長江中下游地區粳稻稻瘟病基因型與苗瘟抗性分析

周坤能 張彩娟, 夏加發 王元壘 云 鵬 馬廷臣 吳德祥 李澤福,*

(1 安徽省農業科學院水稻研究所/安徽省水稻遺傳育種重點實驗室，安徽 合肥 230031；2 安徽農業大學農學院，安徽 合肥 230036)

稻瘟病是水稻主要病害之一，每年發生嚴重，導致水稻減產，甚至絕收[1-2]。目前能夠有效防治稻瘟病的方法有兩種：化學防治和抗病品種選育[3-4]。在種植稻瘟病抗性較好的品種基礎上，結合化學防治方法，可以有效降低稻瘟病危害；選擇稻瘟病抗性好的水稻品種可以減少化學藥劑的使用，減少農藥污染，與水稻產業的綠色高質量發展相輔相成。因此，選育抗稻瘟病水稻品種具有重要意義，發掘和利用稻瘟病抗性基因和資源更是相關研究的前提[5-7]。

目前已經在水稻中鑒定出100多個稻瘟病抗性基因位點，其中35個基因被克隆[8]。這些基因之間的抗病性存在較大差異，且部分基因在水稻資源中出現頻率低，育種利用效率低[9-11]；一些廣譜持久抗稻瘟病及適宜特定生態區的基因已被廣泛用于育種實踐[12-14]。不同種植區域水稻中蘊含的稻瘟病抗性基因不同，其中Pikh、Pi9和Pish對廣東稻瘟病菌表現廣譜抗性[15]；Pita、Pib、Pi54和Pikm對江蘇稻瘟病菌表現廣譜抗性[16]；Pib、Pi54和Pikm對山東和黃淮區稻瘟病菌表現廣譜抗性[17]。通過分子標記輔助聚合抗性基因對水稻稻瘟病抗性育種具有重要指導意義。前人研究發現，通過分子聚合Pi9和Pi49位點能夠提高水稻兩系不育系創5S的稻瘟病抗性[18]；通過分子標記分別將Pi1、Pi2、Pi33、Pigm等基因轉入空育131等粳稻品種中，能夠顯著提高受體材料的稻瘟病抗性[19-20]；將廣譜抗稻瘟病基因Pi9導入水稻不育系豐源A中，其抗性頻率增加2.5倍以上[21]。近期研究表明，Pita、Pib、Pi5和Pi9基因對遼寧和天津地區稻瘟病抗性能力較強[22]。長三角地區粳稻攜帶Pita、Pi5、Pi2和Pikm基因的水稻種質抗病性增加[23]。王小秋等[24]通過對江蘇育成粳稻品種的稻瘟病抗性基因和穗頸瘟抗性之間的關系進行研究，表明Pia、Pi5和Pita對穗頸瘟的抗性有顯著貢獻，Pigm及基因組合“Pia+Pita”在江蘇粳稻育種中有重要利用價值。

稻瘟病生理小種容易發生變異，不同區域的稻瘟病菌優勢種群和優勢生理小種差異顯著[25-26]。安徽省水稻生產應用的多數品種稻瘟病抗性不強，稻瘟病育種研究進展較為緩慢。對近5年安徽育成品種進行稻瘟病抗性統計，發現達到抗病水平的品種比例較低(平均為5.5%)。前人通過人工接種和自然誘發鑒定分析苗瘟、葉瘟和穗頸瘟之間的關系發現，上述三者之間存在顯著正相關，因此，可以根據苗瘟抗性鑒定結果推測穗頸瘟的抗性[27-28]。同時稻瘟病鑒定研究發現，粳稻稻瘟病抗性復雜多變，不同區域間差異較大[22-24]，稻瘟病抗性與基因之間的關系不夠明確，依靠單個或多個抗性基因提高品種抗性的目的性不強。鑒于此，本研究利用12個稻瘟病抗性基因分子標記對153份長江中下游地區審定的品種或參加中間試驗的粳稻材料進行基因型分析，旨在明確稻瘟病抗性基因分布；并結合稻瘟病苗期人工接種鑒定，分析抗性基因與苗瘟之間的關系，評估單個基因或多基因組合的抗性，以期指導安徽粳稻品種的稻瘟病抗性育種。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

