鈦表面新型抗菌涂層的生物相容性研究

龐詩夢，夏 榮，李趁趁，余金蘭

種植義齒修復具有成功率高、不損傷鄰牙等優(yōu)點，是替代缺失牙的金標準[1]，被稱為“人類的第三副牙齒”[2]。而鈦基材料本身不具備抗菌性能，若發(fā)生微生物感染，則可能導致種植體周圍疾病，是導致種植失敗的主要因素之一[3]。近年來有學者通過在種植體表面上制備納米粒子涂層以達到抗菌效果[4-5]；Faramarzi et al[6]將米諾環(huán)素與種植體相結合，3個月內種植體周圍牙齦卟啉單胞菌的數量明顯減少；Carinci et al[7]研究了涂覆聚二甲基硅氧烷/葡萄糖酸氯己定(polydimethylsiloxane/chlorhexidine gluconate,PDMS/CHG)內涂層的種植體的抗菌性，結果表明該涂層具有良好抗菌性能，但無法持續(xù)釋放藥物。該研究擬在鈦片表面構筑PDMS/CHG復合涂層，模擬愈合基臺高度光滑的表面，觀察該復合涂層不同濃度下對成纖維細胞的影響，探究涂層的生物相容性，以期為今后在愈合基臺表面構建抗菌涂層提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑醫(yī)用鈦片TA1(寶雞泰宇鑫金屬材料有限公司)；聚二甲基硅氧烷Sylgard 184(美國Dow Corning公司)；葡萄糖酸氯己定溶液(美國Sigma公司)；SU8220冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡(日本株式會社日立制作所)；LSM880激光掃描共聚焦顯微鏡(德國Carl Zeiss公司)；多功能微孔板酶標儀(美國Thermo Fisher公司)；大鼠牙齦成纖維細胞及專用培養(yǎng)基(中國普諾賽生命科技有限公司)；CCK-8試劑盒(中國賽國生物科技有限公司)；AO/EB雙染劑盒(中國貝博生物科技有限公司)；FITC標記鬼筆環(huán)肽(中國索萊寶生物科技有限公司)；DAPI、抗熒光淬滅封片液(上海碧云天生物技術有限公司)。

1.2 涂層的制備將直徑12 mm，厚1 mm的鈦片拋光至7 000目，放入丙酮、無水乙醇和超純水中超聲蕩洗，各30 min，烘干，采用系統(tǒng)抽樣將其隨機分為5組。鈦組：空白對照組；PDMS組：僅用PDMS處理組；C1組：用PDMS和0.2 mg/ml CHG處理組；C2組：用PDMS和0.4 mg/ml CHG處理組；C3組：用PDMS和0.8 mg/ml CHG處理組。

PDMS預聚體和交聯(lián)劑按質量比10 ∶1混合，將PDMS組、C1組、C2組、C3組鈦片放入浸泡，烘干。再將C1組、C2組、C3組鈦片分別放入0.2、0.4、0.8 mg/ml CHG溶液中浸泡，沖洗，烘干，環(huán)氧乙烷滅菌。

各組隨機抽取3枚鈦片，利用掃描電子顯微鏡(scanning electron micrograph,SEM)觀察表面微觀形貌，檢測涂層是否成功涂覆；隨機抽取2枚鈦片的各3個區(qū)域，用X射線能譜儀(energy dispersive spectroscopy,EDS)分析表面元素。

1.3 大鼠牙齦成纖維細胞的準備大鼠牙齦成纖維細胞(rat gingival fibroblasts,RGFs)使用專用培養(yǎng)基培養(yǎng)，傳代至3～5代時進行實驗。將細胞置于5%CO2，95%空氣，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，密度達到80%左右時進行細胞接種。

1.4 細胞骨架染色實驗每組隨機取5枚鈦片分別放入24孔板內，將第3代RGFs按每孔1×104個細胞接種至鈦片表面，放入細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后，棄掉板內舊的培養(yǎng)液，PBS清洗，4%多聚甲醛室溫固定10 min，用0.5% TritonX-100透化處理5 min，加入100 nmol/L FITC標記的鬼筆環(huán)肽工作液染色30 min，再加入DAPI復染細胞核，倒置在載玻片上，激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscope,CLSM)下觀察。

1.5 AO/EB染色實驗每組隨機取5枚鈦片，將細胞按照每孔1×104個細胞接種至鈦片表面，培養(yǎng)24 h后，每孔加入染色緩沖液500 μl，再各加入5 μl AO和5 μl EB，室溫放置10～20 min，CLSM下觀察。

1.6 細胞增殖實驗每組隨機取5枚鈦片，將細胞按照每孔1×104個細胞接種至鈦片表面，培養(yǎng)1、4、7 d后，從各組隨機選取3枚鈦片，每孔加入1 ml新鮮的培養(yǎng)基，并加入100 μl CCK-8試劑，放入37 ℃恒溫箱中孵育4 h，每孔吸取200 μl加入96孔板中，設3個平行重復孔，最后用酶標儀測450 nm處的吸光度(optical density,OD)值。

