羅非魚湖病毒病及其檢測技術研究進展

李亞男，高峰，陳宗馥，李世嬌，林蠡

（廣東省水環境與水產品安全工程技術研究中心，廣州市水產病害與水禽養殖重點實驗室，仲愷農業工程學院動物科技學院，廣東 廣州 510225）

羅非魚（Oreochroinis mossambicus）原產非洲，又名非洲鯽魚，屬鱸形目（Perciformes）、麗魚科（Cichlidae），廣泛分布于熱帶、亞熱帶的淡水和咸淡水交界水域。因其具有食性廣、生長快、繁殖力和抗病能力強等特點，在養殖方面得到廣泛推廣，是全球重要的養殖魚類之一，目前已在全世界85個國家和地區進行養殖。據聯合國糧農組織（FAO）有關數據顯示，2012年，全球羅非魚的養殖產量達456萬t，隨后逐年遞增，到2015年產量達到了640萬t。我國羅非魚養殖產量自2000年以來一直占世界羅非魚總產量的50%以上，2017年，我國羅非魚產量更是達到170多萬t。然而，伴隨著養殖密度的加大以及養殖過程中出現的水質惡化等一系列因素，羅非魚病害也隨之增多。

羅非魚湖病毒（TiLV）是一種新型的單股負鏈RNA病毒，隸屬于正黏病毒科（Orthomyxoviridae），可引起羅非魚湖病毒病（TiLVD），該病可感染幾乎所有的羅非魚種類，致死率高達80%～100%。該病毒首次從2009年以色列、厄瓜多爾、埃及、泰國等地區暴發大規模羅非魚死亡事件中被分離鑒定。世界動物衛生組織（OIE）、亞太地區水產養殖中心網（NACA）、FAO等多個國際組織，于2017年5月針對TiLV發布公告或預警。2018年起，我國海關總署、農業農村部也將TiLVD列為水產動物疫病檢疫與監測對象。2020年7月，又將TiLVD列為二類動物疫病進行防控。鑒于TiLV對羅非魚養殖業的嚴重威脅，現從TiLVD的流行病學研究、病原研究以及診斷與防治等方面進行綜述，以期為TiLVD的基礎研究和疫病防控提供相關參考。

1 羅非魚湖病毒病及其流行病學研究

1.1 發現歷史與地理分布

TiLVD最早暴發于以色列養殖和野生羅非魚群體間，造成集體死亡。2011年，厄瓜多爾Chitralada品系羅非魚以及尼羅羅非魚暴發羅非魚合胞體肝炎（SHT），之后經鑒定，均為TiLVD。2012—2016年夏，埃及暴發中、大規格尼羅羅非魚死亡事件，平均死亡率達到9.2%。2015—2017年，泰國養殖的紅羅非魚和尼羅羅非魚暴發“羅非魚一個月死亡綜合征（TOMMS）”，累計死亡率在20%～100%，后病原被證實為TiLV。

近年來，TiLVD呈逐年擴散趨勢，自2014年起，亞洲、南美洲和非洲均已檢測和分離出TiLV。到目前為止，TiLVD已在哥倫比亞、厄瓜多爾、以色列、埃及和泰國等國家流行，對馬來西亞、印度、印度尼西亞、坦桑尼亞、烏干達、菲律賓和秘魯等全球43個羅非魚貿易頻繁國家和地區造成嚴重經濟損失。依據流行病學調查，推測包括中國在內的全球40多個國家的TiLV可能來自進口的泰國孵化場羅非魚魚苗。

1.2 臨床特征

TiLV可以感染所有生命階段的羅非魚，特別是羅非魚的早期發育階段，患病魚體的肝臟、腦、脾臟和頭腎均可被感染。不同地區TiLVD的臨床表現以及病變器官有所差異，這與病原毒株、其他病原混合感染、多種病原繼發感染以及羅非魚品種差異等因素相關，臨床特征比較詳見表1。

表1 不同地區TiLVD的臨床特征比較

1.3 宿主范圍

1.4 傳播媒介

截至目前，TiLV的最初來源還未確定，已知唯一的傳染源是野生或養殖的患病羅非魚群。在其眼睛、大腦和肝臟內檢出了高濃度的病毒，推測患病死亡的羅非魚可能是重要的傳播媒介。混養條件下，TiLV可在水體中進行直接傳播。羅非魚湖病毒在試驗條件下可通過同居成功地將病毒傳播給易感魚類。此外，Pierezan等在試驗條件下，采用灌胃的方法成功地再現了該疾病，在魚類養殖池的糞便和污染水中檢測到病毒，這高度提示了口腔—糞便傳播途徑。在最近的研究中也描述了TiLV的垂直傳播。Eyngor等證明TiLV傳播介質是水體，因此羅非魚在進行交易和運輸期間傳播疾病的可能性很高；Fathi等提出鳥類的遷徙等多種途徑可能對TiLV的傳播發揮一定的作用，但該觀點還未得到證明。