用于稻瘟病抗性鑒定的粳稻材料153份，包括安徽、江蘇、浙江、山東、湖北、上海近年育成的61個粳稻品種(品系)和92份安徽省近幾年參試品種(附表1)，以原豐早和麗江新團黑谷(LTH)為苗瘟鑒定的感病對照。12個稻瘟病基因分子檢測的陰性和陽性對照分別為Pita(LTH和武育粳27)、Pib(LTH和武育粳24)、Pikm(日本晴和揚粳4227)、Pi54(南粳9108和寧粳8號)、Pid2(LTH和地谷)、Pid3(LTH和地谷)、Pi5(LTH和鎮稻88)、Pi25(LTH和地谷)、Pik(LTH和潤稻118)、Pia(LTH和鎮稻14)、Pb1(日本晴和鎮稻18)和Pizt(南粳9108和武運粳21)。供試材料于安徽省農業科學院水稻研究所種質資源庫保存。

1.2 稻瘟病抗性基因功能標記

本研究對Pita、Pib、Pikm、Pi54、Pid2、Pid3、Pi5、Pi25、Pik、Pia、Pb1和Pizt共12個稻瘟病抗性基因進行分子鑒定，所用引物參照文獻[5,16,24]。引物由通用生物系統(安徽)有限公司合成。稻瘟病抗性基因Pita、Pib和Pikm分別由兩對分子標記共同鑒定，Pi54、Pi5和Pia根據分子標記的多態性進行基因鑒定，Pi25、Pid2和Pid3基因擴增后分別利用NdeI、MIuI和BamHI內切酶進行酶切反應后鑒定抗性基因，Pik、Pb1和Pizt根據擴增條帶的有無進行基因鑒定。

1.3 PCR檢測及酶切反應

DNA提取采用十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethyl ammonium bromide,CTAB)法：將樣品裝入96孔板，磨樣機研磨成粉，加入200 μL 2×CTAB溶液[1 mol·L-1Tris-HCl (pH值8.0) 100 mL，0.5 mol·L-1EDTA (pH值8.0) 40 mL，NaCl 81.9 g，CTAB 20 g，加ddH2O定容至1 000 mL，高溫滅菌]，混勻，65℃水浴30 min，加入100 μL氯仿搖晃5 min后，1 500 r·min-1離心10 min，吸取100 μL上清至PCR板中，加入70 μL異丙醇，混勻，-20℃放置1 h，3 000 r·min-1離心15 min，去上清，沉淀用75%乙醇洗滌，通風晾干后，加入50 μL ddH2O溶解，4℃保存備用。

Pia、Pb1和Pizt基因的鑒定由聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，其他基因由瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR反應體系為10 μL：10×PCR Buffer 1.0 μL，25 mmol·L-1MgCl20.6 μL，1 mmol·L-1dNTPs 0.3 μL，前后引物各0.5 μL，Taq酶0.1 μL，DNA模板20～50 ng，補ddH2O至10 μL。PCR反應程序：95℃預變性4 min，95℃變性30 s，退火30 s(退火溫度視引物而定)，72℃延伸 1 min，35個循環；72℃延伸 5 min，4℃保存備用。酶切反應體系：PCR擴增DNA產物≤0.5 μg，內切酶0.5 μL，10×buffer 1 μL，補ddH2O至10 μL；酶切反應程序：將酶切反應體系放置于PCR儀中37℃酶切30 min。

