石斛多糖DOP-1-1的制備及其體外促進骨形成的機制

申雄成，蔡小軍，董革輝，黃家愷，張晗祥，何 斌

骨質疏松癥是一種慢性代謝性骨病，主要發生于絕經后婦女和老年人，嚴重威脅公眾健康[1]。目前，預防和治療骨質疏松的臨床藥物大部分副作用嚴重[2]。因此，有必要開發出有效且副作用較小的治療骨質疏松癥藥物。近年來，多糖作為一種具有巨大結構多樣性和廣泛藥理活性的生物大分子，在醫藥界引起了極大的關注[3]。最近研究顯示鐵皮石斛多糖(dendrobium officinale polysaccharides，DOP)抑制破骨細胞相關基因的表達，并抑制RANKL誘導的破骨細胞分化，表明其可能有助于成骨[4]。然而，DOP中確切的生物活性成分仍不清楚。因此，有必要對DOP進行系統研究，包括活性成分提取、純化、結構表征和生物活性分析。該研究通過分離純化DOP得到一種水溶性多糖(DOP-1-1)，并對其結構進行表征，然后體外研究其對小鼠前成骨細胞MC3T3-E1細胞的增殖、分化和礦化作用。

1 材料與方法

1.1 材料與化學試劑鐵皮石斛購自北京同仁堂(集團)有限責任公司；纖維素DEAE-52和Sephadex G-75購自美國GE Healthcare公司；17β-雌二醇(E2)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶、FBS和α-MEM購自美國Gibco BRL公司。使用的所有其他試劑均為分析級。

1.2 石斛粗多糖的提取鐵皮石斛原球莖 (15.0 kg) 用去離子水以1 ∶10的質量比浸泡6 h，并在90 ℃下提取3次，3 h/次。真空過濾后，合并所有提取物，濃縮，加入95%乙醇至終濃度70%沉淀，靜置48 h。以2 000 r/min離心15 min后，獲得沉淀并表示為石斛粗多糖。石斛粗多糖的多糖含量通過苯酚-硫酸法測定。

1.3 DOP-1-1的純化、均一性和分子量測定將石斛粗多糖(1.2 kg)重新溶解在2 L去離子水中，然后移入分液漏斗中，將400 ml Sevag試劑[1-丁醇 ∶三氯甲烷(v/v)=1 ∶4]加入到分液漏斗中并劇烈搖晃。分離和濃縮混合物的上清液，透析(截止相對分子量1 000)并凍干以獲得DOP。將10 ml DOP水溶液(25 mg/ml)加載到DEAE-52-纖維素層析柱(? 2.5×40 cm)上，用去離子水洗脫得到DOP-1。用苯酚-硫酸法得到洗脫曲線。濃縮后，將主要部分進一步加載到Sephadex G-75凝膠柱(? 1.6×100 cm)上，用蒸餾水洗脫得到DOP-1-1，得率為17.2%，多糖含量為81.4%。

在配備Waters 2414示差折光檢測器(美國Waters公司)的Agilent 1260 HPLC系統(美國Agilent公司)上通過高效凝膠滲透色譜法 (HPGPC) 測量DOP-1-1的均勻性和分子量。使用TSK-GEL G-5000PWXL凝膠柱(日本Tosoh Biosep公司)，雙蒸水作為流動相，流速為0.4 ml/min。使用葡聚糖T系列標準品(葡聚糖T400、T300、T200、T125、T45、T20、T10和T5)繪制標準曲線，用于計算DOP-1-1的相對分子量。

1.4 DOP-1-1的化學結構分析將干燥的KBr(140 mg)和DOP-1-1 (2 mg) 的混合物研磨并壓成顆粒。使用FT-IR光譜儀記錄DOP-1-1在4 000～400 cm-1波數范圍內紅外光譜圖。

DOP-1-1(5 mg)在2 ml三氟乙酸(3 mol/L)中120 ℃水解6 h，釋放單糖成分，減壓蒸發。然后，將水解樣品用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化，并在配備ZORBAX Eclipse XDB C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)的Agilent 1260 HPLC系統進行分析。此外，標準單糖的混合物也進行了類似的處理。

