色氨酸-2,3-雙加氧酶2上調介導犬尿氨酸代謝在大鼠佐劑性關節炎中的作用研究

賈成艷，韓 萍，王越業，許 媛，許和鵬，陳阿圓，魏 偉，常 艷

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種系統性自身免疫病，臨床表現主要為慢性滑膜炎癥和關節軟骨、骨損傷[1]。早在20世紀學者們就發現RA患者血清、尿液和關節滑液中色氨酸(tryptophan,Trp)-犬尿氨酸(kynurenine,Kyn)代謝產物水平升高[2]，RA動物模型實驗同樣驗證了類似的結果[3]，提示Trp-Kyn代謝可能參與RA發生發展和病理機制。

吲哚胺-2,3-雙加氧酶(indoleamine-2,3-dioxygenase,IDO)1、IDO2 和色氨酸-2,3-雙加氧酶(tryptophan-2,3-dioxygenase 2,TDO2)是Kyn途徑的3個重要限速酶，但三者具有底物特異性和表達特異性。IDO1廣泛表達于各個組織和細胞，其在RA中的作用存在爭議，既表現為抗炎作用[4-5]，也表現為促炎作用[6]。IDO2與IDO1具有高度同源性，近年來發現IDO2可促進自身抗體產生，參與自身免疫性關節炎發生發展[7]。TDO2主要表達于肝臟，在多種腫瘤組織中表達較高，其在自身免疫病中研究較少。近年來研究發現TDO2可能是多發性硬化癥等自身免疫病的潛在治療靶點[8]。然而TDO2介導的Kyn代謝途徑在RA病程不同階段的表達及活性尚不明確。該研究探討佐劑性關節炎(adjuvant arthritis,AA)大鼠炎癥不同階段Trp和Kyn水平變化以及TDO2表達特點，為初步探索TDO2介導的Kyn代謝通路參與RA病理機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物 6～8周SPF級健康雄性SD大鼠，體質量(150±20)g，合格證號：SCXK(皖)2017-001，購于安徽醫科大學實驗動物中心。大鼠在 SPF 級實驗室、濕度(50±10)%及溫度(24±2)℃下飼養。本課題由安徽醫科大學臨床藥理研究所動物研究倫理委員會批準，實驗中相關方法均根據動物實驗相關指南和法規進行。

1.1.2試劑 卡介苗(bacillus calmette-cuerin,BCG)購于新華群碩實驗用品銷售部；L-Trp(WXBC4097V)購于美國Sigma公司；L-Kyn(BCBT1074)購于美國Sigma公司；TDO2(15880-I-AP)抗體購于美國Proteintech公司；DAB顯色試劑盒(ZLI-9018)購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.1.3主要儀器 YLS-7A 足趾容積測量儀購于山東醫學科學院；BX53 正置顯微鏡購于日本Olympus 光學工業株氏會社；Agilent1200 高效液相色譜儀購于美國Agilent 公司。

1.2 方法

1.2.1AA大鼠模型建立 BCG(50 mg)置于80 ℃水浴滅活1 h，與5 ml無菌液體石蠟混勻，研磨充分并用注射器抽打至乳白色，制成完全弗氏佐劑(complete freund’s adjuvant,CFA)。大鼠右后趾皮內注射0.1 ml CFA致炎，正常組注射生理鹽水作為對照，造模當天認定為d0。

1.2.2AA大鼠整體指標 ① 大鼠足爪腫脹度：造模前測量繼發側后足(左后足)容積，d14起，每3 d測量一次。繼發側足爪腫脹度=致炎后足爪容積-致炎前足爪容積。② 關節腫脹數評分(每只大鼠最高24 分)：自d14起，每3 d記錄關節腫脹數。每只足爪計1個踝關節(或腕關節)和5個指(趾)關節，每個關節腫脹記1分。③ 全身評分(每只大鼠最高8分)：自d14起，每3 d進行全身表現評分。耳、鼻、尾出現紅腫或結締組織腫脹記1分；每只前(后)足爪腫脹記1分。④ 體質量：自d14起，每3 d稱量體質量并記錄。

1.2.3肝臟和關節滑膜病理學觀察 大鼠處死后，分離肝臟和膝關節，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，膝關節使用EDTA 脫鈣液進行慢脫鈣(肝臟無需脫鈣)，石蠟包埋，制作厚約5 μm的組織切片，經蘇木精-伊紅(HE)染色后，顯微鏡下觀察。