1.4 稻瘟病人工接種鑒定

人工接種所用的稻瘟病菌由安徽省農業科學院植物保護與農產品質量安全研究所提供，為安徽省稻瘟病優勢小種ZB13、ZB15、ZA1和安徽省金寨縣、休寧縣、潛山縣等重發地區稻瘟病菌混合菌株。稻瘟病優勢小種培養：取馬鈴薯200 g，去皮切成2 cm左右小塊，加入適量ddH2O煮20 min，過濾至1 000 mL容量瓶，在濾液中加入20 g蔗糖，18 g瓊脂，邊加邊攪拌溶解，加ddH2O定容至1 000 mL，過濾后用100 mL錐形瓶分裝，封口后121℃條件下5 min高溫滅菌。將安徽省優勢稻瘟病生理小種接入上述培養基中，28℃條件下黑暗培養3 d，挑菌落于滅菌大麥中培養8～10 d，待菌絲長出后，用ddH2O洗脫菌落，顯微鏡觀察菌落濃度，10×10倍鏡下每視野20～50個分生孢子為宜。

接種鑒定：將待接種的水稻材料浸種催芽，播于秧盤，3次重復；幼苗生長至3～4葉期，于傍晚開始接種，利用噴霧器裝置對幼苗進行噴霧接種，使菌液呈水珠狀落于幼苗葉片上，遮光保濕24 h后，每1 h噴水2 min保濕。7～10 d后按照《NY/T 2646-2014水稻品種試驗稻瘟病抗性鑒定與評價技術規程》[29]觀察記載稻瘟病發病情況，3次重復以感病最嚴重為鑒定結果。

1.5 數據分析

稻瘟病抗性等級、抗感品種分布等數據利用Excel 2010軟件進行整理和作圖。材料抗性與稻瘟病抗性基因之間的關聯分析利用SPSS 12.0完成。將稻瘟病抗性分成2個等級，5級以下(包括5級)為抗，定義為1；5級以上為不抗，定義為2，對抗性等級進行單基因邏輯回歸分析，根據P值確定基因對抗性的貢獻是否在P<0.05水平顯著。

2 結果與分析

2.1 稻瘟病抗性基因分子檢測

利用12個稻瘟病抗性基因分子標記對部分供試材料、陰性和陽性對照進行擴增，以鑒定供試材料中稻瘟病基因型。結果顯示，12個稻瘟病基因的分子標記能夠有效區分是否攜帶對應的稻瘟病抗性基因。Pita、Pib和Pikm基因分別利用2個功能標記同時檢測鑒定其基因型；Pi54、Pia和Pi5基因根據片段的大小鑒定基因型；Pid2、Pid3和Pi25基因擴增后利用相應的內切酶進行酶切鑒定；Pb1、Pik和Pizt基因則根據是否擴增出目的片段鑒定。攜帶和未攜帶抗性基因如圖1所示。

注：M代表DNA標記；(+)代表抗病品種；(-)代表感病品種。Note: M indicates DNA marker. (+) and (-) represent disease-resistant and susceptible varieties,respectively.圖1 稻瘟病抗性基因分子檢測Fig.1 Molecular detection of rice blast resistance genes

2.2 供試材料中稻瘟病抗性基因分布

利用上述12個稻瘟病功能標記對153份粳稻品種進行基因型分析，結果發現其中11個抗性基因在供試材料中都有不同程度的分布，但未發現Pi25抗性基因的存在(圖2)。Pib基因在供試材料中占比最高，達到77.12%，其次為Pita、Pi54和Pb1，分別達到41.83%、36.60%和36.60%，Pikm、Pik、Pia、Pid3、Pi5、Pid2和Pizt基因出現頻率在11.76%～24.18%之間。

圖2 稻瘟病抗性基因在供試材料中的分布頻率Fig.2 Distribution frequency of resistance genes in tested materials

2.3 稻瘟病苗瘟接種鑒定

利用安徽省不同生態區的稻瘟病優勢生理小種混合菌株對153份供試材料和陰性對照(原豐早和麗江新團黑谷)進行苗期人工接種鑒定。鑒定結果發現，材料稻瘟病抗感性狀差異顯著，能夠明確區分稻瘟病抗性等級(圖3-A～C)。對照品種麗江新團黑谷苗瘟等級為9級，原豐早為8級，說明鑒定結果準確可靠(圖3-D、E)。根據稻瘟病苗瘟病斑大小和發病面積對供試材料進行記錄整理(圖3-F)。

