GP73中和抗體抑制MCD飲食誘導的非酒精性脂肪肝機制研究

劉家蘢，楊曉莉，張雪苗，楊小盼，魏從文

截至2019年，非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)在亞洲的總患病率已經超過29.62%[1]。 NAFLD與肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的發生密切相關，每年罹患HCC的患者不斷增多，使其一度成為全球癌癥相關死亡的主要原因之一[2]。因此，尋找更有效的治療方式或藥物是解決NAFLD的主要手段。

肝臟處于病理狀態時，其高爾基體蛋白73(golgi protein 73，GP73)往往會有較高的表達水平[3-4]，它能調控TGF-β1/Smad2信號通路促進肝癌細胞的侵襲和轉移[5]，也具有輔助診斷低濃度甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)原發性肝癌(primary hepatic carcinoma,PHC)的潛力[6]。GP73可通過促進SCAP/SREBPs的表達，參與脂質代謝途徑，調控肝細胞脂肪變性[7]，而NAFLD的發生與多種代謝綜合征密不可分[8]。該研究通過飼喂蛋氨酸和膽堿缺乏(methionine-choline deficient，MCD)飲食，構建小鼠NAFLD模型，探討GP73中和抗體在治療NAFLD方面的價值。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級C57BL/6小鼠，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK 2016-0002。

1.2 試劑TriQuick Reagent 總RNA提取試劑(北京索萊寶科技有限公司)；改良油紅O染色液(北京索萊寶科技有限公司)；EasyScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(北京全式金生物技術股份有限公司)；PerfectStart?Green qPCR SuperMix(北京全式金生物技術股份有限公司)；SREBP1一抗(英國Abcam公司)；GP73一抗(美國Santa Cruz公司)；α-SMA一抗(美國SAB公司)；α-Tubulin一抗(美國Proteintech公司)；GP73中和抗體(北京熱景生物技術股份有限公司)。

1.3 儀器NanoDropTMLite 分光光度計(美國Thermo Fisher公司)；QuantStudioTM3 Real-Time PCR System(美國Thermo Fisher公司)；生物樣品均質儀(杭州奧盛儀器有限公司)。

1.4 NAFLD模型的構建選擇周齡性別一致的C57BL/6小鼠，其體質量情況和健康狀況無明顯差異，周齡6～8周。所有小鼠按照隨機分配的方式被均分至模型組和對照組中，每組6只小鼠。模型組喂以MCD飲食，其中一組按照80 μg/2 d的規格尾部注射GP73中和抗體，另一組注射同體積IgG抗體(immunoglobulin G，IgG)。對照組喂養蛋氨酸和膽堿充足(methionine-choline sufficient，MCS)飲食，其它條件與模型組相同。連續干預1個月之后，摘取眼球收集小鼠血液和肝臟組織。

1.5 血清生化指標分析收集小鼠血清送至解放軍總醫院第三醫學中心檢驗科利用全自動生化分析儀檢測血清中的總膽固醇(total cholesterol,TC)、天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase,AST)、三酰甘油(triglyceride,TG)和丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase,ALT)等指標。

1.6 ORO染色和HE染色采集模型組和對照組小鼠部分肝組織用10%福爾馬林過夜固定，切片后置入恒冷箱。待冰凍后將切片取出，去離子水洗一次，然后置入60%異丙醇浸洗30 s。將切片放入ORO染色液中密閉染色15 min，再置入60%異丙醇浸洗30 s，經去離子水稍洗一次后，用蘇木精復染核30 s，再用1%的鹽酸溶液進行分化，然后經去離子水浸泡10 min，最后用濾紙吸干水分，用甘油明膠封片[9]；HE染色切片由北京賽維爾生物科技有限公司負責制作[10]。

1.7 RNA提取利用生物樣品均質儀研磨組織，按照TriQuick Reagent 總RNA提取試劑盒說明書提取模型組和對照組小鼠肝組織的總RNA，RNA濃度經分光光度計進行測定，瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整無降解后用于后續實驗。