1.2.4免疫組化檢測肝臟和關節滑膜TDO2表達 大鼠肝臟和滑膜組織切片常規處理，4 ℃過夜孵育TDO2抗體，次日室溫孵育二抗2 h，DAB顯色后蘇木精復染，封片后顯微鏡下觀察組織TDO2表達情況。將免疫組化染色強度分為以下4類：0分，細胞無著色；1分，細胞著色為淡黃色；2分，細胞著色為棕色；3分，細胞著色為深棕色。同時將陽性細胞百分比分值分為以下 5類： 0分，無陽性細胞；1分，陽性細胞≤20%；2分，20%<陽性細胞≤50%；3分，50%<陽性細胞≤75%；4分，陽性細胞>75%。最終將染色強度分值與陽性細胞百分比分值相乘得出評分結果[9]。

1.2.5HPLC檢測血清和肝臟組織勻漿上清液Trp、Kyn含量

1.2.5.1 標準曲線建立 血清和肝臟組織勻漿上清液裝入500分子量透析袋，在Krebs-Ringer磷酸鹽緩沖液透析2～3 d并及時更換透析液，直至透析液澄清，透析出低于500分子量的小分子物質，得到不含Trp(分子量204.23)和Kyn(分子量208.21)的空白樣品。向空白樣品中加入1 000 μmol/L Kyn標準品，梯度稀釋，使Kyn濃度分別為20、10、5、2、1、0.5 μmol/L，同時加入20 000 μmol/L Trp標準品，梯度稀釋，使Trp濃度分別為1 000、500、250、100、50、25 μmol/L。樣品加入等體積5%高氯酸沉淀蛋白，充分震蕩后14 000 r/min 高速離心 10 min，取20 μl上清液進樣分析[10]。由峰面積和標準品濃度計算得到標準曲線。

1.2.5.2 樣品前處理 取血清和肝臟組織勻漿上清液100 μl并加入等體積5%高氯酸沉淀蛋白，充分震蕩靜置后14 000 r/min 離心 10 min，取20 μl上清液進樣分析[10]。所得峰面積經標準曲線計算樣品Kyn、Trp濃度。TDO2為肝臟中Trp主要代謝酶，肝臟中Kyn/Trp比值可用于衡量TDO2活性[11]。

1.2.5.3 色譜柱條件 色譜柱：Agilent TC-C18(250 mm×5 mm,5 μm)；流動相為乙腈 ∶醋酸鈉(8 ∶92)；柱溫：30 ℃；流速：1.0 ml/min；Trp紫外檢測波長：280 nm，出峰時間約9 min；Kyn紫外檢測波長：360 nm，出峰時間約6 min[10]。

2 結果

2.1 AA大鼠整體指標觀察CFA免疫后d15～18炎癥初期，AA大鼠耳朵、鼻、尾巴、前爪及后足趾踝關節出現紅腫，體質量開始減輕。d19～27為炎癥高峰期，AA大鼠耳朵、鼻和尾部出現大面積紅腫結節，繼發側踝關節(左后足趾)表現為持續性腫脹。d27之后為炎癥緩解期，AA大鼠全身炎癥逐漸減輕(圖1)。

2.2 AA大鼠炎癥不同階段關節滑膜和肝臟組織病理學變化正常組大鼠關節結構完整且表面光滑，2～3層滑膜細胞覆蓋于軟骨外側。AA大鼠炎癥初期滑膜細胞增生，關節滑膜內有少量炎性細胞浸潤；高峰期AA大鼠關節黏連，滑膜細胞增生為多層并伴有大量炎性細胞浸潤，形成豐富的血管翳，關節軟骨受到侵蝕；與高峰期比較，緩解期關節滑膜內炎性細胞浸潤減少(圖2A1～4)。

正常組大鼠肝細胞形態正常，肝小葉結構完整；AA大鼠炎癥初期表現為肝索紊亂，胞質疏松，膽管周圍存在少量淋巴細胞浸潤；炎癥高峰期肝細胞病理變化較明顯，且膽管周圍存在大量淋巴細胞浸潤；炎癥緩解期淋巴細胞浸潤減少(圖2B1～4)。

圖2 不同炎癥階段AA大鼠關節滑膜和肝臟病理變化 HE×100

2.3 AA大鼠炎癥不同階段關節滑膜和肝臟組織TDO2表達免疫組化及其評分結果顯示，正常組和初期AA大鼠滑膜和肝臟組織中TDO2表達較低。與正常組比較，高峰期(F=16.418,P<0.01)和緩解期(F=16.418,P<0.05)大鼠關節滑膜TDO2表達升高；高峰期(F=27.686,P<0.01)和緩解期(F=27.686,P<0.05)大鼠肝臟組織中TDO2表達升高(圖3)。

