利用環介導等溫擴增結合核酸試紙條技術快速檢測糞便艱難梭菌的方法研究

駱益華 吳麗娜 吳 俊 趙 明 邵飛琴 張偉群

1.杭州市臨安區第一人民醫院檢驗科，浙江杭州 311300；2.杭州市臨安區疾病預防控制中心，浙江杭州 311300

艱難梭菌實驗室檢測方法主要有細胞毒素中和試驗（cell cytotoxicity assay，CCTA）、厭氧培養法、免疫學毒素檢測包括酶聯免疫分析（enzyme immunoassay，EIA）法、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測方法等，但是各種方法均存在一定的缺點和局限性。環介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術是一種核酸擴增方法，該方法使用4 對引物檢測位于tcdA5 端的6個不同保守區域，在等溫條件下進行擴增，具有快速、費用低、敏感度高、特異性強、操作簡便的特點。

本研究旨在研究利用環介導等溫擴增（loopmediated isothermal amplification，LAMP）結合核酸試紙條技術建立一種艱難梭菌快速檢測的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

采集2016 年1 月至2017 年12 月杭州市臨安區第一人民醫院臨床感染性腹瀉患者的糞便標本201份，所有糞便標本均于-80℃冷凍保存。沙門菌、副溶血性弧菌、志賀菌、致病性大腸埃希菌、創傷弧菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌共7 個菌株，均為標準菌株。

1.2 儀器與試劑

臺式高速離心機（德國Eppendorf公司）；CFX-96 Touch 型實時熒光定量PCR 儀；生物安全柜（NU-543-600S）；超微量紫外分光光度計（Thermo NDONE-W）；高熱滅菌器（日本松下公司）；恒溫培養箱（日本松下公司）；冰箱（日本三洋公司）。LAMP脫氧核糖酸擴增試劑盒（日本榮研株式會社）；熒光目視檢測試劑盒（日本榮研株式會社）；DNA Kit 提取試劑盒；溶菌酶。

1.3 方法

1.3.1 艱難梭菌的培養 取200mg 糞便樣本裝入1.5ml 的EP 管中，加入800μl 無水乙醇，漩渦震蕩至糞便均勻分散，室溫靜置1h，8000 轉/min 離心2min，棄上清，用500μl 0.9%（質量分數）氯化鈉注射液（以下簡稱生理鹽水）混勻后全量倒入烘烤后的艱難梭菌分離平板上（平板需提前在烘箱內烘烤40～50min），涂布直至液體收干，放入厭氧盒中37℃培養48h，挑取單菌落接種至血平板上，37℃再培養48h，保存菌株。

1.3.2 艱難梭菌DNA 的提取 取1.5ml 的EP 管，裝入200μl PBS 溶液，用接種環接入足量菌，加入100μl 20mg/ml 的溶菌酶，漩渦振蕩后放入55℃水浴鍋孵育1h，取出EP 管，快速離心使管壁上液體回落，加入20μl 蛋白酶K，200μl 緩沖AL，混勻后56℃水浴10min，離心，加入200μl 無水乙醇，混勻15s，離心，將所有液體小心加入吸附柱，8000 轉/min 離心1min，棄下管，換新的收集管，加入Buffer AW1 500μl，8000 轉/min 離心1min，換新的收集管，加入Buffer AW2 500μl，14000 轉/min 離心3min，換新的收集管，14000 轉/min 離心1min。將吸附柱換到干凈的EP 管中加入200μl 緩沖AE，室溫靜置1min，8000 轉/min 離心1min 即得DNA 提取液（DNA 濃度用超微量紫外分光光度計測量并記錄），-20℃保存備用。

1.3.3 引物的設計與合成 從美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數據庫中獲取已知的艱難梭菌基因tcdA 基因序列，選擇區域分別設計LAMP 反應所需的4～6 條引物，引物由上海生工生物工程技術公司合成。

