鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr/-Y鎂合金體外生物相容性研究

許東光，馬春華,2,3*，冷玉敏,3，楊浩

（1.南陽師范學院 機電工程學院，河南南陽 473061；2.重慶大學 材料科學與工程學院，重慶 400044；3.河南省稀土合金材料工程技術研究中心，河南南陽 473061；4.南陽師范學院 化學與制藥工程學院，河南南陽 473061）

由于鎂合金在人體內(nèi)具有原位降解的能力，其生物相容性、骨傳導性有能力積極刺激人體新骨骼的形成，優(yōu)良的強度、延展性、抗疲勞性和生物耐腐蝕性是鎂合金作為生物降解種植體在骨科應用中的重要前提，是一種發(fā)展?jié)摿薮蟮墓切迯徒饘俨牧稀＝陙恚琈g-Zn-Zr鎂合金，特別是ZK40（Mg-4Zn-0.5Zr）和ZK60（Mg-6Zn-0.5Zr）鎂合金由于具有良好的生物安全性和生物相容性受到廣大研究學者的關注。除了上述商用鎂合金系列外，研究者還開發(fā)了新的鎂合金用于骨科領域，包括Mg-Ca、Mg-Sr、Mg-Zn和Mg-RE合金系列[1]。

以往的研究表明[2-8]，營養(yǎng)元素（如Ca、Sr、Zn、Si和Mn）和微量無毒元素（如Zr、Nd和Y）單獨或一起添加到Mg基質(zhì)中，不會造成有害的局部組織反應，易被周圍組織吸收。基于溶血和MC3T3-E1細胞粘附試驗結果表明，Mg-6Zn合金具有良好的體外生物相容性[9]。YU等[10]對擠壓態(tài)Mg-6Zn鎂合金的體外生物相容性進行了評價，發(fā)現(xiàn)當Mg-6Zn鎂合金植入兔子的腸道1、2和3周后，能夠上調(diào)體內(nèi)閉合蛋白（Occludin）和緊密連接蛋白（ZO-1）的表達，并促進周圍腸道組織緊密連接的再生。

因此，本文通過pH測試、合金體外溶血率測試、CCK-8細胞毒性試驗以及細胞形態(tài)觀察等方法對鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr和Mg-Zn-Zr-Y鎂合金的體外生物相容性進行了探討研究，以確定其作為可降解生物醫(yī)用金屬材料的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

本實所用基礎材料為洛陽邁格鎂業(yè)有限公司提供的純鎂和鍛造態(tài)鎂合金板材，純鎂板的純度為99.98%，鍛造態(tài)鎂合金板材的名義成分為Mg-5.45Zn-0.38Zr（質(zhì)量分數(shù)，%)和Mg-5.45Zn-0.38Zr-0.73Y（質(zhì)量分數(shù)，%)，經(jīng)過合金配比—熔鑄—板坯—軋制生產(chǎn)工藝制成。純鎂及鍛造態(tài)鎂合金板材的實際化學成分如表1所示。

表1 純鎂及鍛造態(tài)鎂合金的實際化學成分

1.2 儀器與試劑

FA1004電子天平，上海天平儀器廠；HM350A電火花線切割，深圳海瑪數(shù)控有限公司；WD-9415B超聲波清洗器，北京市六一儀器廠；Nikon D3300數(shù)碼相機，日本尼康公司；DX708D金相顯微鏡，上海上光新光學科技有限公司；CMT5305微機控制電子萬能試驗機，美斯特工業(yè)系統(tǒng)（中國）有限公司；400HBS-3000數(shù)顯布氏硬度計，萊州華銀實驗儀器有限公司；D8 ADVANCE型X射線多晶衍射儀，德國布魯克公司；ZEISS Sigma 500場發(fā)射掃描電子顯微鏡，德國蔡司公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司；CHI 660D電化學工作站，上海辰華儀器有限公司；Forcipol 2V研磨拋光機，英國科密特公司；HF90 CO2培養(yǎng)箱，力新儀器（上海）有限公司；Leica DMi8倒置相差顯微鏡，德國徠卡公司；MK3酶標儀，美國賽默飛世爾公司；PHS-3C精密酸度計，上海大普儀器有限公司。

無水乙醇，99.5%，天津市風船試劑科技化工有限公司；冰乙酸，99.5%，天津市津北精細化工有限公司；模擬體液（SBF），東莞市創(chuàng)峰自動化科技有限公司；人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC），中國科學院細胞庫；1640細胞培養(yǎng)液、磷酸鹽緩沖液（PBS），江蘇凱基生物技術股份有限公司；胎牛血清（FBS），美國GeminiBio公司；CCK-8檢測試劑盒，日本Dojindo公司。

