養基,加入1g/L熒蒽儲備液,使MSM中熒蒽終濃度為100mg/L,蓋上封口膜之后在通風櫥中靜置過夜,使丙酮揮發完全.

在MSM培養基、熒蒽-MSM和熒蒽-MSM+LB體系中加入倒掉培養基后經PBS緩沖液洗滌3次的蠟樣芽孢桿菌,控制初始OD600值為0.4左右,放入溫度30℃,轉速110r/min的培養箱中培養24h.以上所有操作均進行3次平行重復.

熒蒽-MSM體系是在20mL的MSM溶液中加入2μL的熒蒽儲備液,熒蒽-MSM+LB體系是在15mL的MSM溶液中加入5mL的LB培養基和2μL的熒蒽儲備液.

1.2.3 非靶向蛋白組學分析 蛋白提取、肽段酶解和iTRAQ標記:將在MSM培養基、熒蒽-MSM 和熒蒽-MSM+LB體系中培養了24h的蠟樣芽孢桿菌離心后傾倒培養基,用PBS緩沖液洗滌3次,第1個作為后續的對照組菌體樣品,后2個作為后續的實驗組菌體樣品.每個樣品都進行3組的平行操作.

樣品采用SDT裂解法提取蛋白質;采用BCA 法進行蛋白質定量;每份樣品取適量蛋白質采用超濾管輔助樣本制備的(FASP)方法進行胰蛋白酶酶解[27];然后用C18純化柱對酶解肽段進行脫鹽,用40μL Dissolution buffer對凍干的肽段復溶,用OD280的值對肽段定量.接著分別取各樣品100μg肽段,按照AB SCIEX公司同位素相對和絕對定量技術(iTRAQ)標記試劑盒說明書進行標記.

SCX色譜分級:進行初步分離,以降低每個組分中肽段樣品的復雜程度.將每組標記后的肽段混合,采用AKTA Purifier 100進行分級.緩沖液A液為10mmol/L KH2PO4, 25% CAN, pH值 3.0, B液為10mmol/L KH2PO4, 500mmol/L KCl, 25%CAN, pH值3.0.色譜柱以A液平衡,樣品由進樣器上樣到色譜柱進行分離,流速為1mL/min.洗脫過程中監測214nm的吸光度值,每隔1min需要收集洗脫組分,分別凍干后采用C18純化柱脫鹽.

樣品液相采集:每份分級樣品采用納升流速的HPLC液相系統Easy nLC進行分離.緩沖液A液為體積濃度0.1%的甲酸水溶液,B液為體積濃度0.1%的甲酸乙腈水溶液(乙腈為84%).色譜柱以95%的A液平衡,樣品由自動進樣器上樣(上樣柱,Thermo Scientific公司Acclaim PepMap100, 100μm×2cm, nanoViper C18),經過分析柱(Thermo Scientific公司 EASY column, 10cm, ID75μm, 3μm, C18-A2)分離,流速為300nL/min.

樣品質譜檢測:樣品經色譜分離后用Q-Exactive質譜儀進行質譜分析.母離子掃描范圍為300～1800/,一級質譜分辨率為70000at 200/, AGC target 為1×106, Maximum IT為50ms,動態排除時間為60.0s.每次全掃描后采集20個碎片圖譜.

蛋白質分析:用軟件Mascot 2.2和Proteome Discoverer 1.4對質譜分析原始數據進行查庫鑒定及定量分析.一級離子質量容差為±0.002%;二級離子質量容差為0.1Da;可信肽段篩選標準為￡0.01.蛋白質比率按蛋白質唯一的多肽的中位數計算,根據蛋白質定量值的中位數進行數據矯正.分別利用Blast2GO和KAAS軟件對檢測到的蛋白進行GO注釋和KEGG注釋.

2 結果與分析

2.1 差異表達蛋白鑒定結果

按照表達倍數變化1.2倍以上(上調大于1.2倍或者下調小于0.83倍)且<0.05的標準篩選差異表達蛋白質,MSM-LB vs MSM組的上調差異表達蛋白質有28個,下調差異表達蛋白質36個,共有64個.

針對蠟樣芽孢桿菌在MSM-LB和MSM實驗組降解熒蒽過程中相比表達顯著差異的蛋白進行詳細分析(表1).

表1 表達倍數變化大于1.2倍的差異蛋白的詳細情況

續表1

續表1

注:差異倍數表示蠟樣芽孢桿菌在MSM-LB和MSM實驗組中差異表達蛋白的倍數之比,大于1表示上調,小于1表示下調;value表示假設檢驗的值;蛋白功能是根據鑒定結果與NCBI數據庫比對而來;功能描述是根據數據庫注釋或文獻報道得出.