1.3.4 LAMP 擴增反應體系及引物篩選 應用LAMP 通用試劑盒檢測艱難梭菌，通過比較各組引物的反應結果優劣，篩選出較好的引物組合。LAMP擴增法的反應體系為25μl：2×反應緩沖液（Tris-HCl（pH=8.8）40mmol/L，KCl 20mmol/L，MgSO16mmol/L，（NH）SO20mmol/L，Tween20 0.2%，Betaine 1.6mol/L，dNTPS 2.8mmol/L）12.5μl，Bst DNA 聚合酶 1.0μl，F3（10μmol/L）0.25μl，B3（10μmol/L）0.25μl，FIP（10μmol/L）2.25mol/L，BIP（10μmol/L）2.25μl，FIP-Bio（10μmol/L）1.75μl，LF-Fit（10μmol/L）1μl，Sterilized ddHO 0.75μl。另再加鈣黃綠素指示劑1μl。將反應體系混勻后，在CFX-98 熒光定量PCR 儀上63℃等溫擴增60min。根據熒光擴增曲線及顏色變化判斷最終結果，出現熒光綠判定為陽性，橙色為陰性。再采用試紙條裝置進行檢測，觀察結果。

1.3.5 LAMP 反應條件優化 反應體系根據反應溫度的不同進行優化，每組反應進行3 個重復。反應溫度分別設為60、61、62、63、64、65℃。

1.3.6 LAMP 檢測敏感度試驗 將提取的艱難梭菌DNA 模板用Sterilized ddHO 進行10 倍梯度稀釋，7個梯度分別為8ng/μl、0.8ng/μl、0.08ng/μl、8pg/μl、0.8pg/μl、0.08pg/μl、8fg/μl，進行LAMP 擴增60min，用鈣黃綠素目視及核酸試紙條檢測，確定艱難梭菌LAMP 法的檢出限。

1.3.7 LAMP 檢測特異性試驗 對7 種腹瀉干擾菌（沙門菌、副溶血性弧菌、志賀菌、致病性大腸桿菌、霍亂弧菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌）進行培養，挑取單菌落分別提取DNA，然后進行LAMP 擴增60min，用鈣黃綠素目視和核酸試紙條檢測，檢測艱難梭菌LAMP 的特異性。

2 結果

2.1 引物篩選

按照不同引物配方及引物濃度進行LAMP 擴增。引物配方4 呈現熒光綠，核酸試紙條也呈陽性，因此艱難梭菌tcdA 最佳引物配方為配方4，見表1。

表1 擴增tcdA 基因的LAMP 最佳引物序列配方

2.2 反應溫度的優化

按照不同反應溫度進行擴增，結果顯示，不同的溫度對艱難梭菌LAMP 擴增的影響較大，擴增結果差異明顯，陽性的顯色結果和熒光結果一致，有熒光擴增曲線且均產生綠色熒光，與對應的熒光起峰一致。陰性未擴增，顯色為無色，擴增60min 60～65℃擴增結果均可以用顯色法檢測。從實驗熒光曲線Cq 值可知，61℃和62℃擴增時，雖然原始濃度的艱難梭菌DNA 模板更早開始擴增，但是總體來看所有稀釋濃度的DNA 模板擴增曲線，不如60℃擴增效率高，顯色結果也驗證了這一點。65℃擴增時，稀釋濃度為8pg/μl、0.8pg/μl、0.08pg/μl、8fg/μl 均未擴增，鈣黃綠素顯色也呈橙色，陰性，因此艱難梭菌LAMP 擴增最佳溫度為60℃。

2.3 敏感度

從Ct 值來看，每稀釋10 倍，分別約多出4 個、6 個、8 個、27 個循環。檢測限為10倍稀釋，即使模板10倍稀釋（即0.8pg/μl）時，Cq 值為87.15 個循環（每個循環30s），相當于44min，所以擴增時長控制為60min 時，推測顯色檢測也是可行的。鈣黃綠素目測法及核酸試紙條檢測結果均與擴增曲線保持一致，即較早出現擴增曲線的樣品呈綠色，核酸試紙條呈陽性。由敏感度實驗結果可知，艱難梭菌tcdA 基因的檢出限為0.8pg/μl。

