Tnfrsf11aCre介導黃色熒光素蛋白有效標記腦小膠質細胞

楊鳳嬌，黃紫薇，趙殿元，徐 龍，唐 麗

巨噬細胞是一種廣泛分布于全身組織的免疫細胞，在機體的免疫防御、免疫自穩和免疫監視中發揮重要作用[1]。研究[2]表明，腦小膠質細胞來源于卵黃囊巨噬細胞，其他大部分組織定居巨噬細胞主要來源于卵黃囊巨噬細胞和胎肝單核細胞。這些前體細胞進入組織器官后，逐漸分化為成熟的組織定居巨噬細胞。生理狀態下，大部分的組織定居巨噬細胞可以通過自我更新維持其穩態[3]。腦小膠質細胞是一種存在于腦與脊髓中的巨噬細胞，約占腦細胞數量的10%～15%，對維持中樞神經系統的正常功能起重要作用，它們能清除中樞神經系統中的神經炎性斑、病原體以及損傷后無功能的神經元與軸突。為了對腦小膠質細胞的發育、穩態維持及功能進行進一步探索，該研究致力于構建有效的腦小膠質細胞條件性敲除小鼠模型。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物Tnfrsf11aCre小鼠購自北京百奧賽圖基因生物技術有限公司，Rosa26yfp小鼠購自美國Jackson實驗室。小鼠均飼養于軍事醫學研究院生命組學研究所SPF級動物房。

1.1.2主要儀器 LSRFortessa SORP 流式細胞分析儀(美國BD公司)，2720 Thermal Cycler PCR儀、PowerPacTM HC凝膠電泳儀、凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)，留置針 (美國BD公司)。

1.1.3主要試劑 0.05 mol EGTA 貯存液(美國Amerso公司)、0.5 mol CaCl2貯存液(北京索萊寶科技有限公司)、肝素鈉 (廣州賽博生物科技公司)、 RPMI-1640 培養基(美國Hyclone公司)、Collagenase IV (德國Sigma公司)、脫氧核糖核酸酶 I (德國Sigma公司)、OptiprepTM(德國Serumwerk Bernburg AG公司)、Percoll (美國GE Healthcare公司)、紅細胞裂解液 (美國BD公司)、基因組提取試劑(成都福際生物技術有限公司)；PCR 引物(北京六合華大基因科技有限公司)，序列見表1。CD45 (30-F11,美國Tonbo公司)、 Ly6C (HK1.4，美國Thermo Fisher Scientific公司)、F4/80 (BM8，美國Thermo Fisher Scientific公司 )、CD64 (x54-5/7.1，美國Biolegend 公司)、CD11b (M1/70，美國Tonbo公司)、CD11c (N418，美國Thermo Fisher Scientific公司)、SiglecF (E50-2440，美國BD公司)、DAPI (美國Tonbo公司)。

表1 Tnfrsf11aCre基因和Rosa26yfp基因PCR序列

1.2 方法

1.2.1Tnfrsf11aCreRosa26yfp小鼠的繁殖分籠與鑒定Tnfrsf11aCre小鼠與Rosa26yfp小鼠交配，得到的子代在2周齡時剪腳趾編號，加入50 μl 基因組提取試劑，混勻，55 ℃烘箱過夜，提取基因組。PCR鑒定小鼠基因型，反應體系：2 μl引物、2 μl蒸餾水、2 μl鼠尾DNA模板、6 μl Mix； 反應條件：Tnfrsf11aCre反應條件為94 ℃、2 min；94 ℃、20 s，65 ℃ (每循環數降0.5 ℃)、15 s，68 ℃、20 s，11個循環數；94 ℃、15 s，60 ℃、15 s，72 ℃、30 s，28個循環數；72 ℃、2 min。Rosa26yfp反應條件為94 ℃、2 min；94 ℃、20 s，65 ℃、80 s，72 ℃、1 min；94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、1 min，35個循環數；72 ℃，2 min。配制2.5%的瓊脂糖凝膠，待PCR反應結束后，將得到的PCR產物點樣置于2.5%瓊脂糖凝膠進行電泳，并用凝膠成像儀進行拍照記錄。將PCR鑒定得到的Tnfrsf11aCreRosa26yfp小鼠及其同窩對照Tnfrsf11aCre小鼠與Rosa26yfp小鼠留下，3周齡時分籠處理，8周齡時即可用作實驗。