注：A～C：抗病材料和感病材料的表現；D、E：麗江新團黑谷和原豐早苗瘟接種表型；F：苗瘟病級劃分，1～9為苗瘟病級。Note: A～C: Phenotype of disease-resistant materials and susceptible materials. D,E: Phenotype of seedling blast of LTH and Yuanfengzao. F: Classification of seedling blast,1～9 indicates seedling blast grade.圖3 苗瘟人工接種鑒定表型Fig.3 Phenotype of seedling blast by artificial inoculation

2.4 供試材料苗瘟抗性分析和抗性資源篩選

根據安徽省稻瘟病苗瘟分級標準對供試材料進行抗性分析，結果顯示153份材料中，抗病(0

圖4 153份粳稻材料苗瘟抗性分析Fig.4 Resistance analysis of seedling blast in 153 japonica rice materials

2.5 稻瘟病抗性基因與苗瘟之間的關系

稻瘟病抗性基因分析結果發現，153份供試材料中有5份材料不含有檢測的任何抗性基因，少數材料含有7～8個基因，具有2～5個抗性基因的品種最多(圖5-A)。進一步通過關聯分析鑒定攜帶的抗病基因數目與苗瘟抗性之間的相關性，結果表明隨著基因數目增加，苗瘟抗性略有提高，但未達到顯著水平(P=0.16)(圖5-B)，說明稻瘟病抗性與含有的抗性基因數目無顯著相關性。

圖5 粳稻材料中稻瘟病抗性基因數分布(A)和品種攜帶抗病基因數與病級間的關系分析(B)Fig.5 Distribution of gene number carried by tested varieties (A) and correlation analysis of the resistance gene number and disease grade (B)

圖6 稻瘟病單個基因平均抗性(A)及其回歸分析(B)Fig.6 Average resistance of single gene to rice blast (A) and its logistic regression analysis (B)

抗病性分析表明含有Pi5基因的品種平均抗性最好，病級為4.86，其次為Pia，病級為4.90，然后依次為Pizt(4.94)、Pikm(5.05)、Pik(5.14)等(圖6-A)。單基因回歸分析結果表明，檢測的稻瘟病抗性基因均能夠不同程度地增加稻瘟病抗性，但達到顯著水平的只有Pi5(P=0.01)和Pia(P=0.04)(圖6-B)。

2.6 優異稻瘟病抗性基因組合

為探索提高水稻稻瘟病抗性的基因或基因組合，本研究分析了含有單個基因或多個基因的品種稻瘟病抗病性，結果如圖7所示。Pita/-基因組合平均病級為6.12，Pi5/-基因組合平均病級為5.00，Pia/-基因組合平均病級為4.91；在Pi5/-基因組合中加入Pita基因后病級為5.50，在Pia/-基因組合中加入Pita基因后病級為4.92，表明Pita不能增加Pi5/-和Pia/-基因組合的抗病性；Pia與Pi5組成的基因組合Pia/Pi5/-病級為3.75，稻瘟病抗性增加；同時發現，2個品種中含有Pia/Pi5/Pik/Pikm/-基因組合，其病級為2.50，明顯優于Pia/Pi5/-基因組合，說明Pik和Pikm基因可能增加Pia/Pi5/-基因組合的抗病性。此外，還發現4個品種中含有Pita/Pik/Pikm/Pb1/-基因組合亦表現出較好的抗病性，平均病級為4.25。

注：- 表示不帶有相應的抗病基因。Note: - means the absence of the specific resistance gene.圖7 不同稻瘟病基因組合的抗性分析Fig.7 Resistance analysis of different rice blast gene combinations