1.5 流行季節

2009年5—10月，以色列全境出現羅非魚大量死亡的現象，發病水溫22～32℃。埃及TiLVD暴發季節集中在6—10月，其間發病水溫高于25℃，厄瓜多爾地區TiLVD發病時間集中在5—11月，水溫25～27℃。在泰國10月至次年5月之間采樣的羅非魚中均發現TiLV陽性。另有研究表明，24～33℃時TiLV可增殖，最適溫度25℃。由此可知，TiLVD常暴發于高溫時期，熱帶地區全年均有感染的可能性，其他地區每年的5—10月可能是TiLV大規模暴發的關鍵期。此外，TiLV可在低溫條件下存活，在-20℃冷凍保存的羅非魚肉片內至少能存活28 d。

1.6 傳入風險評估與管理

TiLVD屬于近年來新發水生動物疫病，具有極強傳染性，對羅非魚的致死率可以達到20%～90%，給該產業帶來巨大經濟損失。世界各國對此高度重視，2017年5月，OIE、NANC、FAO、CGIAR（國際農業研究磋商組織）等多個國際組織發布公告，要求其所有成員國加強對TiLVD的檢驗防范工作。我國先后從多個國家引進優良羅非魚品種進行繁育，目前是世界上最大的羅非魚養殖國，年產量超過160萬t。因此，對入境的水生動物進行TiLV檢測和風險評估，可有效降低TiLV的傳入風險。

風險評估是針對TiLV隨水生動物及其產品傳入我國引發疫病的可能性及后果進行分析，涉及危害識別、風險評估及風險管理三大方面。其中，危害識別主要是從病原、易感宿主、易感階段及靶組織、傳播媒介等幾個方面對TiLV進行識別和預防風險評估，包括對TiLV傳入的高、中、低類風險進行評估和判定。如活的敏感魚類（親魚、魚苗和魚卵）、冰凍、冰鮮的敏感魚類等，可能攜帶TiLV，且TiLV無法通過體表消毒進行消除；或者冰鮮魚類在死亡之前已經攜帶TiLV，而TiLV可在低溫下保存較長時間，因此此類動物屬于高風險；中風險評估，如在水產養殖飼喂中使用到的鮮活餌料可能摻雜有攜帶TiLV的敏感魚種，這些敏感魚種可能是病原傳入渠道之一；低風險評估包括對敏感魚的各種加工產品、非敏感魚的各種制品以及運輸活魚過程中所用到的工具等進行風險評估。目前對于TiLVD缺乏有效的治療方法與疫苗，且TiLV易感性與羅非魚種類關系密切，以上因素造成了該病的防治困難。應以預防為主，加強管理，措施如下：（1）嚴格遵循官方制定的衛生檢測計劃，定期開展苗種檢測與生物防治；（2）定時進行漁場消毒與清潔；（3）積極開發高靈敏度診斷方法，提高疾病篩查效率；（4）及時捕殺患病羅非魚，控制TiLVD的傳播，防止疫病大規模暴發。

2 病原研究

2.1 病毒發現與命名

2009年，在以色列境內的淡水湖基內雷特湖首次發現TiLV并命名。之后發現，引起厄瓜多爾羅非魚SHT的病毒基因組與TiLV相似，后被證實為TiLV。2015—2017年，泰國檢測并分離得到TiLV毒株。2017年，在印度西孟加拉邦和喀拉拉邦兩個州養殖的羅非魚中也發現了TiLV。Dong等分析證實，TiLV在2012—2017年就已經呈現全球擴散趨勢，秘魯的TiLV毒株與以色列分離株Til-4-2011具有相同起源。

2.2 形態特征

TiLV是一種RNA單股負鏈病毒，國際病毒分類委員會將其暫定為新的正黏病毒物種，單列為羅非魚病毒新屬中的羅非魚病毒種。電子顯微鏡下顯示TiLV具包膜結構，形態通常為圓形到橢圓形二十面體，少有絲狀或管狀形態，大小55～75 nm，對乙醚和氯仿敏感。