咪唑甘油磷酸合成酶、核黃素ECF轉運蛋白、UDP-葡萄糖基轉移酶、PTS纖維二糖轉運蛋白和ABC轉運蛋白滲透酶都顯示出了非常顯著的上調表達,說明這些蛋白在細菌的共代謝行為中可能都起到了至關重要的作用;而L-乳酸脫氫酶3、UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酸轉移酶、乙醇活性脫氫酶/乙醛活性還原酶均顯示出了下調表達的趨勢,這些蛋白在蠟樣芽孢桿菌以熒蒽為唯一碳源時更加活躍.

2.2 差異表達蛋白的GO功能分析

表2 差異蛋白的GO功能分析

基因本體論GO(Gene Ontology)是一個標準化的功能分類體系,提供動態更新的標準化詞匯表,并以生物過程(BP)、分子功能(MF)和細胞組分(CC)3個方面描述生物體中基因和基因產物的屬性[39].使用GO數據庫對檢測到的差異蛋白進行功能注釋分析,按照與GO功能分類相關的差異表達蛋白質數目排序,分析結果如表2所示.

根據GO功能注釋結果,按照生物過程、分子功能和細胞組分3個方面進行劃分.檢測到差異蛋白數量最多的生物過程是代謝過程,其次細胞過程、細胞代謝過程和有機物代謝過程也存在著15個以上的差異蛋白質.檢測到的差異蛋白數量最多的分子功能是催化活性,緊接其后的是轉移酶活性、結合和氧化還原酶活性.細胞組分分類中,被檢測到的差異蛋白數最多的是組成細胞相關的蛋白,膜、膜部分和細胞部分等組分也都有著不少的差異蛋白存在.GO功能注釋為后續的蛋白具體功能分析提供了思路.

2.3 差異表達蛋白的KEGG通路分析

圖1 差異蛋白KEGG通路分析TOP 20

橫坐標表示顯著富集的KEGG通路;縱坐標表示每條KEGG通路中包含的差異表達蛋白質數目

在生物體中,需要不同蛋白質相互協調才能完成一系列生化反應以行使其生物學功能.因此,通路分析能更系統、全面地了解細胞的生物學過程、性狀.KEGG是常用于通路研究的數據庫之一,它是由海量文獻中的信息整合而來,以圖形語言描述眾多的代謝途徑以及各途徑之間的相互關系,收錄了新陳代謝、細胞過程等多個方面的通路信息[40].通過對顯著性差異表達的蛋白質進行KEGG通路注釋,能夠了解這些蛋白可能參與的代謝或信號通路.對MSM-LB vs MSM的差異表達蛋白質進行KEGG通路富集分析,如圖1所示.丙酮酸代謝中檢測到的差異蛋白數量最多,為4個;糖酵解/糖異生、丙酸代謝、丁酸代謝、雙組分系統等通路次之.

3 討論

通過對差異蛋白功能分析,發現在共代謝基質存在的情況下,細菌與能量代謝、應激反應以及信息傳遞、調控相關的蛋白都有上調表達的現象.推測通過這些蛋白的高表達,使得細菌在降解熒蒽的過程中能夠有特別的能量代謝途徑和信息傳遞與調控方式,更快適應不良的碳源環境,從而能夠高效降解熒蒽.同時參與丙酮酸降解、丙酸降解、糖酵解通路、雙組分系統和趨化性的數個蛋白都有下調表達的趨勢,推測這些通路只在蠟樣芽孢桿菌以熒蒽為唯一碳源時才得到更多的利用,是細菌以熒蒽為唯一碳源代謝時的關鍵途徑.

3.1 與代謝有關的差異蛋白

綜合分析64個差異表達的蛋白,其中有16個蛋白與代謝過程相關.其中涉及到數個過程,如:能量的產生、糖類的轉運與代謝、維生素和微量元素的轉運、氨基酸的轉運、無機離子的轉運、丙酮酸代謝、糖酵解等等.而細菌的代謝方式與是否處于共代謝環境下也有著關系.