2.4 特異性

在優化的LAMP 體系中對幾種腹瀉干擾菌進行特異性檢測，只有艱難梭菌可以檢測出陽性擴增，鈣黃綠素目視法呈現熒光綠色，核酸試紙條也呈現出陽性，說明引物具有良好的特異性。

3 討論

CD 是一種厭氧生長的革蘭陽性梭狀產毒芽胞桿菌，廣泛分布于土壤、水等自然環境及人和動物的糞便中，屬于條件致病菌。當人體腸道菌群失調時，艱難梭菌可大量繁殖，部分產毒性菌株通過 分泌毒素A、B 及二元毒素引起艱難梭菌感染（，CDI）及其相關性腹瀉（associated diarrhea，CDAD），甚至可能發展為危及生命健康的偽膜性腸炎。毒素A 具有腸毒素和細胞毒素，可使腸壁中性粒細胞釋放淋巴因子，引起黏膜炎性反應。此外，毒素A 還能抑制wnt信號通路，具有抗腫瘤作用。

然而臨床上存在嚴重的廣譜抗生素頻繁使用以及不合理應用等諸多問題，使得艱難梭菌感染的暴發流行概率大大增加。因此，能否對艱難梭菌感染進行快速且特異的實驗室檢測，對于臨床診療至關重要。

目前對艱難梭菌感染進行實驗室檢測有CCTA、厭氧培養、EIA 和PCR 等4 種方法，它們都存在一定缺陷和局限性，如CCTA 的檢測結果受細胞種類的限制，操作復雜，費用高，耗時長；厭氧培養法操作相對繁瑣，需時較長；EIA 敏感度差異較大，受多種條件的影響，PCR 分子水平檢測方法時間長，存在假陽性的情況。

LAMP 是一種在20 世紀90 年代核酸擴增技術研究及應用基礎上，逐漸被提出并廣泛應用的一種新的技術，該技術利用一種鏈置換DNA 聚合酶（Bst DNA polymerase）在恒溫條件下保溫60min，即可完成核酸擴增，具有快速高效，敏感度高，特異性高，操作簡單等優點，而且該技術不需要經過模板的高溫變性和低溫退火過程。目前用于等溫擴增產物檢測的方法主要有凝膠電泳、熒光染料、濁度法以及基于比色法的可視化檢測方法等。其中，凝膠電泳檢測操作繁瑣，持續時間較長，效率低；熒光法檢測需要特殊、昂貴的光學儀器；濁度法和比色法雖然用肉眼能夠觀察，但因觀察者的主觀判斷差異容易產生誤差，而且對核酸擴增效率要求較高，并不適用于所有的恒溫擴增檢測，且儀器昂貴，也不適于現場檢測。本研究中針對艱難梭菌tcdA 基因核苷酸序列設計6 條特異性引物，建立了一種針對艱難梭菌tcdA 的LAMP 檢測方法。將LAMP 法結合核酸試紙條技術，60℃擴增1h，DNA檢出限為0.8pg/μl，敏感度高，速度快；在對1 株艱難梭菌和7 株非艱難梭菌進行核酸檢測中，只有艱難梭菌陽性，證明設計的引物具有良好的特異性。

LAMP 結合核酸試紙條技術不需要復雜的儀器，只需在恒溫條件下進行擴增，再結合核酸試紙條的檢測，無需開蓋引起氣溶膠污染，也不用辨別顏色差異，操作簡便，耗時較短。本研究建立的艱難梭菌LAMP 擴增結合核酸試紙條檢測方法1h 完成反應，具有可視化、敏感度高、特異性強、方便快捷和污染少等特點，適用于糞便中艱難梭菌的快速檢測，適用于基層醫院現場快速檢測及應用。