對DOP-1-1進行多次甲基化，直至通過紅外光譜儀檢測到反應產物的羥基伸縮帶消失。將DOP-1-1(8 mg)溶于5 ml二甲基亞砜(DMSO)，然后與DMSO-NaOH溶液(600 mg NaOH溶于5 ml DMSO)混合。隨后，樣品在冰浴中冷卻，緩慢滴加500 μl CH3I，超聲處理0.5 h(3次)。DOP-1-1的甲基化產物在2 ml、3 mol TFA 中于120 ℃水解6 h，在40 ℃下用20 mg硼氫化鈉還原30 min，最后用2 ml吡啶和2 ml乙酸酐在95 ℃下反應1 h，得到部分甲基化的糖醇乙酸酯，最后在GC-MS系統(GCMSQP 2010，日本Shimadzu公司)上分析以確定糖苷鍵的類型。

1.5 核磁共振波譜分析DOP-1-1(60 mg)溶解在750 μl D2O中，并以9 000 r/min離心5 min。在Bruker AV-500光譜儀(德國Bremen公司)上進行核磁共振(NMR)光譜分析，1H NMR和13C NMR頻率分別為500 MHz和125 MHz。此外，使用Bruker軟件提供的標準脈沖序列和參數記錄二維(2D)NMR光譜(HSQC和HMBC)。

1.6 DOP-1-1對MC3T3-E1細胞增殖的影響MC3T3-E1細胞接種在常規生長培養基(α-MEM培養基，含有10% FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)，并置于37 ℃、5% CO2加濕培養箱中培養。使用CCK-8試劑盒評估DOP-1-1對MC3T3-E1細胞增殖的影響。將MC3T3-E1細胞稀釋至1×104個/ml，接種到96孔板上并培養24 h，然后加入不同濃度DOP-1-1(0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 μmol/L)，再培養48 h。此外，孔中分別加入或不加入0.1 μmol/L E2作為陽性或空白對照。加入CCK-8(日本Dojindo Kumamoto公司)溶液(10 μl/孔)后，將細胞培養板進一步孵育1 h。最后，用微孔板分光光度計在450 nm處讀取每個孔的吸光度。根據以下公式計算增殖率(W)：W=(Asample-Ablank)/Ablank×100%，其中A是5次重復實驗的平均吸光度。

輔助系統是船舶輪機內部重要構成部分，在進行船舶輪機檢查時，要將該系統作為重點檢查對象，以便在輔助系統正常工作下，為輪機功能發揮提供保障。輔助系統以供給系統為主，能起到儲存和供應油料的作用。待使用的船舶油料可儲存在系統內。在船舶航行過程中，油料經過燃油管道傳輸到船舶，是保證船舶航行任務有效完成的關鍵。這一系統的缺陷，體現在滑油艙缺陷、燃油艙缺陷以及運輸管道缺陷等方面，在檢驗時應加大這方面的檢查，確定缺陷產生原因并提出具體應對措施。例如，當燃油艙和滑油艙之間缺少有效的隔離措施時，這兩種油會混合在一起，從而出現船舶輪機運行故障，不能支持船舶良好航行。

1.7 DOP-1-1對MC3T3-E1細胞分化的影響將MC3T3-E1細胞(1.5×105個/ml)接種在24孔培養板上并培養48 h。然后，將培養基改變為含有常規生長培養基的骨質發生分化培養基(osteogenic differentiation medium，ODM)，其含有10 mmol/L β-甘油磷酸鹽和50 μg/ml抗壞血酸。將細胞分為以下幾組：對照組(僅加入ODM)，陽性對照組(加入含有0.1 μmol/L E2的ODM)，以及不同濃度DOP-1-1處理組(加入含有不同濃度DOP-1-1的ODM)。在第8天，分別使用堿性磷酸酶檢測試劑盒(上海Beyotime公司)和BCA蛋白質定量試劑盒(美國Sigma公司)測定ALP活性和總蛋白質含量，然后將ALP含量標準化。

