不同暴露方式下利奈唑胺聯合磷霉素對金黃色葡萄球菌抗菌效應研究

張貴軍，黃 宏，沈陳林，劉艷艷，謝 娜，江麗芳，李家斌，黃曉暉

抗菌藥物聯合體外研究中絕大部分在實驗設計時通常是以藥物同時暴露于受試菌的方式進行[1-2]。而這并不一定與臨床實踐中的情況完全相符，如由于藥物半衰期不同進而給藥的頻次不同[3]；或因為理化性質的差異并不能混合給藥，如將氨基糖苷類和β-內酰胺類混合給藥時，會導致彼此喪失抗菌效應。故有些抗菌藥物聯合時會采用序貫給藥方式。

利奈唑胺(linezolid,LZD)聯合磷霉素(fosfomycin,FOS)對金黃色葡萄球菌在體內和體外均具有良好的抗菌效應[4-5]。但是，蛋白合成抑制劑聯合細胞壁合成殺菌藥尚存在一定的不確定性[6]；且現有文獻關于LZD聯合FOS的研究均采用的是同時給藥方式，尚未有研究二者在序貫給藥下的藥效學關系。因此，該研究重點探討兩藥在不同暴露順序、間隔下對抗菌后效應(post-antibiotic effect，PAE)和殺菌效應的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株受試菌株為金黃色葡萄球菌ATCC29213，由安徽細菌耐藥監測中心提供。

1.2 藥物與試劑LZD購自美國Selleck Chemicals公司，FOS購自中國食品藥品檢定研究院。 MH瓊脂(mueller-hinton agar，MHA)購自英國Oxoid公司, MH肉湯(mueller-hinton broth,MHB)購自青島高科園海博生物技術有限公司,6-磷酸葡萄糖購自北京索來寶科技有限公司。FOS的實驗均添加6-磷酸葡萄糖(終濃度為25 mg/L)，藥物均配成合適濃度的應用液分裝并儲存在-20 ℃冰箱中備用(有效期2個月)。

1.3 方法

1.3.1菌懸液制備 從接種待測菌的培養皿上取2～3個大小相似的待測菌落于3 ml無菌肉湯中，37 ℃震蕩培養箱中過夜培養后，取20 μl細菌培養液于2 ml無菌肉湯中繼續在37 ℃震蕩培養箱中培養2～3 h，使細菌進入對數生長期。然后調整細菌濃度為(1～2)×108CFU/ml，再以無菌肉湯稀釋10倍得到細菌應用液(1×107CFU/ml)。

1.3.2最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)測定 參照美國臨床與實驗室標準委員會推薦的瓊脂稀釋法測定[7]。所有實驗均重復3次。

1.3.3PAE測定 取上述細菌應用液0.5 ml加入含4 ml MHB的試管中(T管)，再加入0.5 ml LZD或FOS應用液，此時試管中藥物終濃度分別為4 mg/L和2 mg/L。最終細菌濃度在1.5×106CFU/ml左右。另設未接觸藥物的空白對照組(C管)，加0.5 ml濃度為1×107CFU/ml菌液和4.5 ml的MHB。混合均勻后均置于37 ℃恒溫培養箱中同步震蕩孵育1 h。

所有實驗均重復3次。首先測定LZD與FOS單藥及聯合暴露1 h的PAE；再測定兩藥在不同的給藥順序及間隔下的PAE值。具體如下：將受試菌首先暴露于LZD 1 h，然后在其PAE起始期(Tb=0 h，洗去LZD后立即加入FOS)，中間期(Tm=0.5 h，洗去LZD后間隔0.5 h)和結束期(Te=2 h，洗去LZD后間隔2 h)分別給予FOS暴露1 h后測定PAE。改變給藥順序和間隔，即先暴露FOS，在其PAE的起始期(Tb=0 h),中間期(Tm=1 h)和結束期(Te=2 h)分別給予LZD暴露1 h后測定PAE。本實驗采用洗滌離心法除去藥物，即在每個孵育終點時，用適量MHB沖洗培養物，以3 000 r/min離心5 min去除藥物，連續洗滌3次，再用MHB稀釋成所需體積。

于0、1、2、4、6、8、10 h分別采樣0.1 ml，用無菌生理鹽水進行10倍系列稀釋后，取適當稀釋度菌液涂布于空白瓊脂板，倒置于37 ℃恒溫培養箱中孵育18～24 h后進行菌落計數。PAE的計算根據標準公式：PAE=T-C，其中T為稀釋后實驗管中細菌增加1 log10所需時間，C為稀釋后對照管中細菌增加1 log10所需時間。PAE運用于聯合抗菌效應研判時，是指聯合PAE比兩藥單藥PAE之和更長、相似或更短時，則兩藥判斷為協同、相加或拮抗作用。在間隔給藥中，在PAE中間期和結束期，為防止對照組細菌過度生成，需分別進行10倍和100倍稀釋處理。

序貫給藥實驗中，后暴露藥物的凈PAE值是從實際測得的PAE值減去先暴露藥物的殘留PAE。此外，先暴露藥物和后暴露藥物之間存在一個暴露時間差(Tb、Tm和Te)。而殘留PAE是通過在第一項實驗中得到的單藥PAE減去暴露時間差計算得出。以LZD的PAE中間期 (Tm) 暴露FOS為例，LZD的殘留PAE等于單藥LZD的PAE減去Tm，則FOS的凈PAE等于實際測得的PAE減去LZD的殘留PAE。

