加州鱸病原菌耐藥性試驗和用藥建議

朱士文，徐玉龍，潘秀蓮，陳笑冰，孫作登

（1.山東省淡水漁業研究院，山東 濟南 250013；2.聊城市茌平區水產漁業技術推廣服務中心，山東 聊城 252100；3.山東省漁業發展和資源養護總站，山東 濟南 250013）

抗生素作為防治水生動物細菌病的首選藥物，在加州鱸細菌性疾病的防治中廣泛應用。但隨著抗生素的長期大量使用，其缺點也逐漸暴露出來，如易產生耐藥性問題，甚至出現了多重耐藥現象，導致藥物治療失敗，造成經濟損失，同時也危害人類食品安全。準確把握病原菌耐藥性，可以提高施藥針對性和精準度，有效減少抗生素類藥物濫用亂用現象，切實推進水產養殖用藥減量增效，促進漁業健康綠色發展。

根據農業農村部“動物疫情監控與防治（漁業）——病原菌耐藥性普查”工作安排，在山東省聊城市加州鱸主產區2個重點養殖場采集樣品，分離病原菌，測定菌株耐藥性，在此基礎上提出了精準施藥建議，為促進加州鱸養殖業綠色健康持續發展提供了數據支撐。

1 材料與方法

1.1 供試菌株的分離鑒定

加州鱸采樣點設2處，采樣點1為山東泰豐鴻基農業科技開發有限公司，采樣點2為茌平潤生養殖專業合作社。2021年5—10月，從加州鱸采樣點盡量采集具有典型癥狀的病魚試驗樣品，無病癥時采集健康魚例行檢驗，每月每個采樣點各采集樣品4尾，累計采樣6次，共計48尾。用75%乙醇棉球擦拭魚體后，用滅菌剪刀于肛門前端剪入，分離內臟器官，選取腹水以及心、肝、腎、脾等組織或器官，用滅菌雙蒸水清洗表面后，劃線接種于NA培養基平板上，培養溫度為28～35℃。24～28 h后觀察菌落生長情況，挑取優勢單菌落劃線提純培養。純化后的菌落，一份用于藥敏試驗，一份寄至上海海洋大學測序鑒定，同時甘油保種備用。

1.2 供試藥物

1.3 供試菌株最小抑菌濃度的測定

挑取純化后的單菌落,制備成0.5麥氏單位濃度的菌懸液；在陰性和陽性對照孔中，分別加入無菌生理鹽水和0.005麥氏單位濃度的標準大腸埃希菌懸液各200μL；96孔藥敏微孔板中加入0.005麥氏單位濃度的病原菌菌懸液200μL；持平微孔板，輕微搖晃使之均勻，于（28±1）℃培養，24～28 h后觀察并記錄菌株生長情況，以抑制菌株生長的最高稀釋度作為該菌株測試藥物的最小抑菌濃度（MIC）。

1.4 數據統計方法

根據美國臨床實驗室標準化研究所（CLSI）發布的藥物敏感性及耐藥性標準，對菌株耐藥性進行判別，判別標準如下。

（1）恩諾沙星：敏感，ρ（MIC）≤0.5 mg/L；耐藥，ρ（MIC）≥4 mg/L。

（2）鹽酸多西環素、氟甲喹：敏感，ρ（MIC）≤4 mg/L；中敏，ρ（MIC）=8 mg/L；耐藥，ρ（MIC）≥16 mg/L。

（3）氟苯尼考、甲砜霉素、硫酸新霉素：敏感，ρ（MIC）≤2 mg/L；中敏，ρ（MIC）=4 mg/L；耐藥，ρ（MIC）≥8 mg/L。

（5）磺胺間甲氧嘧啶鈉：敏感，ρ（MIC）≤256 mg/L；耐藥，ρ（MIC）≥512 mg/L。

應用SPSS軟件，統計各供試菌株試驗結果。本試驗MIC為抑制90%受試菌株生長所需的最小抑菌濃度，菌株耐藥率計算公式如下：

式中：S為菌株耐藥率，%；N為耐藥菌株數量，個；N為菌株總數，個。

2 結果與分析

2.1 養殖場病害、藥物使用及損失情況

5—10月，采樣單位發病率低于1%。發病加州鱸體表多為點狀出血、潰瘍、腸炎等，解剖后，鱸花肝、腸道空。發現患病個體立即撈出隔離，死亡個體采用無害化處理方法，定期施用微生態制劑作為預防性用藥。全年未發生因病致損的情況。

2.2 病原菌分離鑒定結果

累計采集48尾加州鱸，共分離純化出病原菌13株（表1），其中維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）4株（30.77%）；弧菌（Vibrio）3株，包括創傷弧菌（Vibrio vulnificus）2株（15.38%）和納瓦拉弧菌（Vibrio navarrensis）1株（7.69%）；希瓦氏菌（Shewanella）2株（15.38%）；金色微菌（Chryseomicrobium）1株（7.69%）；檸檬酸桿菌（Citrobacter）1株（7.69%）；沃氏葡萄球菌（Staphylococcus warneri）1株（7.69%）；深海微小桿菌（Exiguobacterium profundum）1株（7.69%）。

表1 加州鱸采樣及病原菌情況

2.3 菌株對抗菌藥物的感受性

表2 病原菌對各抗菌藥物的感受性分布（n=13）

表3 維氏氣單胞菌對各抗菌藥物的感受性分布（n=4）

2.4 菌株耐藥率

根據各菌株對藥物的耐受性結果，以CLSI相關標準為判定依據，對分離菌株的耐藥性進行統計。

表4 弧菌屬菌株對各抗菌藥物的感受性分布（n=3）

圖1 菌株對抗菌藥物的耐藥性

3 用藥建議

由試驗結果可知，加州鱸所有致病菌株對硫酸新霉素均為敏感或中敏，該水產用抗菌藥可以作為周邊地區常見和新發細菌性疾病的首選備用藥物。但硫酸新霉素藥餌進入腸道后不被吸收，多用于腸道疾病治療。養殖中，可用恩諾沙星或鹽酸多西環素治療由氣單胞菌引起的細菌性敗血癥等疾病，用恩諾沙星或氟苯尼考治療由弧菌引起的體表潰瘍性疾病。此外，建議日常定期使用三黃散、維生素C等保肝護肝藥物拌料投喂加州鱸，以預防養殖疾??；定期施用微生態制劑調節水質，如發生病害可根據試驗結果用藥。

上述數據局限于山東地區的2個采樣點，盡管分離到的菌株有一定的耐藥率，但不能代表山東地區的整體情況，應廣泛采集養殖區域樣本以進行深入研究。