1.8 DOP-1-1對MC3T3-E1細胞礦化的影響參考文獻方法[5]，監測DOP-1-1對MC3T3-E1細胞鈣化沉積物的影響。將細胞(1.5×105個/ml)接種到12孔培養板上并培養72 h。將細胞分為以下幾組：對照組(僅加入ODM)，陽性對照組(加入含有0.1 μmol/L E2的ODM)，以及不同濃度DOP-1-1處理組(加入含有不同濃度DOP-1-1的ODM)。培養20 d后，用10%福爾馬林固定細胞30 min，并用1.0%茜素紅S染色30 min。將細胞沖洗后，獲得MC3T3-E1細胞的鈣化沉積物的圖像。最后，每個孔加入10%(v/v)氯化十六烷基吡啶鎓，通過微孔板分光光度計在562 nm下檢測吸光度值，以定量鈣化沉積物。

1.9 Western blot測定將MC3T3-E1細胞接種到6孔培養板上(6×104個/ ml)并培養48 h，將培養基替換為ODM。然后用4.0 μmol/L DOP-1-1處理細胞6 d。收集細胞，加入RIPA緩沖液(美國Thermo公司)裂解，并使用BCA蛋白質測定試劑盒測定蛋白質濃度。將相等量的蛋白質裂解物加載到10%SDS-PAGE凝膠上進行分離，然后轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美國Millipore公司)中。將膜在3% BSA中封閉2 h，用含有0.1%吐溫20的PBS洗滌，并在4 ℃下與Pin1(1 ∶1 000)、BMP2 (1 ∶1 000)、RUNX2 (1 ∶1 000)和GAPDH(1 ∶2 000)一抗孵育過夜，均購自英國Abcam公司。12 h后，將膜與HRP綴合的二抗孵育60 min，并通過增強化學發光檢測條帶，使用Image J 軟件對蛋白質水平進行光密度測定。

2 結果

2.1 DOP-1-1的分離純化、均一性、分子量和化學結構分析圖1A顯示了DOP-1-1的HPGPC譜圖，顯示了一個單一且對稱的峰，表明DOP-1-1是均一的多糖。根據標準曲線，DOP-1-1的平均相對分子量計算值為3 611。圖1B中顯示了FT-IR光譜分析鑒定DOP-1-1的特征官能團。DOP-1-1的-OH和C-H拉伸振動引起3 390 cm-1和2 930 cm-1的吸收帶，-OH變形振動引起1 628 cm-1和1 384 cm-1的吸收帶，1 200～1 000 cm-1范圍內的所有吸收帶表明存在吡喃糖環。在DOP-1-1的IR光譜中存在933 cm-1和761 cm-1的吸收帶均歸化吡喃糖的不對稱拉伸振動。圖2顯示了DOP-1-1的單糖組成分析的HPLC光譜。與標準單糖的保留時間比較，DOP-1-1由甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成。通過水解DOP-1-1的甲基化產物并乙酰化，得到部分甲基化阿爾迪醇乙酸酯(partially methylated alditol acetates，PMAA)。GCMS是一種分析PMAA的強大工具，可以提供有關DOP-1-1的糖苷酰基信息，見表1。