1.2.2肝臟、腦、脾臟、肺泡、腎臟巨噬細胞的分離 500 μl/只1.2% 三溴乙醇(德國Sigma)，腹腔注射麻醉小鼠。小鼠麻醉后，乙醇消毒，并將小鼠固定于解剖臺，打開腹腔，輕輕撥動內臟，使小鼠肝門靜脈暴露，留置針穿刺肝門靜脈，從肝門靜脈依次灌注含有 0.25 mmol EDTA、5 mmol D-glucose、0.665 mmol肝素鈉的I 灌液 (NaCl 0.137 μmol、 NaH2PO4·2H2O 438.226 μmol、Na2HPO4.7H2O 753.733 μmol、KCl 5.298 mmol、Hepes 9.059 mmol、NaHCO34.199 mmol，pH 7.3)；含有20 U Collagenase IV、0.4 U 脫氧核糖核酸酶的Ⅱ灌液灌注結束后，用眼科鑷取下消化后的肝臟，放入含有 RPMI-1640培養基的100 mm皿中，70 μm 細胞篩網過濾，制成單細胞懸液。4 ℃，53 r/min 離心去除沉淀細胞，4 ℃，530 r/min 離心取沉淀細胞，加入 2 ml OPtiPrepTM， RPMI-1640培養基定量至5 ml，與細胞沉淀混勻后，在上層加入3 ml RPMI-1640培養基；4 ℃，1 166 r/min 離心25 min(升降速 0)，吸出中間層細胞， 4 ℃，530 r/min 離心取沉淀細胞，加入紅細胞裂解液，1 min 后加入 PBE 終止紅裂，4 ℃，530 r/min 離心取沉淀細胞，加入流式Stain Buffer 將沉淀細胞沖懸為單細胞懸液。取腦、腎臟、肺臟，用手術剪碎，加入Ⅱ灌注液，37 ℃體外消化45 min后，70 μm 細胞篩網過濾，制成單細胞懸液；取脾臟用眼科鑷輕輕撕扯，70 μm 細胞篩網過濾；將獲得的脾臟、腎臟、肺臟單細胞懸液4 ℃、530 r/min離心5 min取沉淀細胞，紅裂 3 min 后加入 PBE 終止紅裂，4 ℃，530 r/min 離心取沉淀細胞，加入適量流式Stain Buffer 將沉淀細胞沖懸為單細胞懸液。過濾后的腦組織單細胞懸液4 ℃、636 r/min離心5 min取沉淀細胞，加入37% Percoll定量細胞沉淀至5 ml并混勻，在混勻的細胞沉淀下方加入5 ml 70% Percoll，室溫，636 r/min 離心25 min(升降速 0)，吸出中間透明細胞層，4 ℃，636 r/min 離心取沉淀細胞，加入紅細胞裂解液，1 min 后加入 PBE 終止紅裂，4 ℃，636 r/min 離心取沉淀細胞，加入適量流式Stain Buffer 將沉淀細胞沖懸為單細胞懸液。

1.2.3標記流式抗體并進行流式細胞分析儀檢測 取所獲得各組織單細胞懸液各100 μl，并加入 1 μl Fc Black封閉5 min。不同組織巨噬細胞標記流式抗體： 肝臟巨噬細胞和腎臟巨噬細胞CD45 AF700、 Ly6C Pecy7、F4/80 PE、CD64 Bv421；腦小膠質細胞和脾臟巨噬細胞CD45 AF700、 Ly6C Bv421、F4/80 PE、CD11b-Pecy7；肺泡巨噬細胞CD45 AF700、 CD11c Pecy7、SiglecF Bv421。冰上避光標記30 min后，Stain Buffer洗滌2次；向洗滌后的細胞懸液中加入DAPI染料，冰上避光標記45 min后， Stain Buffer洗滌后沖懸細胞沉淀。流式檢測YFP標記組織巨噬細胞效率。

2 結果

2.1 實驗組與對照組小鼠的基因型鑒定結果Tnfrsf11aCre小鼠與Rosa26yfp小鼠交配獲得的子代小鼠共20只，在子代小鼠2周齡時剪下鼠尾，提取基因組DNA，經PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳后，鑒定出Tnfrsf11aCreRosa26yfp小鼠9只(2、3、4、5、7、11、12、16、18)，同窩對照小鼠Tnfrsf11aCre小鼠4只(8、9、17、20)，Rosa26yfp小鼠7只(1、6、10、13、14、15、19)。Tnfrsf11aCre瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1，已知Tnfrsf11aCrePCR擴增條帶分子量為285 bp；Rosa26yfp瓊脂糖凝膠電泳結果見圖2，已知Rosa26yfpPCR擴增Cre介導的重組片段分子量為327 bp。

圖1 Tnfrsf11aCre小鼠與Rosa26yfp小鼠交配的子代小鼠Tnfrsf11aCre基因PCR瓊脂糖凝膠結果

圖2 Tnfrsf11aCre小鼠與Rosa26yfp小鼠交配的子代小鼠Rosa26yfp基因PCR瓊脂糖凝膠結果

2.2 肝臟、腦、腎臟、脾臟、肺泡巨噬細胞流式分析圈門策略流式細胞分析儀檢測在肝臟、腦、腎臟、脾臟、肺泡巨噬細胞中表達YFP的情況。首先根據FSC-A和SSC-A圈出細胞群，第2步根據FSC-H和FSC-A去除細胞粘連體，第3步根據DAPI標記，去除死細胞，由于巨噬細胞是免疫細胞，均表達CD45，第4步圈出CD45陽性細胞群，接著根據不同組織巨噬細胞特異性表達蛋白，圈出目的細胞群；肝臟巨噬細胞、腦小膠質細胞、腎臟巨噬細胞、脾臟巨噬細胞在CD45陽性細胞群的基礎上，圈出Ly6C陰性細胞群，去除單核細胞干擾，再分別圈出F4/80+CD64+的肝臟巨噬細胞(圖3A)、F4/80intCD11b+的腦小膠質細胞(圖3B)、F4/80+CD64+的腎臟巨噬細胞(圖3C)、F4/80+CD11blow的脾臟巨噬細胞(圖3D)；肺泡巨噬細胞在第4步的基礎上，根據其特異性高表達SiglecF和CD11c，圈出SiglecF+CD11c+的肺泡巨噬細胞(見圖3E)。圈出組織巨噬后，檢測YFP表達情況。