咪唑甘油磷酸合成酶是由HisH(23kDa)和 HisF(28kDa)組成.HisH提供谷氨酰胺轉氨酶活性,產生HisF合成咪唑甘油磷酸(IGP)和5-氨基咪唑-4-羧基酰胺核糖(AICAR)所必需的氨.Liu等[33]指出咪唑甘油磷酸合成酶參與組氨酸生物合成和細胞氮化合物代謝,為葡萄糖/脂肪酸合成提供碳框架,為細胞生命活動和GY2B菌株降解菲提供能量,這說明唑甘油磷酸合成酶在細胞的能量代謝等方面起著重要的作用.CitMHS家族轉運蛋白是細菌中負責金屬-檸檬酸鹽絡合物轉運的二級轉運體[37].有學者認為某些細菌利用金屬-檸檬酸鹽絡合物作為檸檬酸和金屬的來源[41].檸檬酸是一種弱有機酸,可以作為能量中間體和碳源[42],它是細胞三羧酸循環的中間產物,在能量代謝中起重要作用[43].磷酸轉移酶系統(PTS)是細菌攝取己糖、己糖醇、二糖等糖類物質的主要機制,它介導碳水化合物的攝取和磷酸化并控制代謝[44].磷酸轉移酶系統(PTS)能夠特異性地結合某一種或幾種糖類,使相應的糖類發生磷酸化,促進糖的進一步分解代謝[45].Houot等[46]的研究發現霍亂弧菌在LB培養基中能表達兩個額外的基于PTS的生物膜調節途徑,但在只添加0.5%(/)的葡萄糖或丙酮酸的最低培養基中卻不能表達.本研究的結果與這一發現有著一定的吻合性,推測在設置的共代謝條件下,細胞因外部培養環境的改變而提升了PTS纖維二糖轉運蛋白亞基IIC的表達水平,而這有利于細胞對于糖類的運輸.3-羥基-5-膦酰氧基戊烷-2,4-二酮硫解酶其調控基因為LsrF,參與群體感應信號自動誘導劑-2 (AI-2)的調控,能夠催化乙酰基從P-HPD轉移到輔酶A,形成二羥基丙酮磷酸和乙酰輔酶A[34].乙酰輔酶A是代謝的重要中間產物,直接參與細胞內三羧酸循環在內的重要生命過程,可以釋放出能量用以ATP的合成[47].以上蛋白的高表達均指向細菌的能量代謝水平增加,推測是因為LB培養基中的碳源更容易被細菌所利用,因此造成了能量代謝水平增長的現象,進而提高對于熒蒽的降解能力.

ATP結合盒轉運蛋白(ATP-binding cassette transporter)又被稱為ABC transporter,在原核及真核生物中都廣泛分布的一類超家族膜整合蛋白,能夠催化并利用ATP水解所產生的能量實現底物跨膜轉運[32].ABC轉運蛋白滲透酶是細胞質轉運系統[48].氨基酸ABC轉運蛋白通透酶和蛋氨酸ABC轉運滲透酶都屬于氨基酸轉運系統的膜組分,其中如果缺乏蛋氨酸,就會導致體內的蛋白質合成受阻[49].能量耦合因子型(ECF)轉運蛋白是一類新的ABC(ATP- binding cassette)轉運蛋白,在原核生物中負責維生素和微量元素的跨膜轉運[29].核黃素又被稱為維生素B2,該物質是多種酶反應所需要的輔助因子前體[50],因此核黃素ECF轉運蛋白在細胞的多種酶反應中也都發揮著重要的作用,這些反應可能直接或者間接的影響到了蠟樣芽孢桿菌降解熒蒽的行為.這些高表達的蛋白都是涉及到細菌的跨膜轉運功能,Buesen等[51]的研究指出ABC轉運蛋白可能與苯并[a]芘的跨膜轉運有關;孔德康等[52]也發現紅球菌BAP-1降解熒蒽時細胞膜上主要受影響的蛋白是與能量、轉運相關的膜蛋白,ABC轉運蛋白是BAP-1跨膜運輸熒蒽的主要載體蛋白.因此在共代謝條件下,蠟樣芽孢桿菌對于熒蒽的攝取與運輸可能更為活躍,使得細菌降解熒蒽的能力提高.

L-乳酸脫氫酶3、乳糖基谷胱甘肽裂解酶、乙醇活性脫氫酶/乙醛活性還原酶等蛋白參與到了細菌的丙酮酸代謝途徑之中,它們表現出的是下調的趨勢.熒蒽的微生物降解途徑通常始于熒蒽芳香環上C-1,2、2,3、7,8或8,9位的雙加氧反應[53],在苯環裂解雙加氧酶的作用下從而生成相對應的二氫二醇熒蒽,再經過一系列酶促反應逐步生成小分子芳香族化合物,如鄰苯二酚、原兒茶酸等,通過后續糖酵解、丙酮酸代謝最終進入TCA循環[54].在共代謝基質存在的情況下,相對來說多環芳烴的降解通路的碳源利用效率較低,細菌可能會利用其它多條小分子代謝通路,但是在以熒蒽為唯一碳源的情況下,細菌對于降解熒蒽后續過程的小分子代謝可能主要利用丙酮酸代謝通路,造成丙酮酸代謝通路在蠟樣芽孢桿菌以熒蒽為唯一碳源情況下十分活躍.

