Nod2基因在肺炎克雷伯菌肝膿腫中的作用研究

孟 寶，伍 婷，蘇 叢，孫雅婷，唐明洋，郭明娟，蘭燕虎，李家斌,,5

化膿性肝膿腫是肝臟的占位性病變，具有高的致病率和致死率，肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae，K.pneumoniae)是其主要的致病菌之一[1-2]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域2(nucleotide binding oligomerization domain 2，NOD2)是核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體 (nucleotide binding oligomerization domain-like receptor，NLR) 家族的成員，參與激活NF-κB、MAPKs等促炎通路，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答[3]。近期研究[3-7]表明，NOD2在肺組織防御病原菌感染過程中發(fā)揮重要保護(hù)作用。目前關(guān)于NOD2在肝組織防御病原菌感染過程的作用機(jī)制尚不明確。該研究通過繁育和鑒定Nod2基因肝組織條件性敲除小鼠[8]，建立Nod2基因肝臟敲除小鼠感染K.pneumoniae誘發(fā)肝膿腫模型，初步探究Nod2基因在K.pneumoniae誘導(dǎo)肝膿腫發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與菌株Nod2flox/+小鼠共 3 只，雌鼠 1 只、雄鼠 2 只；Alb-Cre+工具鼠共 2 只，雌、雄各 1 只均購自賽業(yè)(廣州)生物科技有限公司，20～30 g/6周齡，小鼠品系為C57BL/6J，無特殊病原體(SPF級(jí))。K.pneumoniaeATCC13883由安徽省細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)中心保存。所有實(shí)驗(yàn)操作均遵循安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，倫理審批號(hào)：LLSC20190253。

1.1.2主要試劑與儀器 主要試劑：鼠尾基因組DNA 提取試劑盒(貨號(hào)：NMSC0001-50)購自上海南方模式生物科技股份有限公司；瓊脂糖粉(批號(hào)：111860)購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Trizol Reagent(貨號(hào)：15596026)購自美國Invitrogen公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)：6210A)、DL2000 bp DNA Marker(貨號(hào)：A1A0438)、TB Green Premix Ex TaqTM(貨號(hào)：RR420)以及PCR Taq Mix(貨號(hào)：RR901)均購自日本Takara公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(貨號(hào)：P0010S)購自碧云天生物技術(shù)有限公司；小鼠抗β-Actin 抗體(貨號(hào)：AF7018)購自江蘇親科生物研究中心有限公司；兔抗NOD2抗體(貨號(hào)：abs152480)購自愛必信(上海)生物科技有限公司；山羊抗小鼠IgG-HRP(貨號(hào)：ZB-2305)、山羊抗兔IgG-HRP(貨號(hào)：ZB-2301)購自北京中杉金橋公司。

主要儀器：普通PCR擴(kuò)增儀(德國Biometra Tone公司)，核酸電泳槽(北京六一生物科技有限公司)；凝膠電泳成像儀(Tanon 5200 Multi，上海天能科技有限公司)，熒光定量PCR儀(羅氏LightCycler 96，瑞士)，Western blot 電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1小鼠的飼養(yǎng)與繁育Nod2基因條件敲除小鼠于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房內(nèi)飼養(yǎng)與繁殖。飼養(yǎng)室溫控制在20～25 ℃，濕度50%～60%，保證12 h光照，晝夜交替,自由飲食和飲水。小鼠籠盒、墊料、飼料和飲用水經(jīng)過高溫高壓消毒滅菌處理。每周更換2次墊料，更換水和飼料，并且給予人道關(guān)懷。

1.2.2小鼠親代及子代信息記錄 在繁殖籠標(biāo)簽上，記錄鼠號(hào)、基因型、出生日期、合籠日期、父母本的鼠號(hào)、產(chǎn)仔日期和數(shù)量。在離乳籠標(biāo)簽上，記錄籠號(hào)、基因型、出生日期、離乳日期。