1.8 qRT-PCR以上述RNA為樣本，按照EasyScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒說明書將RNA逆轉錄合成cDNA，并以此cDNA為模板，按照PerfectStart?Green qPCR SuperMix試劑盒說明書配制反應體系，利用QuantStudioTMReal-Time PCR System儀器進行qRT-PCR擴增，具體方法為先將PCR溫度提高到94 ℃用以預熱反應體系30 s，然后保持94 ℃變性5 s，再將PCR溫度降低至55 ℃退火15 s，最后將溫度升至72 ℃延伸10 s，1個反應循環包括變形、退火和延伸3個步驟，重復40個循環后即可根據熒光信號判斷是否擴增出目的基因。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR擴增引物序列表

1.9 Western blot取等質量模型組和對照組小鼠肝臟組織按照每20 mg組織加入200 μl裂解液的比例分別加入RIPA裂解液，裂解后再12 000 r/min離心5 min，收集上清液即為提取的組織蛋白。取各組適量蛋白上清行SDS-PAGE電泳，轉膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4 ℃搖床過夜，經TBST洗滌后，二抗孵育1 h、洗滌、顯影。利用Image J軟件分析相對表達量。

2 結果

2.1 MCD飲食促使小鼠發生NAFLD分別取3只小鼠用MCD飲食和MCS飲食喂養，1個月后取小鼠血清和肝臟組織。研究發現模型組小鼠血清中AST、ALT水平均增高(圖1A、B)；TG、TC 水平降低(圖1C、D)；ORO染色的結果也顯示MCD飲食后小鼠肝臟出現大量脂肪累積(圖1E)。以上結果均與NAFLD癥狀一致，說明MCD誘導的小鼠NAFLD模型構建成功。

圖1 MCD飲食促使小鼠發生NAFLD

2.2 GP73中和抗體抑制MCD誘導的小鼠NAFLD為了研究GP73中和抗體在肝臟病變中的功能，在構建MCD-NAFLD模型過程中按照80 μg/2 d的劑量給其中一組小鼠尾靜脈注射GP73中和抗體，同時給另一組小鼠尾靜脈注射等量的IgG作為對照。MCD飲食喂養4周后，針對各組小鼠血清中AST、ALT、TG、TC 等肝功能指標的變化情況進行分析。結果顯示，在注射IgG的情況下，MCD飲食組小鼠血清AST和ALT水平高于MCS組，TG和TC 水平低于MCS組；GP73中和抗體的注射則會降低由MCD飲食誘導的血清AST和ALT增高，以及提高由MCD飲食誘導的血清TG和TC 降低。該結果說明在MCD誘導NAFLD過程中注射GP73中和抗體可有效抑制NAFLD的發展。見圖2。

圖2 GP73中和抗體抑制MCD誘導的小鼠NAFLD

2.3 GP73中和抗體降低脂肪酸的合成和抑制肝纖維化的進展NAFLD的發生是從肝細胞脂肪變性開始的，其中脂蛋白和載脂蛋白的缺少，以及脂肪酸和膽固醇的積累又是細胞脂肪變性的關鍵原因。為了深入了解GP73中和抗體抑制NAFLD的機制，本研究對模型組和對照組小鼠肝臟中的脂肪酸和膽固醇合成的關鍵酶ACC1、HMGR和SREBP1的表達水平進行分析。qRT-PCR結果顯示，模型組GP73、ACC1、HMGR的轉錄水平相比對照組升高，但在MCD-NAFLD模型構建過程中注射GP73中和抗體則會降低GP73、ACC1、HMGR(圖3A～C)的轉錄水平。蛋白水平的分析結果表明，MCD飲食會增加小鼠肝臟中蛋白SREBP1的表達水平，注射GP73中和抗體則會使其降低(圖3D)。肝臟的ORO染色和HE染色的結果表明，MCD飲食會造成肝臟脂肪的大量累積，GP73中和抗體的注射會降低肝內脂滴的形成(圖3E、F)。綜上所述，GP73中和抗體降低了NAFLD過程中脂肪的累積。