2.3 感染偏好性

魚體試驗方面，通過混養和腹腔攻毒感染證實，羅非魚及其雜交品種對TiLV敏感。TiLV也可引起其他魚類發病，Jaemwimol等對10種養殖溫水性魚類進行TiLV敏感試驗后發現，絲足鱸受感染后組織病理學損害顯著，死亡率極高。Abdullah等研究發現，野生河鯉、鯰和孔雀鱸也受到TiLV較大影響。目前經研究證實，可與TiLV陽性羅非魚混養的魚類有鯉、灰鯔、細唇鯔、印度鯪、大鯉、珍珠斑、遮目魚等。

細胞層面，TiLV可在尼羅羅非魚（Ophicephalus striatus）的成纖維細胞（E-11）、羅非魚的腦（OnlB、TiB）、肝臟（OnlL）、動脈球（OmB）和腦原代細胞（TmB）、雜交鱧腦細胞系（CAMB）中進行培養，最為合適的細胞系是E-11。其他的細胞系如來自大鱗大麻哈魚（Oncorhynchus tshawytscha）的CHSE-214、藍腮太陽魚（Lepomis macrochirus）的BF-2等均不適宜進行TiLV的培養。

2.4 基因組學研究

第一個完成全基因組測定的羅湖病毒分離株是Til-4-2011，現被認定為標準毒株，具有10個基因組節段（Segment 1~10，S1~S10，GenBank登記號為KU751814~KU751823），基因組總大小為10 323 bp，從S1到S10片段大小逐個降低，S1長1 641 bp，S10只有465 bp。所有的基因片段均存在5'-GUAAUU...UUCAUC-3'的保守序列。10個片段中，S1片段編碼蛋白與C型流感病毒的聚合酶PB1中保守氨基酸序列具有弱同源性，S4和S6片段可能分別編碼TiLV的HEF蛋白和NP蛋白，但功能還需進一步確認，其余片段編碼蛋白未發現與已知病毒存在同源性（表2）。到目前為止，包括Til-4-2011在內，已經有5個TiLV毒株完成了全基因組測序，60多個TiLV毒株完成了部分基因片段測序，分離出的毒株與Til-4-2011標準株同源性可以達到95%以上，基因序列特征十分相似。

表2 TiLV各片段研究進展[35，41-42]

2.5 致病機理

截至目前，對TiLV致病機理的研究報道十分有限。可以確定的是，當TiLV與其他細菌共同感染時，會加強TiLV對羅非魚的危害程度。據泰國相關報道，在感染TiLV的羅非魚體內還檢測出了黃桿菌、氣單胞菌和鏈球菌以及外源寄生蟲和纖毛原生動物等。埃及、馬來西亞等地養殖場的患病魚體內也同時檢測出多種氣單胞菌共同感染的情況。因此，推測氣單胞菌和TiLV可能存在協同作用，從而加強TiLV對于羅非魚的危害，但具體機制尚不明晰。

TiLV還能以潛伏狀態存在于患病羅非魚體內。具體表現為：雖然TiLV檢測呈陽性，但病毒載量較低，并未表現出明顯的臨床癥狀或只表現出亞臨床感染癥狀，這可能是由于TiLV發生遺傳變異所致。

3 診斷與防控

3.1 觀察法

可通過觀察法對魚體是否患TiLVD進行初步判斷。TiLVD典型臨床癥狀包括昏睡、眼部病變、眼球突出、身體發黑、腹脹、鱗片突出、魚鰓變白，皮膚糜爛、腎充血和腦炎等。組織病理學變化往往發生在肝臟和中樞神經系統中，如腦部水腫、組織充血；肝臟腫脹、細胞分離、合胞性肝炎等。由于不同地區、不同品系羅非魚以及TiLV毒株有差異，可能會造成臨床癥狀有差異。在以色列，養殖羅非魚中受影響的魚類表現出嗜睡、眼部改變、皮膚侵蝕和變色，而野生羅非魚中僅描述了皮膚侵蝕和眼部病變。在厄瓜多爾，TiLV感染的臨床體征包括眼球突出、皮膚變色、腹部發脹、鱗片突出和魚鰓蒼白，而在秘魯的魚類中已描述了潰瘍和眼球突出。在泰國，病魚表現出嗜睡、食欲不振、行為異常、貧血、鰓蒼白、眼球突出、皮膚充血、腹部腫脹、糜爛等癥狀。在印度，自然感染病例出現皮膚侵蝕和鱗片脫落等癥狀，但在試驗性感染魚類時觀察到眼球突出、腹部腫脹和鱗片突出等癥狀。在菲律賓，感染TiLV的魚類的臨床體征為腹部腫脹和眼睛腫脹。在埃及，受夏季死亡率影響的羅非魚出現了出血斑、脫落鱗片、開放性傷口、暗變色等癥狀和魚鰭腐爛病。