1.2.3小鼠基因型鑒定 小鼠出生后3～4周與母鼠分籠，使用75%乙醇溶液沖洗剪刀和鑷子并剪取小鼠腳趾0.3～0.5 cm放入1.5 ml 無菌EP管中，并依據(jù)剪取的不同腳趾標(biāo)記同窩小鼠。用基因組DNA提取試劑盒提取小鼠基因組DNA，所得樣品置-20 ℃保存。Nod2flox/+小鼠基因型鑒定，上游引物：5′-CATCGCAGCCAGACTTGAAGTT-3′；下游引物：5′-CCTTGTTGCCCATATGATTCTGAC-3′(flox純合子小鼠：216 bp；flox雜合子小鼠：216 bp和171 bp；flox陰性小鼠：171 bp)。Alb-Cre+小鼠基因型鑒定，上游引物：5′-GAAGCAGAAGCTTAGGAAGATGG-3′；下游引物：5′-TGCAAACATCACATGCACAC-3(Alb-Cre+小鼠：390 bp；Alb-Cre-小鼠：351 bp)。PCR反應(yīng)體系為25 μl(Taq Mix 13 μl，去離子水10 μl，引物1 μl，小鼠DNA 1 μl)，反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃ 1 h。

配制2.0%的瓊脂糖凝膠：稱取2.0 g瓊脂糖粉末溶于100 ml 1×TAE電泳緩沖液中，微波爐中高火加熱4 min，冷卻至60 ℃左右加入10 μl 紅色熒光核酸染料，輕搖混勻，制膠。取5 μl PCR產(chǎn)物和3 μl DL2000 bp DNA Marker加入上樣孔中進(jìn)行電泳分析，恒壓150 V，時(shí)間35 min；然后置于凝膠電泳成像儀中成像，觀察電泳條帶。

1.2.4Nod2基因敲除效果驗(yàn)證 取Nod2flox/flox;Alb-Cre+(實(shí)驗(yàn)組小鼠)和Nod2flox/flox(對(duì)照組小鼠)的肝組織，采用RT-qPCR方法檢測(cè)兩組肝組織Nod2基因的mRNA 的表達(dá)水平。上游引物：5′-AGAAGCTCCTCGAAGCTGTG-3′；下游引物：5′-CCTCACACTCGTACTGGCTC-3′；內(nèi)參Gapdh基因上游引物為5′-GTCAAGGCCGAGAATGGGAA-3′；下游引物為5′-CTCGTGGTTCACACCCATCA-3′。Western blot檢測(cè)兩組肝組織NOD2 蛋白的表達(dá)水平：用 RIPA裂解液提取兩組小鼠的肝組織總蛋白，BCA蛋白定量后取適量與上樣緩沖液混合100 ℃水浴10 min變性。將所制蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，恒壓75 V，120 min；電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。分別加入經(jīng)一抗稀釋液稀釋的β-Actin抗體(1 ∶1 000)、NOD2抗體(1 ∶800)，4 ℃孵育過夜；1×TBST緩沖液洗膜3 次，每次10 min；加入5%脫脂奶粉稀釋的山羊抗兔或山羊抗鼠的二抗(1 ∶10 000)孵育 1.5 h，1×TBST緩沖液洗脫3 次后化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照，觀察NOD2蛋白表達(dá)情況，進(jìn)一步驗(yàn)證Nod2基因在肝組織中的敲除效果。

1.2.5小鼠感染K.pneumoniae誘發(fā)肝膿腫模型 將K.pneumoniaeATCC13883劃線接種在MHA固體培養(yǎng)平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)；次日，挑取單菌落于液體MHB培養(yǎng)基中，制備成1.5×108CFU/ml的細(xì)菌懸浮液；每只小鼠口腔灌胃0.3×108CFU肺炎克雷伯菌(體積為200 μl)誘發(fā)肝膿腫。