值得注意的是Qin等[55]使用葡萄糖作為微桿菌屬(sp)M.CSW3菌株降解苯并[a]芘的共代謝基質,其蛋白質組學分析表明此種情況下抑制了糖代謝相關蛋白的表達.這與本研究得出的結果相悖,推測可能是由于共代謝基質的不同而造成的差異.這也可以作為今后相關研究的一個方向.

3.2 與應激反應有關的差異蛋白

綜合分析64個差異表達的蛋白,其中有5個蛋白與應激反應相關.其中涉及到數個過程,如:應激反應產生膜蛋白和產生孢子外殼蛋白等.

GlsB/YeaQ/YmgE家族應激反應膜蛋白是一類存在于細胞膜上,因環境中的脅迫因素而應激表達的蛋白.目前有報道指出GlsB/YeaQ/YmgE家族蛋白在環境適應中出現高表達的情況.Li等[56]從青藏高原石油污染土壤中分離出枯草芽孢桿菌DM2,與枯草芽孢桿菌亞種相比,其全基因組測序中發現了一些菌株特異性蛋白基因編碼,其中就有GlsB/ YeaQ/YmgE家族應激反應膜蛋白,這些特異性蛋白反映了該菌株對惡劣條件和碳氫化合物利用的進化適應性.Goyal等[57]找到了一種高度耐受丁醇的松鼠葡萄球菌KM16,它在丁醇的脅迫下也能表達出GlsB/YeaQ/YmgE家族應激反應膜蛋白,這可能與該細菌的丁醇耐受性相關.推測此蛋白可能是蠟樣芽孢桿菌存在利用熒蒽這一不良碳源的情況,進而發生了應激的高表達情況,以此幫助細菌適應外部的生長環境.同時還有數個孢子外殼蛋白的高表達情況存在,孢子會在環境攻擊的條件下產生在細菌中,營養缺乏通常就會啟動孢子的形成[58].孢子外殼蛋白能使得細菌對各種不良環境具有極強的抵抗力,包括高溫、干燥輻射和毒性物質等[35].Wang等[59]對于熒蒽誘/導的紅球菌進行了比較蛋白質組學分析,發現孢子外殼蛋白在兩個實驗組中出現表達上調的情況,認為通過改變孢子外殼蛋白的表達水平,紅球菌可以適應低碳環境并抵抗PAHs的毒性作用.Hong等[60]指出菌株HZ01在石油處理下,發生營養饑餓和環境脅迫,編碼孢子外殼蛋白E的基因顯著上調.因此推測孢子外殼的形成能幫助細菌應對以熒蒽為唯一碳源時的挑戰.相比于以熒蒽為唯一碳源時,在共代謝基質存在的情況下,細菌對于外部培養環境中熒蒽的刺激會表現的更加明顯,更多的表達出蛋白來適應碳源的變化.

3.3 與信息傳遞、調控有關的差異蛋白

綜合分析64個差異表達的蛋白,其中有5個蛋白與信息傳遞、調控相關.其中涉及到數個過程,如:轉錄信息的傳遞與調控、群體感應過程的調控等.硝酸還原酶鉬輔因子組裝伴侶NarJ/NarW、反應調節受體蛋白以及雙組分傳感器蛋白都呈現出下調的趨勢,它們參與過程主要涉及到細菌的雙組分系統和趨化性.

雙組分系統是原核生物和低等真核生物感知環境和內部信息并做出反應的相關蛋白質機制,使得細胞能夠感知和處理信號[61].雙組分系統調控了細菌生長繁殖、營養利用等多方面的過程,使得細菌能夠在不同的環境甚至逆境中生存[62].詹清[63]的研究發現新鞘氨醇桿菌US6-1菌株中的雙組分系統參與了降解苯并芘的調控過程.細菌趨化性是指細菌對有利環境的趨附行為和對有害環境的避離行為[64].Zaval'skii等[65]用光密度法和毛細管法研究發現兩株惡臭假單胞菌菌株對萘都有正趨化作用.

分析鑒定結果可以發現熒蒽作為唯一碳源時,參與到蠟樣芽孢桿菌雙組分系統和趨化性通路中的蛋白表達量更高,而這些通路與熒蒽的降解也存在著緊密的聯系,暗示了這些通路所發揮的作用可能對于蠟樣芽孢桿菌降解熒蒽起著重要的調控作用,也許是細菌為了利用碳源和能源而進化出的優勢選擇.