1.3 合金浸提液的制備

鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr/-Y鎂合金樣品（直徑20 mm，厚度3 mm）使用無水乙醇超聲清洗，用去離子水快速沖洗烘干，紫外燈輻照滅菌，正反面各照射30 min，然后放于無菌離心管中，保存在無菌箱中待用。以1640細胞培養(yǎng)液為浸提介質(zhì)，按試樣表面積（cm2）與浸提介質(zhì)體積（mL）之比為1.25∶1.00的比例加入1640細胞培養(yǎng)液，并置于37 ℃恒溫、95%相對濕度和5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)24 h，得到合金浸提液原液[11-12]。然后加入1640培養(yǎng)基，以單純1640培養(yǎng)基為陰性對照組，以含有0.64%苯酚作為陽性對照組。合金材料均經(jīng)過121 ℃高溫高壓滅菌。

1.4 細胞的傳代培養(yǎng)

HUVEC接種于含10%的FBS、100 U/mL青霉素和100 g/mL鏈霉素的1640培養(yǎng)基，在37 ℃恒溫、95%相對濕度和5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d更換1次溶液。當細胞生長成單層匯合至80%時進行細胞傳代培養(yǎng)。

將培養(yǎng)基倒掉，加2 mL的PBS沖洗一下，加1～2 mL的0.25% EDTA-胰酶（室溫），鏡檢細胞形態(tài)，待細胞變形后去除胰酶，加入含有FBS的完全培養(yǎng)基終止消化。吸管輕柔吹打，盡量讓細胞均勻分散，后取出培養(yǎng)基在1 000 r/min離心5 min；去掉上清液，加入3 mL完全培養(yǎng)基后重置，接種到3個培養(yǎng)皿中，放到37 ℃恒溫CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 CCK-8法細胞毒性測試

細胞懸液處理細胞24 h后，每孔加入10 μL的CCK-8試劑，混勻后在培養(yǎng)箱中孵育1 h，測定450 nm波長處的吸光值。細胞的相對增殖率（RGR）通過式（1）計算：

式中，ODT1為實驗組材料的平均吸光度值，ODN1為陰性對照組（培養(yǎng)液+CCK-8）的平均吸光度值。

根據(jù)ISO 10993-5：1999[11]標準要求，細胞增殖率和細胞毒性的相對關系見表2。其中，0級和1級表示沒有細胞毒性，2級表示輕度細胞毒性，3級表示中度細胞毒性，4級表示明顯細胞毒性。

表2 細胞增殖率與細胞毒性分級的對應關系

1.6 細胞形態(tài)觀察

將細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中（5 000個/孔），37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，加細胞懸液之前細胞拍照記錄。分別于第1 d、4 d和7 d在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，拍照記錄。

1.7 體外溶血率測試

（1）浸提液的制備

所有樣品均使用無水乙醇超聲清洗，用去離子水快速沖洗烘干，紫外燈輻照滅菌，正反面各照30 min，放于無菌離心管中，保存在無菌箱中待用。按照ISO標準制備浸提液[13]：將2種試驗樣品（鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr/-Y合金）按照樣品表面積（cm2）∶溶液體積（mL）為1.25∶1的比例分別浸泡于50 mL生理鹽水中，于（37±0.5）℃無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

（2）體外溶血試驗

分實驗組、陰性對照組和陽性對照組，基礎溶液分別為浸提液、生理鹽水及蒸餾水。3組分別加入200 μL樣品至0.6 mL的小試管中，37 ℃恒溫水浴30 min。10 mL生理鹽水與8 mL人抗凝血（含0.5 mL濃度為20 g/L的草酸鉀）混合，之后分別取200 μL加入各試管，37 ℃水浴 60 min，1 500 r/min離心 5 min，上清液在分光光度計545 nm波長處測定吸光度，每組3個平行樣本，計算平均值。根據(jù)公式（2）計算溶血率（HR）：

其中，ODT2、ODN2和ODP2分別代表實驗組、陰性對照組（生理鹽水）和陽性對照組（蒸餾水）吸光度值，溶血率小于5%表示材料無明顯溶血。

1.8 統(tǒng)計分析

本實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，P＜0.05認為有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 材料對模擬體液pH值的影響

圖1為純鎂及鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr和Mg-Zn-Zr-Y鎂合金在（37±0.5）℃恒溫SBF中浸泡240 h的pH值變化曲線。從圖1中可以看到，在浸泡腐蝕的初期，所有樣品的pH值上升都較快，浸泡48 h后pH值上升到最高點，都在10以上。發(fā)生此種現(xiàn)象的主要原因是鎂合金在浸泡腐蝕過程中，其表面會發(fā)生化學反應并析出大量的H2，陰極溶解會生成OH-，在模擬體液體積保持不變的情況下，體系中的OH-含量必然會越來越多，隨著浸泡腐蝕的不斷進行，模擬體液不斷地被堿化，鎂合金腐蝕也越嚴重。這個堿化特性也決定了鎂合金在實際體液環(huán)境中表面總是更易于堿化。