1.2.6小鼠肝組織病理切片制備 使用1%戊巴比妥納腹腔麻醉小鼠取出完整肝組織，放入10%的中性福爾馬林中固定；將固定好的小鼠肝臟組織依次進(jìn)行脫水透明、浸蠟包埋、切片展片、脫蠟染色，最后用中性樹膠封片，存放備用。

1.2.7小鼠肝組織炎癥因子熒光定量PCR檢測(cè)Nod2flox/flox;Alb-Cre+(實(shí)驗(yàn)組小鼠)和Nod2flox/flox(對(duì)照組小鼠)分別感染K.pneumoniae48 h后，取出肝組織，采用RT-qPCR方法檢測(cè)兩組小鼠肝臟中炎癥因子腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)和趨化因子CXC配體1(C-X-C motif chemokine ligand 1，CXCL1) 的mRNA表達(dá)量。GAPDH上下游引物見“1.2.4”；TNF-α上游引物為5′-TGACAAGCCTGTAGCCCACG-3′，下游引物為5′-TTGTCTTTGAGAT- CCATGCCG-3′。IL-1β上游引物為5′-GAAATGCCACCTTTTGACAGTG-3′，下游引物為5′-TGGATGCTCTCATCAGGACAG-3′；CXCL1上游引物為5′-ACAGGGGCGCCTATCGC-3′，下游引物為5′-ACAATTTTCTGAACCAAGGGAGC-3′。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，組間比較采用t檢驗(yàn)，對(duì)于生存率曲線比較，使用Log-Rank(Mantel-Cox) 檢驗(yàn)分析結(jié)果。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠基因型鑒定結(jié)果取幼鼠腳趾進(jìn)行小鼠基因型鑒定。基因型鑒定PCR結(jié)果如圖1所示，1、2、5為flox純合子(Nod2flox/flox，216bp)；3和4 為flox雜合子(Nod2flox/+，171 bp和216 bp)。Alb-Cre基因型鑒定PCR結(jié)果如圖2 所示：其中1、3和4為Alb-Cre+小鼠 (390 bp)，2和5為Alb-Cre-小鼠(351 bp)。選擇1為實(shí)驗(yàn)組小鼠(基因型：Nod2flox/flox;Alb-Cre+)，2、5為對(duì)照組小鼠(基因型為Nod2flox/flox)。

圖1 flox基因型鑒定結(jié)果

圖2 Cre基因型鑒定結(jié)果

2.2 條件性基因敲除小鼠敲除效果驗(yàn)證取5只實(shí)驗(yàn)組和5只對(duì)照組小鼠肝臟進(jìn)行敲除效果驗(yàn)證。提取小鼠肝組織RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行熒光定量PCR鑒定。結(jié)果如圖3所示，Nod2flox/flox;Alb-Cre+小鼠肝臟NOD2 mRNA的表達(dá)量小于Nod2flox/flox小鼠肝臟NOD2 mRNA 的表達(dá)量[(0.419±0.097)vs(1.030±0.320)，P<0.05]。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，與Nod2flox/flox小鼠比較，Nod2flox/flox;Alb-Cre+小鼠NOD2蛋白降低。最終獲得了可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的Nod2基因肝臟條件性敲除小鼠(Nod2flox/flox;Alb-Cre+)。

圖3 兩組小鼠NOD2 mRNA表達(dá)量

圖4 兩組小鼠NOD2蛋白表達(dá)水平

2.3Nod2flox/flox;Alb-Cre+小鼠感染肺炎克雷伯菌后表型變化為探究Nod2基因在小鼠肝臟感染K.pneumoniae中發(fā)揮的作用，實(shí)驗(yàn)組小鼠(基因型：Nod2flox/flox;Alb-Cre+)和對(duì)照組小鼠(基因型：Nod2flox/flox)各取10只，通過口腔灌胃的方法制備肝膿腫模型，檢測(cè)小鼠和肝組織病理變化和72 h死亡率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組小鼠和對(duì)照組小鼠感染K.pneumoniae48 h后，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組肝組織整體結(jié)構(gòu)大面積受到破損，病理損傷程度嚴(yán)重(圖5)；對(duì)照組小鼠72 h死亡率為30%，實(shí)驗(yàn)組小鼠組72 h死亡率為70%(中位生存時(shí)間60.5 h，P=0.046 9)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6)。