圖1 DOP-1-1的分離純化、均一性、分子量和化學結構分析

圖2 DOP-1-1的單糖組分分析

2.2 DOP-1-1的核磁共振波譜分析在DOP-1-1的HSQC光譜中，在5.32/99.7、5.14/91.8、4.89/98.5、5.26/100.0和4.59/95.7 ppm處觀察到5個相關峰異譜區(圖3A)。上述分析結果表明，DOP-1-1中有5個糖殘基，分別命名為A、B、D、E和F，與甲基化和GC-MS分析結果一致。因此，通過GC-MS分析和NMR分析相結合，獲得了殘基A、B、D、E和F的質子和碳化學位移，見表2。最后，對DOP-1-1的HMBC譜進行了分析，以獲得糖殘基間的連鎖位點和序列信息。A殘基在HSQC譜的異譜區顯示出最強的相關信號，兩個強相關峰位于HMBC光譜中5.32/76.9和3.58/99.7 ppm處，見圖3B。同時，GC-MS分析表明(1→4)鍵合葡萄糖占總糖殘量的63.6%。因此，根據所有證據，確認A殘基為(1→4)-連接葡萄糖。此外，交叉峰在4.89/67.1(DH1/EC6)、5.32/70.2(AH1/DC6)、4.89/70.2(DH1/DC6)、3.58/95.7(AH4/FC1)、3.77/99.7(FH3/AC1)、3.74/76.9(FH6/AC4)、5.14/99.7(BH1/AC1)和3.58/100.0(AH4/EC1)ppm，表明E殘基的C-6與D殘基的O-1相連，D殘基的C-6與A殘基的O-1相連，D殘基的C-6與D殘基的O-1相連，F殘基的C-1與A殘基的O-4相連，A殘基的C-1與F殘基的O-3相連，A殘基的C-4與F殘基的O-6相連，殘基A的C-1與殘基B的O-1相連，殘基E的C-1與殘基A的O-4相連。最后，通過相對分子量、單糖分析、甲基化分析和NMR數據的組合，得到DOP-1-1的推測結構，見圖4。

圖3 DOP-1-1的核磁共振波譜分析

圖4 DOP-1-1的預測結構

表2 DOP-1-1在D2O中記錄的1H和13C NMR化學位移

ALP活性被廣泛認為是成骨細胞分化的重要早期標志物。如圖5B所示，與正常組比較，對照組的ALP活性增加(t=11.678，P<0.001)，表明成骨培養基可以成功誘導MC3T3-E1細胞的分化。與對照組比較，E2和DOP-1-1(4.0、8.0 μmol/L)均顯著提高ALP活性(t=7.480、4.583、9.417，P<0.01)。特別是，DOP-1-1(8.0 μmol/L)的ALP活性高于陽性對照E2(t=3.542，P=0.025)。

圖5 DOP-1-1對MC3T3-E1細胞增殖和分化的影響(n=3)

2.4 DOP-1-1對MC3T3-E1細胞礦化的影響礦化結節的形成是成骨細胞的主要功能。如圖6A所示，與正常組比較，對照組中礦化結節的存在表明成骨培養基可以成功誘導MC3T3-E1細胞的礦化。與對照組比較，E2和DOP-1-1(2.0、4.0和8.0 μmol/L)提高了礦化率(t=7.144、6.920、14.315、7.367，P<0.001 )；并且DOP-1-1(4.0、8.0 μmol/L)的礦化率高于陽性對照E2組(6.532、3.477，P<0.05)，見圖6B。因此，DOP-1-1表現出成骨礦化作用，甚至優于陽性對照E2。因此，選擇4.0 μmol/L的DOP-1-1用于以下研究。

為了探索DOP-1-1對MC3T3-E1細胞的成骨分化作用，通過蛋Western blot分析成骨相關蛋白質的表達。如圖6C、D所示，與正常組比較，對照組Pin1、BMP2、RUNX2蛋白表達增加(t=3.312、3.015、2.742，P=0.025、0.030、0.037)，而DOP-1-1組Pin1、BMP2、RUNX2蛋白表達高于對照組(t=2.904、4.612、4.831，P=0.032、0.007、0.004)。

圖6 DOP-1-1對MC3T3-E1細胞礦化的影響(n=3)