圖3 不同炎癥階段AA大鼠關節滑膜和肝臟組織中TDO2表達變化 DAB×100

2.4 AA大鼠炎癥不同階段血清和肝臟組織勻漿上清液中Trp和Kyn水平變化HPLC檢測血清(表1)和肝臟組織勻漿上清液(表2)中Trp和Kyn含量。與正常組比較，初期、高峰期和緩解期AA大鼠血清中Trp水平均降低(F=91.397,P<0.01)，且緩解期與初期、高峰期之間的差異有統計學意義(F=91.397,P<0.05)；初期AA大鼠血清中Kyn水平升高(F=26.577,P<0.01)。與正常組比較，初期AA大鼠血清中Kyn/Trp比值(即TDO2活性)升高(F=50.227,P<0.01)(圖4A)。

表1 不同炎癥階段AA大鼠血清中Trp和Kyn含量

表2 不同炎癥階段AA大鼠肝臟中Trp和Kyn含量

與正常組比較，高峰期(F=13.661,P<0.01)和緩解期(F=13.661,P<0.05)AA大鼠肝臟組織Trp水平降低，且兩者之間的差異有統計學意義(F=13.661,P<0.05)；初期、高峰期、緩解期AA大鼠肝臟組織Kyn水平升高(F=2.766,P<0.01)，高峰期、緩解期與初期比較，差異有統計學意義(F=2.766,P<0.05)。與正常組比較，高峰期(F=23.452,P<0.01)和緩解期(F=23.452,P<0.05)AA大鼠肝臟組織中Kyn/Trp比值(即TDO2活性)升高(圖4B)。

圖4 不同炎癥階段AA大鼠血清和肝臟Kyn/Trp比值變化

3 討論

隨著代謝組學的研究與發展，學者們提出細胞代謝異常可能介導了RA的發生和發展[12]。RA患者Trp-Kyn代謝異常活化，其3個重要限速酶可能是重要的治療靶點。由于IDO1、IDO2、TDO2功能特異性，調控機制復雜，在不同細胞或疾病中作用機制可能存在差異或相互影響，而TDO2在RA中的作用未見報道，因此探究TDO2介導的Kyn代謝通路在RA不同炎癥階段變化和特點，初步闡明 TDO2 在RA病理機制中的作用尤為重要。

本研究建立了AA模型，模型大鼠足爪腫脹度、全身評分和足爪腫脹數等整體指標明顯改變，膝關節滑膜組織異常增生、大量炎性細胞浸潤，形成豐富的血管翳，與RA表現出相似的病理學變化，提示模型制備成功。超過一半的RA患者可能伴有肝酶升高、肝臟組織學異常，包括慢性炎性細胞浸潤、肝細胞壞死等病理學變化[13]。本研究發現AA大鼠肝臟出現異常病理學變化，主要表現為肝索紊亂，肝細胞胞質疏松，炎性細胞浸潤，且從炎癥早期即出現病理學變化，高峰期表現明顯。因此，在疾病早期認識肝臟損害，并根據損害的性質采取適當的治療，可能具有重要的臨床意義。

本研究進行了AA模型不同炎癥階段(初期、高峰期、緩解期)TDO2表達及其介導的Kyn代謝變化研究，結果顯示，炎癥高峰期和緩解期關節滑膜中TDO2表達異常升高(P<0.05)，提示TDO2可能參與AA大鼠滑膜炎癥發生發展。同時發現AA大鼠炎癥高峰期和緩解期肝臟中TDO2表達增加(P<0.05)，提示TDO2可能參與肝臟Kyn代謝及異常病理學變化。

HPLC結果顯示AA大鼠血清Trp水平降低(P<0.01)，與文獻報道一致[5]。此外，本研究首次在AA大鼠模型中檢測肝臟組織中Trp-Kyn代謝變化，結果顯示，炎癥高峰期AA大鼠肝臟組織中Kyn/Trp比值(即TDO2活性)升高(P<0.01)，提示TDO2介導的Kyn代謝在炎癥高峰期高度活化。肝臟中異常活化的Trp-TDO2-Kyn代謝如何影響關節滑膜炎癥呢？可能是TDO2表達和活性的增加，導致系統Kyn大量積累，Kyn可作用于FLS表面芳香烴受體，激活的芳香烴受體可誘導FLS異常活化，促進FLS增殖、遷移以及分泌炎性細胞因子IL-1β和IL-6，參與關節滑膜炎癥和關節破壞[14]。

綜上所述，Kyn代謝異常可能參與了AA發生發展，其重要限速酶TDO2在AA高峰期異常表達和活化，可能介導了AA大鼠的發生發展及異常病理學變化，為闡明RA 新的病理機制和發現新的藥物靶點提供重要依據。