圖5 兩組小鼠肝組織病理學(xué)改變 HE×200

圖6 兩組小鼠感染肺炎克雷伯菌后生存率曲線

2.4Nod2flox/flox;Alb-Cre+小鼠感染K.pneumoniae后肝臟炎癥因子表達(dá)水平改變比較實(shí)驗(yàn)組小鼠(基因型：Nod2flox/flox;Alb-Cre+)和對(duì)照組小鼠(基因型為Nod2flox/flox)感染K.pneumoniae48 h后肝組織炎癥因子的表達(dá)水平。結(jié)果如圖7所示，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟內(nèi)的炎癥因子TNF-α(t=3.736，P=0.020)、IL-1β(t=3.114，P=0.036)和CXCL1(t=3.264，P=0.031)的相對(duì)表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖7 兩組小鼠感染肺炎克雷伯菌后肝臟炎癥因子mRNA表達(dá)

3 討論

K.pneumoniae是一種革蘭染色陰性的條件致病菌，可引起多種感染性疾病，包括菌血癥、肺炎和肝膿腫等[9]。健康人體腸道內(nèi)定值的高毒力K.pneumoniae，在病理狀態(tài)下可經(jīng)門靜脈系統(tǒng)進(jìn)入肝臟引起肝膿腫，伴有膿毒癥的K.pneumoniae肝膿腫還可以引起眼內(nèi)炎、腦膜炎、壞死性筋膜炎等肝外并發(fā)癥[2,10-11]。胞質(zhì)內(nèi)模式識(shí)別受體NOD2可識(shí)別細(xì)菌產(chǎn)生的肽聚糖MDP，通過招募并與接頭蛋白R(shí)IP2或CARD9結(jié)合觸發(fā)NF-κB、MAPKs等促炎信號(hào)通路，產(chǎn)生炎癥因子和抗菌肽，在宿主抵御細(xì)菌感染的過程中發(fā)揮重要作用[12-14]。已有研究發(fā)現(xiàn)NOD2在肺炎鏈球菌感染的腦膜炎中通過誘導(dǎo)腦部炎癥和自噬發(fā)揮保護(hù)作用[15]；NOD2在早期鮑曼不動(dòng)桿菌肺部感染中通過產(chǎn)生活性氧/活性氮參與肺防御[7]。目前，Nod2基因在肝臟中的功能尚不明確。

本研究利用Cre-Loxp重組酶系統(tǒng)敲除小鼠肝臟中Nod2基因，通過繁育和基因鑒定，成功篩選出純合子幼鼠(Nod2flox/flox;Alb-Cre+)；RT-qPCR和Western blot結(jié)果顯示，NOD2 mRNA表達(dá)量降低，NOD2蛋白表達(dá)量降低，這提示小鼠肝臟Nod2基因敲除成功。

K.pneumoniae感染肝組織后，肝臟Kupffer細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞可以通過產(chǎn)生IL-1β、TNFα、CXCL1等細(xì)胞因子，產(chǎn)生保護(hù)性的免疫應(yīng)答。本研究發(fā)現(xiàn)，在感染K.pneumoniae的小鼠中，肝臟Nod2基因敲除后，小鼠生存率降低且肝組織病理損傷增大，說明條件基因敲除小鼠對(duì)K.pneumoniae感染的抵抗能力減弱。此外，感染K.pneumoniae的Nod2基因條件敲除小鼠肝臟炎癥因子TNF-α、IL-1β和CXCL1的mRNA相對(duì)表達(dá)量均降低，由此可見NOD2可能通過其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)影響肝臟抗K.pneumoniae感染的免疫應(yīng)答。