3 討論

稻瘟病生理小種復雜多變，解析稻瘟病抗性基因與稻瘟病之間的關系對指導水稻抗性育種以及品種推廣具有重要意義[24,30]。本研究通過對153份粳稻品種(品系)進行稻瘟病苗期人工接種鑒定，發現中抗以上(≤4級)材料比例較低，為24.84%；中感材料(4

通過對153份粳稻材料的12個稻瘟病基因型分析發現，不含抗性基因的材料有5份，同時含有7和8個抗性基因的材料各1份，90%以上的材料含有2～6個抗性基因。關聯分析發現攜帶的抗病基因數與苗瘟抗性之間無顯著相關性。不含抗性基因的5份材料中只有1份為8級感病，另外4份材料為4～6級中感；含有7和8個抗性基因的材料苗瘟等級分別為6和7級，不能達到中抗以上水平，這與關聯分析結果一致。通過對單個基因與苗瘟之間的抗性進行分析，發現Pid3、Pik、Pi5、Pikm、Pia和Pizt基因能夠提高苗瘟抗性，但達到顯著水平的只有Pi5和Pia，說明依靠單個抗性基因很難解決粳稻苗瘟的抗病問題。此外，本研究發現含有相同抗性基因的材料苗瘟抗性存在差異，如品種鎮糯20含有Pita、Pib和Pi54基因，苗瘟抗性為6級，含有相同基因的糯稻品系苗瘟為9級；秀水121含有Pita、Pib、Pik和Pikm基因，苗瘟抗性為2級，同樣含有相同基因的水稻品系苗瘟為5級。推測這可能與材料的背景有關，或有其他稻瘟病基因參與調控。

稻瘟病生理小種變異快，水稻品種的抗性在種植幾年后即喪失，新的廣譜抗性基因不能被充分利用。王軍等[16]通過分析江蘇省粳稻品種抗稻瘟病基因型與穗頸瘟抗性關系，發現Pita、Pib、Pi54和Pikm對江蘇稻瘟病菌表現廣譜抗性；然而，王小秋等[24]研究結果表明，Pita和Pib在江蘇粳稻品種中的比例均超過50%，但在稻瘟病抗性5級以下品種中的比例不足30%。同時有研究發現，“Pita+Pi5”以及“Pita+Pia”基因組合能夠顯著增加江蘇粳稻材料的稻瘟病抗性[24]。這與本研究結果有所不同，本研究發現Pita不能顯著增加Pi5/-和Pia/-基因組合的抗病性(圖7)，這可能由于安徽和江蘇地區稻瘟病生理小種有所差異。本研究發現，含有“Pia+Pi5”基因組合的品種苗瘟抗性明顯較好；在“Pia+Pi5”基因組合的基礎上加入Pik和Pikm基因，苗瘟抗性更好。此外，含有“Pita+Pik+Pikm+Pb1”基因的材料也具有較好的苗瘟抗性。這些研究表明，“Pia+Pi5”、“Pia+Pi5+Pik+Pikm”和“Pita+Pik+Pikm+Pb1”基因組合對安徽稻瘟病生理小種抗性較好。通過檢測，未在供試材料中發現廣譜抗稻瘟病基因Pigm，將該基因導入粳稻品種中可能對提高抗病性有重要作用[24,31]。以上研究結果為安徽粳稻品種稻瘟病抗性改良提供參考依據，并為下一步研究稻瘟病基因型與穗頸瘟抗性關系奠定了理論基礎。

4 結論

本研究通過分析153份粳稻材料中的稻瘟病基因型，及其與安徽稻瘟病優勢混合生理小種的關系，發現Pi5和Pia基因對苗瘟抗性貢獻較顯著，“Pi5+Pia”基因組合抗性高于Pi5和Pia單個基因，在“Pi5+Pia”基因組合基礎上，加入Pik和Pikm基因，抗性再次增加，此外，“Pita+Pik+Pikm+Pb1”基因組合對安徽稻瘟病生理小種亦有較好的抗性。

附表1 供試材料清單Table S1 Materials list

附表1(續)

附表1(續)