4 結論

4.1 本研究比較了蠟樣芽孢桿菌分別在MSM-LB和MSM培養基環境中降解熒蒽的全蛋白表達水平差異.以MSM-LB vs MSM變化1.2 倍以上(上調大于1.2 倍或者下調小于0.83 倍)且<0.05 的標準篩選差異表達蛋白質,共鑒定到64個差異表達蛋白質,其中上調表達的蛋白質有28個,下調表達的蛋白質36個.

4.2 差異蛋白的功能集中在代謝、應激反應、信息傳遞和調控等方面,同時對比KEGG富集分析的結果,也顯示細菌有關能量代謝和信息傳遞、調控的通路產生的變化.

4.3 細菌在更容易利用LB中的碳源的情況下,將其作為生命能量來源的通路生理效率更高,相對來說多環芳烴降解通路產生能量的效率較低.比較細菌在LB+熒蒽和細菌將熒蒽作為唯一碳源下的差異蛋白表達,推測細菌在降解多環芳烴過程中的關鍵環節是丙酮酸代謝之類的小分子代謝通路和對外界環境作出反應的雙組分系統和趨化性通路.因此進一步的研究可以著重于相關通路中蛋白對于蠟樣芽孢桿菌降解熒蒽的控速作用.

[1] 張銀萍,王 芳,楊興倫,等.土壤中高環多環芳烴微生物降解的研究進展[J]. 微生物學通報, 2010,37(2):280-288.

Zhang Y P, Wang F, Yang X L, et al. Recent Advances in Biodegradation of High-molecular Weight PAHs in Soil [J]. Microbiology China, 2010,37(2):280-288.

[2] Fernando B L, Sanz R, Molina M C. et al. Effect of different non-ionic surfactants on the biodegradation of PAHs by diverse aerobic bacteria [J]. International Biodeterioration & Biodegradation, 2009,63(7):913-922.

[3] Jiang R, Li Y, Wang H, et al. A study on the degradation efficiency of fluoranthene and the transmembrane protein mechanism of Rhodococcus sp. BAP-1based on iTRAQ [J]. Science of the Total Environment, 2020,737:140208.

[4] Smu?ek W, Sydow M, Zabielska-Matejuk J, et al. Bacteria involved in biodegradation of creosote PAH – A case study of long-term contaminated industrial area [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2020,187(C):109843.

[5] Bamforth S M, Singleton I. Bioremediation of polycyclic aromatic hydrocarbons: current knowledge and future directions [J]. Journal of Chemical Technology & Biotechnology Biotechnology, 2010,80(7): 723-736.

[6] Liu Y L, Hu H Y, Giulio Z, et al. A Pseudomonas sp. strain uniquely degrades PAHs and heterocyclic derivatives via lateral dioxygenation pathways [J]. Journal of Hazardous Materials, 2021,403:123956.

[7] Kolomytseva M P, Randazzo D, Baskunov B P, et al. Role of surfactants in optimizing fluorene assimilation and intermediate formation by Rhodococcus rhodochrous VKM B-2469. [J]. Bioresource Technology, 2009,99(2):839-844.

[8] Reddy P V, Karegoudar T B, Monisha T R, et al. Biodegradation of fluoranthene by Paenibacillus sp. strain PRNK6: a pathway for complete mineralization [J]. Archives of Microbiology, 2018,200 (1):1-12.

[9] Yang Y Y, Yang F Q, Gao J L. Differential proteomics for studying action mechanisms of traditional Chinese medicines [J]. Chinese Medicine, 2019,14(1):1.

[10] Mukherjee A K, Bhagowati P, Biswa B B, et al. A comparative intracellular proteomic profiling of Pseudomonas aeruginosa strain ASP-53 grown on pyrene or glucose as sole source of carbon and identification of some key enzymes of pyrene biodegradation pathway [J]. Journal of Proteomics, 2017,167:25-35.

[11] Yun S H, Choi C W, Lee S Y, et al. Proteomic characterization of plasmid pLA1for biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in the marine bacterium, novosphingobium pentaromativorans US6-1 [J]. Plos One, 2014,9(3):e90812.

[12] 盧曉霞,李秀利,馬 杰,等.焦化廠多環芳烴污染土壤的強化微生物修復研究[J]. 環境科學, 2011,32(3):864-869.

Lu X X, Li X L,Ma J, et al.Enhanced Bioremediation of Coking Plant Soils Contaminated with Polycyclic Aromatic Hydrocarbons. [J]. Environmental Science, 2011,32(3):864-869.

[13] Kanaly R A, Harayama S. Biodegradation of high-molecular-weight polycyclic aromatic hydrocarbons by bacteria. [J]. Journal of Bacteriology, 2000,182(8):2059-2067.

[14] 陶雪琴,黨 志,盧桂寧,等.污染土壤中多環芳烴的微生物降解及其機理研究進展[J]. 礦物巖石地球化學通報, 2003,22(4):356-360.