3.2 原位雜交法

原位雜交法具有靈敏度高、特異性強等優點，可用于分析保存樣品中病毒核酸的回顧性調查，對于充分了解該病的歷史流行情況具有重要意義。另外，不同的TiLV地理株感染靶組織可能存在差異，原位雜交法可用于精確定位感染靶組織。例如，利用原位雜交法，檢測出泰國患病羅非魚的主要感染組織為肝、腎以及鰓組織，而厄瓜多爾TiLV主要作用的靶器官是胃腸道和肝臟。

3.3 PCR法

目前，可用于檢測TiLV的方法有RT-PCR法、巢式RT-PCR法、熒光RT-PCR法、環介導等溫擴增反應（LAMP）等。2014年，Eyngor等開發了用于TiLV檢測的RT-PCR方法，該方法有較強的特異性和較高的敏感性，可在短時間內檢測大量臨床樣品，適用于批量臨床樣本檢測和流行病學監測。Tsofack等建立了一種更為敏感的巢式RT-PCR方法，檢測限可達7個拷貝的病毒粒子，該方法能夠對樣品中病原數量進行定量，且快速、準確、靈敏度高，現已被開發用于檢測多種魚類病毒病。隨后，Dong等發表了一種改進的半巢式RT-PCR檢測方法，省略了引物“nested ext－2”，可有效避免假陽性結果，檢測的靈敏度高于qRT-PCR方法，與巢式RT－PCR相當。2019年，Phusantisampan等和Yin等等建立了TiLV的熒光RT－LAMP快檢方法，該方法特異性好，靈敏度是半巢式RT－PCR方法的4倍，檢測限低至1.6個拷貝數的病毒粒子，為TiLV的現場快速檢測提供了一種準確可靠的方法。LAMP法作為一種全新的恒溫核酸擴增方法，雖然引物設計較為復雜，但操作簡單，對于實驗器材要求不高，反應產物用肉眼可見，具有效果明顯、成本低廉，實用性更強的特點，可用于TiLV的現場快速檢測。

3.4 防控措施

目前，TiLVD疫情還未見行之有效的治療方法，因此精準防控至關重要。首先，考慮到不同品種羅非魚對TiLV的敏感性有差異，建議養殖時避開敏感品種。另外，從苗種到成魚的養殖過程中，應采取有效的生物控制措施，改善養殖環境，減少病原微生物種類和數量，以避免降低魚體免疫力、增加TiLV感染風險；配合使用免疫增強劑，提高魚體抗病能力；養殖過程中，經常進行TiLV監測，及時發現和控制傳染源，防止疫病大規模流行。最后，加強TiLV的診斷技術研究，加快開發精準、廉價、便捷的現場快檢技術與產品；并積極推進相關疫苗研發。

4 建議

TiLVD為近年來新發重大疫病，目前已在全球范圍內流行，給羅非魚養殖產業帶來了巨大的經濟損失。今后對于TiLVD相關研究，應重點從以下幾方面開展：

（1）目前缺乏有效的TiLVD化學治療方法和疫苗，應時刻保持警惕，以預防為主，積極開展TiLVD流行病學調查，明確發病條件、流行規律以及傳播途徑等；推進病原研究，病毒的分離、傳播、復制、致病機理等是下一步需要重點關注的問題；以感染TiLV后存活下來的羅非魚為切入點，深入分析對病原的免疫應答差異，盡快研制出TiLV疫苗。

（2）由于各地區發現的TiLV毒株不同，首先應充分調查各種毒株相對應的羅非魚敏感品系，在此基礎上，盡量避免養殖TiLV易感品種，并積極進行品種改良。

（3）加強羅非魚生物安保措施管理與傳播風險評價體系建設。加強養殖管理，開展養殖環境監測，及時發現、切斷傳染源，尤其要加強羅非魚苗種廠的監測管理與消毒。另外，由于我國每年都需要從國外引進羅非魚良種、冰凍和冰鮮敏感魚類以及用作活餌料的野雜魚等，存在TiLV通過國際貿易傳入的潛在風險。對此，應督促各貿易國嚴格遵守世界動物衛生組織發布的《水生動物衛生法典》，加強入境產品有效檢疫，阻斷TiLV在國際貿易中傳播。

（4）TiLV屬于RNA病毒，變異快，且在不同地理條件下基因組存在顯著差異。應及時更新序列信息，改進診斷方法，正確區分不同地理株，開發更為精準、低價的快檢技術與產品。