圖1 純鎂及鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr/-Y合金對SBF體系pH值變化的影響

從圖1可以看出堿化效應最終使得體系pH值穩(wěn)定在9.5左右。但是應當注意的是，當合金植入生物體內(nèi)時，由于生物體內(nèi)體液環(huán)境是動態(tài)交換循環(huán)的，所以體內(nèi)pH值的升高將會刺激生物體內(nèi)的酸堿平衡系統(tǒng)進行自我調(diào)節(jié)，因此并不會像體外模擬實驗一樣升高到9.5。

2.2 合金材料的溶血特性

由表3可知，鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr合金溶血率為0.6%，鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr-Y合金溶血率為0.5%，均低于5%，表明鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr和Mg-Zn-Zr-Y鎂合金不會導致嚴重溶血現(xiàn)象發(fā)生。根據(jù)ISO標準[12]，鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr和Mg-Zn-Zr-Y鎂合金在體外降解過程中對紅細胞無明顯的破壞作用，具有優(yōu)良的血液相容性。

表3 Mg-Zn-Zr/-Y鎂合金溶血實驗結果（n=3）

2.3 合金材料的體外生物相容性

2.3.1 鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr和Mg-Zn-Zr-Y鎂合金的細胞毒性

CCK-8法研究合金材料的細胞毒性實驗結果見表4。從表4可知，細胞在鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr（合金A）和Mg-Zn-Zr-Y（合金B(yǎng)）鎂合金材料不同濃度浸提液中分別培養(yǎng)1 d、4 d 和7 d后，在同一時間節(jié)點，細胞的活性（OD值）與陰性對照組相比具有顯著性差異（P＜0.05）；細胞在同一濃度浸提液中培養(yǎng)不同時間的細胞活性之間差異顯著（P＜0.05）。

表4 不同組別吸光度(OD)及細胞相對增殖率(RGR)結果（n=3）

培養(yǎng)7 d后，當浸提液濃度為10%時，細胞的相對增殖率均大于90%，細胞毒性為0～1級；當浸提液濃度為50%時，細胞的相對增殖率為15.1%～38.2%，細胞毒性為3～4級，呈中度和明顯細胞毒性；當浸提液濃度為100%時，細胞的相對增殖率為13.6%～14.9%，細胞毒性為4級，呈明顯細胞毒性。

CCK-8實驗結果表明鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr和Mg-Zn-Zr-Y鎂合金材料的浸提液濃度為10%時，對細胞的毒性較小，幾乎不影響細胞的增殖；而當浸提液的濃度為50%或100%時，對細胞有毒性作用，且會影響細胞的增殖。

2.3.2 鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr和Mg-Zn-Zr-Y合金對細胞形態(tài)的影響

圖2為HUVEC在不同濃度（100%、50%、10%）鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr合金浸提液和對照組中培養(yǎng)1 d、4 d和7 d后在倒置相差顯微鏡下觀察到的細胞形態(tài)。圖3為HUVEC在不同濃度（100%、50%、10%）鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr-Y合金浸提液和對照組中培養(yǎng)1 d、4 d、7 d后在倒置相差顯微鏡下觀察到的細胞形態(tài)。

圖2 不同濃度Mg-Zn-Zr浸提液對HUVEC細胞形貌的影響（10×）

圖3 不同濃度Mg-Zn-Zr-Y合金浸提液對HUVEC細胞形貌的影響（10×）

從圖2和圖3可以看出，培養(yǎng)第1 d，細胞密度低，50%Mg-Zn-Zr浸提液和100%、50%Mg-Zn-Zr-Y浸提液培養(yǎng)的細胞出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，其他濃度浸提液培養(yǎng)的細胞幾乎全部貼附在培養(yǎng)板的底部，細胞呈現(xiàn)扁平梭形，輪廓清晰；培養(yǎng)第4 d，細胞增殖迅速，形態(tài)正常；培養(yǎng)第7 d，100%和50%Mg-Zn-Zr-Y浸提液培養(yǎng)的細胞出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，10%濃度浸提液培養(yǎng)的細胞數(shù)量顯著增加，成團簇增長。然而，在同一時間節(jié)點不同組的細胞形態(tài)與陰性對照組無明顯差異。

3 結論

本文研究了鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr和Mg-Zn-Zr-Y鎂合金對模擬體液pH值及其浸提液對HUVEC細胞的影響，發(fā)現(xiàn)鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr/-Y鎂合金在模擬體液中的腐蝕速度均高于純鎂的腐蝕速度；鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr/-Y合金不會導致嚴重溶血，體外降解過程中對紅細胞無明顯的破壞作用，具有優(yōu)良的血液相容性；鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr/-Y鎂合金材料的浸提液濃度為10%時，幾乎不影響細胞增殖，而當浸提液的濃度為50%或100%時，對細胞有一定的毒性作用，會影響細胞增殖；在100%和50%Mg-Zn-Zr-Y浸提液培養(yǎng)7 d后，HUVEC出現(xiàn)死亡，10%濃度浸提液培養(yǎng)的細胞數(shù)量則顯著增加，成團簇增長。