2 結果

2.1 掃描電子顯微鏡觀察各涂層組鈦片表面掃描電鏡圖見圖1，鈦組表面可看到少量劃痕；PDMS組表面形成了一層有少量裂紋的膜；C1、C2組表面雖形成了均勻的PDMS/CHG膜，但不夠致密；C3組鈦片表面組形成了均勻且致密的PDMS/CHG膜。鈦片表面元素分析見圖2，A～C、D～F分別為2枚鈦片不同區(qū)域，結果顯示同1枚鈦片各區(qū)域均含有Cl元素，且含量大致相等，證明PDMS/CHG涂層涂覆成功。

圖2 鈦片表面EDS分析圖

2.2 細胞骨架染色結果細胞接種12 h后，在CLSM下觀察各組鈦片表面細胞骨架的形態(tài)。各組細胞沿著各個方向伸展，均勻鋪開，周圍見偽足伸出，見圖3。

圖3 CLSM下各組鈦片表面細胞骨架染色圖像 ×40 oil

2.3 AO/EB實驗結果細胞接種24 h后，AO/EB染色，在CLSM下觀察各組鈦片表面細胞情況。各組都有大量綠色熒光，僅可看到極少數紅色熒光，見圖4。

圖4 各組鈦片表面活死細胞情況 ×200

2.4 細胞增殖結果各組鈦片表面細胞培養(yǎng)1、4、7 d，隨著時間推移，各組OD值都在逐漸增加，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖5。

圖5 各組鈦片表面細胞增殖情況

3 討論

當種植修復日漸成為人們心中的最佳修復方式，種植體周圍疾病也得到了學者們的極大關注，它包括種植體周圍黏膜炎和種植體周圍炎。由于在種植修復過程中細菌的繁殖是不可避免的，而細菌負荷又是導致種植體周圍炎的重要因素，最終甚至會出現種植體松動、移位、脫落等。基臺和種植體之間的間隙較易滋生病原菌[7]，因此預防種植體和基臺連接處微生物感染是維持種植體長期穩(wěn)定的關鍵[8-11]。

近年來，學者致力于種植體表面抗菌涂層的研究，但部分抗菌涂層生物相容性通常較差，甚至可能存在細胞毒性并導致內臟器官損傷[12]。由于CHG具有類似于抗生素的特性，且不易導致細菌耐藥，在口腔診療中廣泛應用。除此之外，CHG能殺滅真菌和細菌，但不能破壞孢子或分歧桿菌，在較低濃度下，CHG可以引起革蘭陽性菌和革蘭陰性菌細胞內鉀離子和戊糖的釋放，達到殺菌的目的，而濃度較高的CHG會導致細菌細胞壁形成不可逆的損傷，因此本研究選用CHG作為抗菌成分，探究其不同濃度的生物相容性。PDMS涂層是一種新型的涂層，是一種疏水類有機硅物料，在藥品、日化用品、食品、建筑等各領域均有應用。PDMS通過聚硅氧烷鏈和鈦表面的-OH官能團的相互作用與鈦表面結合，硅氧烷則可通過范德華力捕獲CHG分子，使它們在與水介質接觸后緩慢釋放[13]。Lauritano et al[13]報道內腔涂覆PDMS/CHG涂層的種植體能有效抑菌，結果顯示，48 h內僅有0.3%的細菌污染種植體-基臺連接處的外表面。

本研究采用PDMS與CHG結合的方式制備PDMS/CHG復合涂層，利用AO/EB活死細胞染色試劑盒和CCK-8試劑盒檢測活死和增殖情況，結果表明實驗所選各濃度的CHG均呈現良好的增殖效果和活死比例，說明CHG濃度不超過0.8 mg/ml的PDMS/CHG不會抑制細胞的生長。隨后利用FITC標記的鬼筆環(huán)肽對細胞骨架進行染色，結果顯示，各組鈦片表面細胞在共聚焦顯微鏡下伸展形態(tài)良好，細胞骨架清晰，呈梭形，且有偽足伸出。提示PDMS/CHG在CHG濃度不超過0.8 mg/ml時，具有良好的生物相容性。

本研究使用高度拋光的鈦片模擬了愈合基臺表面光滑的形態(tài)。在臨床應用過程中，可將該涂層制備在愈合基臺上，在不破壞種植體表面結構的前提下，達到抗菌的目的，且在復診過程中可隨時更換，降低了成本，節(jié)省了時間，并且方便后續(xù)滅菌和使用。相較于之前研究中將復合涂層涂覆于植體內腔的方案，減少了試劑對種植體本身的損害，不僅解決了內腔涂層無法使藥物釋放達到最佳濃度的問題，同時由于本涂層在愈合基臺外表面，種植體-基臺連接處間隙也不會因此增大而使細菌更容易定植。

本研究有一定的局限性，僅選用成纖維細胞進行實驗，而牙周組織是由多種不同的細胞、纖維共同形成的，因此，后續(xù)會進一步對其他細胞的相容性進行研究，并模擬口腔內狀態(tài)，以得到更加全面的理論支持；擬進行動物實驗，探究該涂層的抗菌性及生物相容性，為體內實驗提供依據；同時也需將涂層的制備工序進一步優(yōu)化，使得涂層更加穩(wěn)定和有效。

種植體抗菌涂層的研究進展迅速，在預防種植體周圍疾病方面有重要意義，前景廣闊，但由于大部分研究都停留在體外實驗和動物實驗階段，因此，尚需要更多的基礎及臨床研究來推動這一技術的發(fā)展。