Tao X Q, Dang Z, Lu G N, et al. Biodegradation Mechanism of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs) in Soil: A Review [J]. Bulletin of Mineralogy, Petrology and Geochemistry, 2003,22(4):356- 360.

[15] Jensen H L. Carbon nutrition of some microorganisms decomposing halogen-substituted aliphatic acids [J]. Acta Agriculturae Scandinavica, 1963,13(4):404-412.

[16] Leadbetter E R, Foster J W. Oxidation products formed from gaseous alkanes by the bacterium Pseudomonas methanica. [J]. Archives of biochemistry and biophysics, 1959,82(2):491-492.

[17] Rentz J A, Alvarez P, Schnoor J L. Benzo[a]pyrene degradation by Sphingomonas yanoikuyae JAR02 [J]. Environmental Pollution, 2008, 151(3):669-677.

[18] Juhasz A. Microbial degradation of high molecular weight polycyclic aromatic hydrocarbons [D].Melbourne: Victoria University, 1998.

[19] Wang G, Ji Z, Wang L, et al. Co-metabolism of DDT by the newly isolated bacterium, Pseudoxanthomonas sp. wax [J]. Brazilian Journal of Microbiology, 2010,41(2):431-438.

[20] Chaudhary P, Sharma R, Singh S B, et al. Bioremediation of PAH bysp [J]. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 2011,86(3):268-271.

[21] Zhao J Y, Chi Y L, Xu Y C, et al. Co-metabolic degradation of β-cypermethrin and 3-phenoxybenzoic acid by co-culture of bacillus licheniformis B-1and Aspergillus oryzae M-4 [J]. Plos One, 2016, 11(11):e166796.

[22] Zhao J Y, Jia D Y, Du J, et al. Substrate regulation on co-metabolic degradation of β-cypermethrin by Bacillus licheniformis B-1 [J]. AMB Express, 2019,9(1):83.

[23] Panikov N S, Sizova M V, Ros D, et al. Biodegradation kinetics of the nitramine explosive CL-20in soil and microbial cultures [J]. Biodegradation, 2007,18(3):317-332.

[24] 李 劍,謝春娟.廢水中苯胺的好氧共代謝降解實驗研究[J]. 環境工程學報, 2007,01(6):51-55.

Li J, Xie C J. Study on aerobic co-metabolism biodegradation of aniline in wastewater [J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2007,1(6):51-55.

[25] 王文靜,陳 海,李 博,等.以萘為共代謝的芘的好氧生物降解[J]. 環境工程學報, 2016,10(11):6332-6336.

Wang W J, Chen H, Li B, et al. Biodegradation of pyrene using naphthalene as cometabolism substrate [J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2016,10(11):6332-6336.

[26] 許 潔,王紅旗,孔德康.基于iTRAQ技術熒蒽降解菌的比較蛋白質組學分析[J]. 中國環境科學, 2018,38(1):284-292.

Xu J, Wang H Q, Kong D K. iTRAQ-based comparative proteomic analysis of a fluoranthene-degrading bacterium [J].China Environmental Science, 2018,38(1):284-292.

[27] Wisniewski J R, Zougman A, Nagaraj N, et al. Universal sample preparation method for proteome analysis [J]. Nature Methods, 2009,6(5):359-360.

[28] Wurm J P, Sung S, Kneuttinger A C, et al. Molecular basis for the allosteric activation mechanism of the heterodimeric imidazole glycerol phosphate synthase complex [J]. Nature Communications, 2021,12(1):2748.

[29] Zhang P, Wang J W, Shi Y G. Structure and mechanism of the S component of a bacterial ECF transporter [J]. Nature, 2010,468 (7324):717-720.

[30] Xu L, Qi T, Xu L, et al. ChemInform abstract: Recent progress in the enzymatic glycosylation of phenolic compounds [J]. ChemInform, 2016,35(1):1-23.

[31] Bj?rn Z, Antje H, Boris G. Requirements for the phosphorylation of the Escherichia coli EIIANtrprotein in vivo [J]. FEMS Microbiology Letters, 2008,286(1):96-102.

[32] Jasinski M, Ducos E,Martinoia E, et al. The ATP-binding cassette transporters: Structure, function, and gene family comparison between rice and arabidopsis. [J]. Plant Physiology, 2003,131(3):1169-1177.

[33] Liu S, Guo C, Dang Z, et al. Comparative proteomics reveal the mechanism of Tween80enhanced phenanthrene biodegradation bysp. GY2B [J]. Ecotoxicology & Environmental Safety, 2017,137:256-264.