1.3.424 h殺菌實驗 取上述細菌應用液和藥液分別加入實驗管中，最終細菌濃度在1×106CFU/ml左右，藥物濃度均為2×MIC。分3種暴露方案：① 同時暴露；② 先暴露LZD 1 h后再暴露FOS；③ 先暴露FOS 1 h后再暴露LZD。同步設空白對照組，于0、2、4、8、10、24 h分別取樣50 μl，用無菌生理鹽水進行10倍系列稀釋后，取適當稀釋度菌液涂布于空白瓊脂板，倒置于37 ℃恒溫培養箱中孵育24 h后進行菌落計數，繪制殺菌曲線。所有實驗均重復3次。

1.4 統計學處理采用SPSS 23.0版統計軟件進行數據分析。采用單因素方差分析(One-way ANOVA)比較4、8、10、24 h細菌生長的變化，再進行SNK-q檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MICLZD和FOS對ATCC29213的MIC分別為2 mg/L和1 mg/L。

2.2 PAELZD暴露1 h的PAE為(1.2±0.1)h，FOS暴露1 h的PAE為(1.6 ±0.1)h，同時暴露1 h的PAE為(2.9±0.1)h，兩藥聯合呈相加效應。3種暴露方式下的細菌生長曲線見圖1。

圖1 ATCC29213暴露于LZD和FOS單藥及聯合1 h的PAE細菌生長曲線

序貫給藥實驗中，先暴露LZD后，分別在其PAE的Tb、Tm和Te暴露FOS，實測PAE值分別為(0.9±0.1)、(0.7±0.3)和(0.9±0.1)h；對應LZD的PAE殘留值分別為1.2、0.7和0 h，則FOS的凈PAE平均值分別為-0.3、0和0.9 h。3種暴露條件下的細菌生長曲線見圖2。

圖2 ATCC29213暴露于LZD 1 h后，分別在其PAE的Tb、Tm和Te給予FOS暴露1 h細菌生長曲線

當先暴露FOS時，在其PAE的Tb、Tm和Te暴露LZD后，分別測得PAE值為(2.8±0.1)、(2.0±0.2)和(1.3±0.1)h；對應FOS的PAE殘留值分別為1.6、0.6和0 h，則LZD的凈PAE平均值分別為1.2、1.4和1.3 h。3種暴露條件下的細菌生長曲線見圖3。

圖3 ATCC29213暴露于FOS 1 h后，分別在其PAE的Tb、Tm和Te給予LZD暴露1 h細菌生長曲線

2.3 24 h殺菌實驗效果分析先暴露LZD和同時暴露時，給藥10 h時二者細菌減少的程度幾乎一致，持續24 h后差異無統計學意義(P=0.198)。而相較于先暴露FOS，給藥4 h后，細菌下降的程度即出現了明顯分化，即先暴露FOS后細菌減少明顯強于先暴露LZD (P=0.002)和同時暴露(P=0.012)，且持續至24 h的差異更為明顯，相差1 log10左右。統計分析結果顯示給藥方式不同，24 h殺菌效果差異有統計學意義(F=13.325，P=0.006)，見圖4。

圖4 LZD聯合FOS三種暴露方式下對金黃色葡萄球菌ATCC29213的殺菌曲線

3 討論

PAE作為一種時間藥效學參數，在單藥中進行了廣泛而深入的研究，但其在抗菌聯合中的相關研究性文獻較少。據Li et al[8]研究發現PAE反映的抗菌聯合藥效學關系取決于藥物的暴露模式、順序和間隔。這表明暴露方式對某些抗菌聯合的藥效學行為起著不可忽視的作用；如在利福平或紅霉素的PAE相內，β-內酰胺和氨基糖苷類對大腸桿菌和肺炎克雷伯菌的殺菌活性明顯降低，且與PAE的持續時間相關[9]。

本研究序貫給藥下，在LZD的PAE相內給予FOS暴露，其幾乎沒有產生PAE，這表明受試菌在受到LZD的作用后，對FOS的敏感性降低，前者對后者產生了拮抗作用；并且這種拮抗越是在LZD的PAE早期越明顯。有學者提出蛋白質合成抑制劑產生的停滯作用可能會抑制需在細胞分裂期發揮作用來阻斷細胞壁合成的抗菌藥物的活性[10-12]。LZD是一種惡唑烷酮類蛋白合成抑制劑，其首先接觸受試菌后，對受試菌的繁殖行為產生了停滯作用，導致受試菌處于細胞分裂靜止期；而破壞細胞壁合成的殺菌劑FOS發揮殺菌作用需要受試菌處于細胞分裂繁殖期時達到最佳[13]。這可能導致FOS與受試菌的結合能力下降，使得進入菌體內的FOS量減少，而PAE的持續時間是細胞內有效抗菌藥物殘存的量度[14]。這表明先暴露LZD的給藥方式在二者聯合時可能不是一種可取的選擇。

據體外和臨床研究報道，先暴露FOS的給藥方式可以顯著提高聯合藥物的抗菌效應[15-16]。而在本研究的24 h殺菌實驗中，先暴露FOS給藥方式比同時暴露和先暴露LZD產生更早更強的抗菌作用；而同時暴露方式在聯合抗菌時間更長的情況下并未體現殺菌優勢。推測產生這種差異的原因可能是由于FOS具有獨特的阻斷細胞壁合成的抗菌機制[17-18]；當首先接觸受試菌后，在早期抑制肽聚糖的合成，破壞了細菌的外部結構，并最終阻斷細菌細胞壁的合成，這使得LZD更容易進入菌體內發揮抗菌作用，進而兩藥聯合產生了增強的抗菌效應。

綜上所述，本研究的結果支持LZD聯合FOS的藥效學行為與藥物的暴露方式密切相關。同時暴露可能并未發揮最佳抗菌效應，而先暴露FOS的方式可能是更優的給藥方案。進一步的研究包括耐藥菌、體內實驗以及臨床研究等來探討序貫給藥對聯合藥動學和藥效學的影響可能是需要的。