圖3 肝臟、腦、腎臟、脾臟、肺泡巨噬細胞流式分析圈門策略

2.3Tnfrsf11aCre介導熒光素蛋白YFP標記組織巨噬細胞效率對分離的組織單細胞懸液進行流式分析后，計算Tnfrsf11aCreRosa26yfp小鼠及其對照Tnfrsf11aCre和Rosa26yfp小鼠肝臟、腦、腎臟、脾臟、肺泡巨噬細胞中表達YFP的比例，發現對照組Tnfrsf11aCre小鼠和Rosa26yfp小鼠的腦小膠質細胞、腎臟、肝臟、脾臟、肺泡巨噬細胞均不表達YFP，但在實驗組Tnfrsf11aCreRosa26yfp小鼠中，腦小膠質細胞表達YFP為(91.27±3.70)%(圖4A)；腎臟巨噬細胞表達YFP為(86.00±7.02)%(圖4B)；肝臟巨噬細胞表達YFP為(63.60±10.35)%(圖4C)；脾臟巨噬細胞表達YFP為(69.66±10.22)%(圖4D)；肺泡巨噬細胞表達YFP為(32.76±13.35)%(圖4E)。這說明Tnfrsf11aCre介導YFP對腦小膠質細胞具有較高的標記效率，而對肝臟、腎臟、脾臟、肺泡巨噬細胞的標記效率低。

圖4 Tnfrsf11aCre介導熒光素蛋白YFP標記組織巨噬細胞效率

3 討論

Cre/Loxp系統生成的小鼠可提供組織或器官中細胞的信息，是了解組織發育、探索調節細胞命運的機制和疾病發生發展的強有力工具[4]。巨噬細胞是機體免疫系統的重要組成部分，不同組織巨噬細胞對于維持機體穩態發揮著不同的作用。例如，肝臟巨噬細胞通過清除病原體，維持機體免疫細胞穩態[5]；肺泡巨噬細胞通過清除肺泡表面活性物質，維持肺臟的功能穩態[6]；脾臟紅髓巨噬細胞通過吞噬清除衰老的紅細胞，維持脾臟功能穩態[7]；小膠質細胞清除凋亡神經元、介導中樞神經系統損傷和疾病的內源性免疫反應，從而調節神經元數量、發揮神經保護或神經毒作用[8]。因此，探究組織巨噬細胞的發育、穩態維持具有重要的意義。

已有用于研究巨噬細胞的Cre/Loxp工具鼠大都存在一定的缺陷。例如Vav1Cre小鼠存在敲除范圍過于廣泛的問題，不僅能夠敲除巨噬細胞、粒細胞、單核細胞等免疫細胞，還可以敲除部分內皮細胞[9]；Lyz2Cre小鼠不僅可以實現肺泡巨噬細胞等組織巨噬細胞的敲除[10]，還可以敲除粒細胞、單核細胞及部分樹突狀細胞，并且其重組效率不穩定，對腦小膠質細胞的敲除效率很低[11-12]。本研究中，發現Tnfrsf11aCre介導YFP可以有效標記腦小膠質細胞，在不同組織巨噬細胞中，Tnfrsf11aCre介導YFP標記的效率不同可能是因為在不同組織巨噬細胞中Tnfrsf11a的表達豐度不同導致的。

Tnfrsf11a基因編碼的蛋白是TNF受體超家族成員11a，胚胎10.25 d時即在小鼠巨噬細胞前體細胞中表達。鑒于Rosa26基因表達的普遍性，本研究構建了Rosa26靶向載體，插入Loxp-Stop-Loxp-YFP序列。將Tnfrsf11aCre小鼠與Rosa26yfp小鼠交配，獲得的Tnfrsf11aCreRosa26yfp小鼠表達Tnfrsf11a的細胞即表達Cre酶，Cre酶可以識別Stop位點兩端的Loxp位點，并進行切割，切割后表達的Rosa26基因的細胞同時表達YFP蛋白，發出黃色熒光。研究證明Tnfrsf11aCre介導YFP對于腦小膠質細胞具有90%以上的標記效率，而對肝臟、脾臟、肺泡巨噬細胞的標記效率分別只有63.60%、69.66%、32.76%，用來做這些巨噬細胞的報告基因小鼠是遠遠不夠的。因此，Tnfrsf11aCre小鼠可以用做研究腦小膠質細胞發育分化、穩態維持及功能的工具鼠。