[34] Marques J C, Oh I K, Ly D C, et al. LsrF, a coenzyme A-dependent thiolase, catalyzes the terminal step in processing the quorum sensing signal autoinducer-2 [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2014,111(39):14235-14240.

[35] Nakagawa M, Kawano Y, Akasaka Y, et al. Resistance of bacillus endospores to extreme terrestrial and extraterrestrial environments [J]. Digestive Endoscopy, 2003,16(1):84-87.

[36] 馮 姍.一個新的家蠶轉錄相關鋅帶蛋白基因的克隆及其原核表達研究[D]. 杭州:浙江大學, 2006.

Feng S.Cloning and Prokaryotic Expression of a Novel Transcription-associated Zinc Ribbon Protein Gene from Silkworm, Bombyx Mori [D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2006.

[37] Lensbouer J J, Doyle R P. Secondary transport of metal-citrate complexes: the CitMHS family [J]. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 2010,45(5):453-462.

[38] Hoa N T, Brannigan J A, Cutting S M. The Bacillus subtilis signaling protein SpoIVB defines a new family of serine peptidases [J]. Journal of Bacteriology, 2002,184(1):191.

[39] Consortium G O. The Gene Ontology (GO) database and informatics resource [J]. Nucleic Acids Research, 2004,32(suppl_1):D258-D261.

[40] Minoru K, Susumu G, Yoko S, et al. KEGG for integration and interpretation of large-scale molecular data sets [J]. Nucleic Acids Research, 2012,40(D1):D109-D114.

[41] Kim S, Kwon C, Song G, et al. The rice zebra3 (z3) mutation disrupts citrate distribution and produces transverse dark-green/green variegation in mature leaves [J]. Rice, 2018,11(1):1-15.

[42] Sarantinopoulos P, Makras L, Vaningelgem F, et al. Growth and energy generation by Enterococcus faecium FAIR-E 198 during citrate metabolism [J]. International Journal of Food Microbiology, 2003,84(2):197-206.

[43] Sauer D B, Song J, Wang B, et al. Structure and inhibition mechanism of the human citrate transporter NaCT [J]. Nature, 2021,591(7848): 157-161.

[44] Dahl U, Jaeger T, Nguyen B T, et al. Identification of a phosphotransferase system of escherichia coli required for growth on N-acetylmuramic acid [J]. Journal of Bacteriology, 2004,186(8):2385.

[45] Fujita Y. Carbon catabolite control of the metabolic network in bacillus subtilis [J]. Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan, 2009,73(2):245-259.

[46] Houot L, Chang S, Pickering B S, et al. The phosphoenolpyruvate phosphotransferase system regulates vibrio cholerae biofilm formation through multiple independent pathways [J]. Journal of Bacteriology, 2010,192(12):3055-3067.

[47] 陳孚江.乙酰輔酶A對釀酒酵母生理代謝的影響[D]. 無錫:江南大學, 2010.

Chen F J. Effects of Acetyl-CoA Synthetase Genes Overexpression on Physiological Functions of Saccharomyces Cerevisiae [D]. Wuxi: Jiangnan University, 2010.

[48] Liu C E, Liu P Q, Ames F L. Characterization of the adenosine triphosphatase activity of the periplasmic histidine permease, a traffic ATPase (ABC Transporter) [J]. Journal of Biological Chemistry, 1997,272(35):21883-21891.

[49] 王鏡巖,朱圣庚,徐長法.生物化學教程[M]. 北京:高等教育出版社, 2008:16-29.

Wang J Y, Zhu S G, Xu C F.Essential Biochemistry [M]. Beijing: Higher Education Press, 2008:16-29.

[50] Hermann T. Antibiotic tricks a switch [J]. Nature, 2015,526(7575): 650-651.

[51] Buesen R, Mock M, Seidel A, et al. Interaction between metabolism and transport of benzo[a]pyrene and its metabolites in enterocytes. [J]. Toxicology & Applied Pharmacology, 2002,183(3):168-178.

[52] 孔德康,李 藝,王紅旗,等.紅球菌跨膜運輸熒蒽的差異膜蛋白分析[J]. 中國環境科學, 2019,39(1):274-280.

Kong D K, Li Y, Wang H Q, et al. Differential membrane protein analysis of Rhodococcus during the transmembrane-transport process of fluoranthene [J]. China Environmental Science, 2019,39(1): 274-280.

[53] Kweon O, Kim S J, Jones R C, et al. A polyomic approach to elucidate the fluoranthene-degradative pathway in Mycobacterium vanbaalenii PYR-1. [J]. Journal of Bacteriology, 2007,189(13):4635-4647.