3 討論

先前研究[4]證實，DOP抑制破骨細胞相關基因的表達和相關通路蛋白的合成，抑制RANKL誘導的BMMs的破骨細胞分化，表明DOP可能有助于成骨。因此，為了進一步確認DOP的生物活性成分，本研究從DOP中系統分離純化獲得了一種均質多糖(DOP-1-1)，其相對分子量為3 611。由于結構與活性密切相關，因此研究進一步通過單糖分析、紅外光譜、甲基化分析、GC-MS和核磁共振光譜的組合研究了DOP-1-1的結構。首先，單糖組成是多糖最基本的信息，PMP柱前高效液相色譜法是測定單糖組成的經典方法之一[6]。先前的研究[7]表明，成骨活性多糖通常含有甘露糖和半乳糖成分。本研究表明，DOP-1-1也含有甘露糖和葡萄糖。甲基化/GC-MS分析可以得到糖殘基的組成和相應的百分比。基于單糖組成分析和甲基化分析，核磁共振譜分析可以進一步提供質子和糖殘基的碳化學位移、連接位點和序列[8]。因此，本研究首次確定了DOP-1-1的結構特征。

MC3T3-E1細胞是與成骨細胞分化和礦化相關的研究模型，因為它可以分化并形成含有骨標志物的礦化良好的基質，如I型膠原蛋白、ALP和骨唾液蛋白[5]。本研究分析顯示，DOP-1-1在低濃度下促進MC3T3-E1細胞增殖、分化，其促進作用甚至優于E2。此外，DOP-1-1處理的細胞的礦化率增加，甚至比陽性對照E2更好。因此，DOP-1-1可以促進體外成骨細胞的分化和礦化。

Pin1/ BMP2信號通路在激活骨形成基因轉錄中起重要作用[9]。Pin1作為骨細胞分化的主協調器，是一種專門識別磷酸化絲氨酸或蘇氨酸與脯氨酸之間肽鍵的酶。最近研究發現，Pin1-/-小鼠出現發育性骨缺損和礦化減少[10]。BMP2是TGF-β超家族的成員，在成骨細胞中高度表達并在體外和體內調節成骨細胞分化[11]。BMP-2可通過激活SMAD1/5/8觸發多能間充質細胞分化為成骨細胞譜系[12]。RUNX2對成骨細胞分化和骨形成至關重要，RUNX2通過激活包括骨唾液蛋白、骨橋蛋白和骨鈣素在內的末端成骨標記基因，觸發前成骨細胞分化為成骨細胞[13]。本研究中，DOP-1-1組Pin1、BMP2、RUNX2蛋白表達增加，甚至比陽性對照E2更好，表明DOP-1-1可能通過激活Pin1增加BMP2的表達和轉錄活性，BMP2的表達增加隨后刺激了下游骨標記基因RUNX2激活，促進了骨形成。

多糖的結構特征如分子量、單糖組成、糖殘基類型等，對其生物活性具有重要影響和特殊意義。研究表明，低分子量(分子量<5 000) 多糖通常表現出相當大的成骨活性[14]。這項研究表明DOP-1-1具有低分子量(3 611)，并且還表現出更強的成骨活性。低分子量分子在體內應用中具有更多優勢，因為它們更容易被吸收。此外，從牛膝和仙茅中分離的多糖的成骨活性顯示出主要存在葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖和半乳糖[15]。因此，葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖和半乳糖被確定為與成骨活性相關的單糖。本研究發現這些單糖都出現DOP-1-1中，這可能是DOP-1-1具有更強成骨活性的原因。然而，DOP-1-1更精確的構效關系仍有待進一步研究。

綜上所述，本研究首次確定了DOP-1-1的初步結構，并發現其體外能促進MC3T3-E1細胞的增殖、分化和礦化，作用機制與激活Pin1/BMP2信號通路相關。所有上述研究都表明DOP-1-1是一種潛在的天然抗骨質疏松藥物，可用于藥物治療。