醫藥化工廢水降解菌的分離及菌群分析

周旭華，蘇 悅

（1.長治職業技術學院，山西 長治 046000；2.杭州秀川科技有限公司，浙江 杭州 311121）

0 引言

天然和人工合成品的甾體激素，均具有環戊烷駢多氫菲母核。廢水中主要污染物為稠環的雜環有機物，吡啶及吡啶鹽含量較多。甾體激素制藥廢水具有濃度高、生化性差、生物抑制性高等特點，處理難度較大。生物法具有處理成本低、降解具有特異性和無二次污染等優勢，目前報道的甾體制藥廢水高效降解菌株主要有假單胞菌屬（psudomonas sp.）、醋酸桿菌屬（Acetobacter sp.）、不動桿菌屬（Acinetobacter sp.）、鐮刀菌屬（Fusarium sp.）、紅球菌屬（Rhodococcus sp.）和鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium sp.）等[1-5]。

本實驗室已經進行了大量醫藥化工廢水生物處理的相關研究。本研究擬從甾體激素制藥廢水的生物處理系統物種分布情況，探究有效降解甾體制藥廢水的可能物種組成，為同類廢水工程應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

樣品來源于湖南某生物制藥公司甾體激素醫藥原料生產廢水的生化處理系統。菌株分離自曝氣池混合液，高通量測序樣品來源于曝氣池的活性污泥。該處理系統已經穩定運行約9個月，曝氣池運行溫度約為45℃。曝氣池的進水水質基本情況如下：COD 26 876 mg/L，NH3-N 297 mg/L，TP 5.8 mg/L，鹽度2.56%，pH 7.0。采樣時間為2019年10月14日，4℃冷藏。分離出的菌株由杭州秀川科技有限公司實驗室保存。

1.2 培養基

LB液體培養基：酵母提取物5.0 g/L、胰蛋白胨10.0 g/L、NaCl 10.0 g/L，pH 7.0。121℃滅菌20 min。

LB固體培養基：1 L的LB液體培養基加入20.0 g瓊脂。121℃滅菌20 min。

1.3 菌株分離純化

菌株分離：采用梯度稀釋涂布法，將富集液梯度進行稀釋，隨后取各梯度的樣品0.1 mL，用無菌的玻璃涂布棒均勻涂布到LB固體培養基上，分別在30℃和50℃培養箱內倒置培養，定期觀察，直至出現明顯的單菌落[6]。

菌株純化：挑取形態不同的單菌落至無菌的LB固體培養基上，多次畫線，得單菌落。

1.4 形態學特征

菌落形態：觀察平板上菌落培養1～3 d后的形狀、大小、顏色、邊緣、透明程度和突起等。

1.5 DNA提取

取菌液1 mL，12 000 r/min離心5 min，棄上清液，加100 μL無菌的MilliQ級水重懸菌體；煮沸30～40 min；放-20℃環境2 h以上；12 000 r/min離心5 min，上清液備用。

1.6 PCR擴增

引物1：27F（5′-GAGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）。

引物2：1492R（5′-TACGGYTACCTTGTTACGAC-3′）擴增16S rDNA。擴增體系為PCR mix：12.5 μL，引物1：0.5 μL，引物2：0.5 μL，無菌的MilliQ級水：10.5 μL，DNA模板：1 μL。擴增程序：25 μL反應體系35個循環；變性：98℃，5 s；退火：55℃，10 s；延伸：72℃，25 s。

1.7 序列分析

將分離純化得到的菌株PCR擴增產物直接送交杭州擎科生物技術有限公司進行序列測定，16S rDNA序列提交至EzBioCloud數據庫進行序列比對。污泥樣品直接送交生工生物工程（上海）股份有限公司進行高通量宏基因組微生物測序。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離

從樣品中分離純化的14株菌株，大部分可以在中等鹽濃度的培養基中生長。其中KR1和KR4在50℃培養分離，其余在30℃培養分離。

2.2 形態學特征

菌落呈白色或乳白色，其中白色菌落居多。菌落呈圓形，培養1～3 d后，直徑為1～4 mm；表面光滑或粗糙；大多數不透明，少數半透明或透明（表1）。

表1 部分分離菌株的形態學特征

2.3 測序結果

通過高通量宏基因組微生物測序共得到去除嵌合體與靶區域外后的序列數68 286條，根據結果表明，污泥樣品中微生物主要分布在5個屬，分別為貪銅菌屬（Cupriavidus sp.）53.68%，無色桿菌屬（Achromobacter sp.）30.67%，橄欖形菌屬（Olivibacter sp.）7.23%，伊 麗 莎 白 菌 屬（Elizabethkingia sp.）2.78%，嗜染料菌屬（Pigmentiphaga sp.）1.79%（圖1）。

圖1 屬水平豐度

圖1為樣品內物種豐度，豐度前13的物種按不同的顏色標出。

對從樣品中分離純化的菌株中挑選有代表性的14個菌株進行16S rDNA序列測定，并提交至EzBioCloud數據庫進行比對，14個菌株分布在5個屬，其中芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）6株，伊麗莎白菌屬（Elizabethkingia sp.）2株，無色桿菌屬（Achromobacter sp.）2株，假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）3株，鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium sp.）1株（表2）。

表2 菌株16S rDNA序列的BLAST比較結果

2.4 基于COG的功能分析

通過對已有測序微生物基因組的基因功能的構成進行分析后，獲得的物種構成推測樣本中的功能基因的構成（圖2）。

圖2 功能預測豐度

3 結語

16S rDNA常用于生物物種的分子進化分析，序列分析結果表明，在生物降解甾體激素制藥廢水中起作用的可能菌群包括貪銅菌屬（Cupriavidus sp.）、無色桿菌屬（Achromobacter sp.）、橄欖形菌屬（Olivibacter sp.）、伊麗莎白菌屬（Elizabethkingia sp.）、嗜染料菌屬（Pigmentiphaga sp.）、芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）、假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）、鞘氨醇桿菌屬（Sphingobˉacterium sp.）等。假單胞菌屬（psudomonas sp.）和鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium sp.）與已有報道處理同類廢水菌群相同[1，3]。鞘氨醇桿菌屬（Sphingobium）是一類具有很強的烷烴、雜環芳香烴降解能力的革蘭氏陰性細菌。陸源源[7]也從城市污水處理廠獲得高效降解甾體雌激素的鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium sp.）菌株。

曝氣池混合液梯度稀釋涂布平板在50℃下培養2 d主要生長芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）。在30℃下培養分離純化得到菌株較為豐富，包括伊麗莎白菌（Elizabethkingia anophelis）、無色桿菌（Achromobacter anxifer）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）、高地芽孢桿菌（Bacillus altitudinis）、嗜熱鞘氨醇桿菌（Sphingobacterium thermophilum）。高地芽孢桿菌（Bacillus altitudinis）KR1和特基拉芽孢桿菌（Bacillus tequilensis）KR4可以在50℃下較好生長。周旭華等[8]從高鹽環境中篩選的一株嗜耐鹽菌株高地芽孢桿菌（Bacillus altitudinis），能高效降解吡啶。孫智毅[9]從焦化廢水中分離出一株具有高效異養硝化-好氧反硝化的貪銅菌屬（Cupriavidus sp.）菌株。孫福艷等[10]從煙草工業廢水處理廠的污泥中篩選出一株不動桿菌屬（Acinetobacter sp.）甾體雌激素降解菌株，能以雌酮為底物。高通量測序和可培分析之間不能完全對應，可能與采用的培養基和培養條件有關，也可能與人工挑選菌落遺漏有關，也可能與高通量測序樣品污染有關，需進一步確認。