[54] Cao J, Lai Q, Yuan J, et al. Genomic and metabolic analysis of fluoranthene degradation pathway in Celeribacter indicus P73T [J]. Scientific Reports, 2015,5(1):7741.

[55] Qin W, Fan F, Zhu Y, et al. Comparative proteomic analysis and characterization of benzo(a)pyrene removal by Microbacterium sp. strain M.CSW3 under denitrifying conditions[J]. Bioprocess and Biosystems Engineering, 2017,40(12):1825-1838.

[56] Li S W, Liu M Y, Yang R Q. Comparative genome characterization of a petroleum-degrading bacillus subtilis strain DM2 [J]. International Journal of Genomics, 2019,2019(3):1-16.

[57] Goyal L, Jalan N K, Khanna S. Butanol tolerant bacteria: Isolation and characterization of butanol tolerant Staphylococcus sciuri sp [J]. Journal of Biotech Research, 2019,10:68-77.

[58] Deng M, Li J, Liang F, et al. Isolation and characterization of a novel hydrocarbon-degrading bacterium Achromobacter sp. HZ01from the crude oil-contaminated seawater at the Daya Bay, southern China [J]. Marine Pollution Bulletin, 2014,83(1):79-86.

[59] Wang H, Yang Y, Xu J, et al. iTRAQ-based comparative proteomic analysis of differentially expressed proteins in Rhodococcus sp. BAP-1induced by fluoranthene [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2019,169:282-291.

[60] Hong Y H, Deng M C, Xu X M, et al. Characterization of the transcriptome of Achromobacter sp. HZ01with the outstanding hydrocarbon-degrading ability [J]. Gene, 2016,584(2):185-194.

[61] Buschiazzo A, Trajtenberg F. Two-component sensing and regulation: how do histidine kinases talk with response regulators at the molecular level? [J]. Annual Review of Microbiology, 2019,73(1):507-528.

[62] 汪國俊.雙組分系統LisK/R通過調控鞭毛基因表達影響單增李斯特菌低溫生長[D]. 武漢:華中農業大學, 2021.

Wang G J. TCS LisK/R plays a role in Listeria monocytogenes growth at cold temperatures by regulating the expression of flagellar genes [D]. Wuhan: Central China Agricultural University, 2021.

[63] 詹 清.新鞘氨醇桿菌US6-1降解BaP的群體感應調控系統的初步研究[D]. 廈門:廈門大學, 2017.

Zhan Q.Preliminary study on quorum sensing system in Novosphingobium pentaromativorans US6-1for BaP biodegradation [D]. Xiamen: Xiamen University, 2017.

[64] Sampedro I, Parales R E, Krell T, et al. Pseudomonas chemotaxis. [J]. FEMS Microbiology Reviews, 2015,39(1):17-46.

[65] Zaval'skii L Y, Marchenko A I, Borovik R V. The study of bacterial chemotaxis to naphthalene [J]. Microbiology, 2003,72(3):363-368.

Differential proteomic analysis of fluoranthene-degrading bacteria under co-metabolic conditions.

ZHONG Qi, WANG Hong-qi*, JIANG Ru-han, XIAO Ya-qian, WU Xiao-xiong

(College of Water Sciences, Beijing Normal University, Beijing 100875, China)., 2022,42(9)：4423～4432

The research object was thesp. DQ01, a highly effective Polycyclic Aromatic Hydrocarbons degrading bacteria screened by the research group. Fluoranthene and Luria-Bertani medium (LB medium) were used as the target pollutant and the co-metabolic substrate, respectively. The whole protein expression result of bacteria degrading fluoranthene in Minimal Salt Medium (MSM) and MSM-LB culture environment was compared with the isobaric tags for relative and absolute quantity (iTRAQ) technology to reveal changes in molecular metabolism level ofin the process of co-metabolism. In the results, a total of 64 differentially expressed proteins were detected, consisting of 28 up-regulated proteins and 36 down-regulated proteins. It was identified that the functions of differential proteins focused on metabolism, stress response, information transmission and regulation. At the same time, compared to the results from KEGG pathway enrichment analysis, the changes in bacterial pathways were thought to relate to energy metabolism, information transmission and regulation. Compared with the differential protein expression of bacteria under co-metabolism, the key link of bacteria in the process of degrading PAHs could be speculated to be the pathway of small molecule metabolism and adaptation to the external environment.

co-metabolism；comparative proteomic；PAHs；microbial degradation；protein functional analysis

X172

A

1000-6923(2022)09-4423-10

2022-02-21

國家自然科學基金資助項目(41772234)

*責任作者, 教授, amba@bnu.edu.cn

鐘 琦(1998-),男,安徽銅陵人,北京師范大學碩士研究生,主要從事污染土壤修復與治理研究.