此外，NAFLD發生過程中往往伴隨著肝纖維化，肝纖維化離不開肝星狀細胞在組織炎癥部位的活化以及TGF-β、TIMP1表達水平的增加[11-12]。為了研究GP73中和抗體對肝纖維化的影響，檢測了肝星狀細胞活化的標志物α-SMA以及TGF-β、TIMP1的表達水平。MCD-NAFLD模型構建后，α-SMA的蛋白水平明顯增加，注射GP73中和抗體則會使其降低(圖3D)，GP73中和抗體抑制NAFLD發生過程中肝星狀細胞的活化；與之相一致，NAFLD發生后TGF-β、TIMP1轉錄水平均升高，GP73中和抗體雖未能改變TIMP1的轉錄水平，但降低了TGF-β的轉錄水平(圖3G、H)。綜上所述，GP73中和抗體抑制NAFLD過程中的肝纖維化。

圖3 GP73中和抗體降低脂肪酸的合成和抑制肝纖維化的進展

MCD飲食會增加小鼠肝臟中α-SMA、SREBP1的蛋白表達水平和HMGR、TGF-β、TIMP1的轉錄水平，而在此過程中注射GP73中和抗體則會降低蛋白α-SMA、SREBP1的蛋白表達水平以及ACC1、HMGR和TGF-β的轉錄水平。因此，GP73中和抗體對MCD誘導的NAFLD的抑制作用可能與肝細胞脂肪酸積累和纖維化受到抑制有關。

3 討論

MCD飲食通過減少小鼠對蛋氨酸和膽堿的攝入，導致極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein，VLDL)合成減少，脂肪無法得到分解利用，脂肪不斷積累，最終形成NAFLD[13]。這一過程模擬NAFLD的形成，并且效果顯著，因此MCD飲食被廣泛應用于小鼠NAFLD模型的構建。本研究發現MCD飲食會使模型組小鼠血清AST、ALT水平升高，TG、TC 水平降低，ORO染色和HE染色中模型組小鼠肝組織切片出現大量氣球樣脂滴。以上結果均符合MCD誘導NAFLD的模型特點。除此以外，模型組小鼠在注射GP73中和抗體后，肝組織中GP73的mRNA轉錄水平和蛋白表達水平均降低，即證明此抗體符合實驗需求。

在以上述結果為基礎的情況下，本研究發現注射GP73中和抗體后能逆轉MCD導致的小鼠血清AST、ALT水平升高以及血清TG、TC 水平降低，即GP73中和抗體能抑制MCD對小鼠肝臟的影響，證明當肝臟處于病理狀態時，GP73與MCD有類似的功能或GP73能促進MCD對小鼠肝臟的影響。在針對肝組織中脂肪、膽固醇合成相關基因，以及肝纖維化相關指標的mRNA表達量的檢測中發現，相較于MCS，MCD會造成HMGR、TGF-β、TIMP1的轉錄水平升高，而當GP73被拮抗以后，ACC1、HMGR、TGF-β的轉錄水平下降。同時，Western blot也證明GP73中和抗體會降低MCD組小鼠肝組織內α-SMA和SREBP1蛋白的表達量，減緩肝細胞脂肪堆積和纖維化進程，與上述結果一致。ORO染色和HE染色結果表明，由MCD喂養的小鼠普遍存在脂肪堆積和肝細胞氣球樣變，當有GP73中和抗體參與時，脂肪堆積減少，肝細胞氣球樣變減少，脂肪病變的情況得以改善。

綜上所述，GP73可能參與調節肝細胞的病理進程，同時也證明了GP73中和抗體在治療NAFLD方面具有巨大潛力。在MCD誘導小鼠NAFLD模型的過程中，將模型組小鼠GP73拮抗后上述相關基因和蛋白的表達趨勢的變化并不能在對照組中重現，意味著僅當肝臟處于病理狀態時，GP73的減少會減緩NAFLD的進展，并且這種效果并不能在正常肝組織中體現。GP73可通過上調SCAP來激活SREPBs，進而促進肝細胞脂肪變性[7]，而當GP73被抗體中和之后，SREBP1蛋白水平隨之降低，表明SCAP-SREPBs的相互作用被抑制，脂肪合成受阻。同時，由于脂肪堆積是肝細胞脂肪變性和纖維化的基礎，當脂肪合成減少后，肝細胞脂肪變性和纖維化相關指標的表達水平也會降低。具體原因將通過多組學分析的方法，對GP73作用的基因調控靶點做更深層次的研究。