基于增材制造技術的GelMA/HA水凝膠支架的制備及其研究

劉重遠，蔣 勇，鄒多宏

骨移植修復手術是臨床上治療骨缺損常用的方法，但仍受諸多限制，如取材困難、操作要求高、排斥反應大等[1]。近年來，增材制造，又稱3D打印，為制備擬填充支架提供了新方法，它可根據骨缺損的形狀打印出尺寸匹配的修復支架，同時調控支架內部結構，滿足個體化修復的需求[2]。甲基丙烯酸酯化明膠(gelatin methacryloyl，GelMA)是明膠經改性而得的一種生物源性材料,具有出色的生物相容性、溫敏性和可降解性，作為打印墨水廣泛應用于3D打印領域[3]。羥基磷灰石(hydroxyapatite, HA)是臨床醫學上常用的合成骨替代物，常與有機聚合物形成復合支架，應用于骨組織工程的研究[4]。該研究以GelMA和HA為結構單元，通過增材制造技術構建有機/無機復合支架，對其理化性能及生物相容性進行表征和測試，旨在探索其作為填充支架應用于個體化骨缺損修復的可行性。

1 材料與方法

1.1 復合水凝膠支架的合成材料殼聚糖(高粘度，脫乙酰度≥95%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；明膠(美國Sigma-Aldrich公司)；甲基丙烯酸酐(上海麥克林生化科技有限公司)；羥基磷灰石(生物醫藥級，純度≥98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；光引發劑——苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基磷酸鋰鹽(lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate，LAP，蘇州永沁泉智能設備有限公司)。

1.2 主要的試劑與儀器MEM-α培養基(以色列BI公司)；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS，以色列BI公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；CCK-8試劑盒(日本同仁化學研究所)；Calcein-AM/PI活/死細胞雙染試劑盒(日本同仁化學研究所)；BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；生物3D打印機(Bio-Architect?WS，杭州捷諾飛生物科技股份有限公司)；掃描電鏡(Supra 40，德國Zeiss公司)；透射電鏡(HT7700，日本Hitachi公司)；酶標儀(美國Biotek公司)；倒置熒光顯微鏡(Axio Observer 3，德國Zeiss公司)。

1.3 原料合成GelMA前體合成稱10 g明膠放入圓底燒瓶中，再加入90 ml PBS溶液，置入磁力攪拌器，燒瓶外用鋁箔紙包裹嚴密，在50 ℃ 下的水浴中攪拌1～2 h。待溶液澄清透明后，增大轉速，用玻璃滴管逐滴加入6 g甲基丙烯酸酐，反應8 h。反應結束，將溶液倒入離心管，配平，離心取上清液(3 500 r/min，3 min)，棄除雜質。將上清液倒入透析分子量12 ku的透析袋內，于40 ℃ 的超凈水內進行透析，每天換水2次，避光，直至氣味完全消失。將上述透析完成的溶液的pH(1 mol/L NaHCO3)調節至7.4，分裝，冷凍(-20 ℃)，轉移冷凍樣至凍干機中，使凝膠完全干燥(7 d)，-20 ℃ 下避光儲存。

1.4 復合水凝膠支架的制備將12%的GelMA溶液與2%的HA按1 ∶1的比例混勻,形成生物墨水加入打印料筒內，在溫度為0 ℃ 的收集平臺上打印復合支架。打印速率為50 mm/s，針嘴內徑為0.34 mm，每層Z軸上升高度為250 μm，打印間距為1 mm。打印完成后進行光固化 (紫外光405 nm，3 min)，獲得GelMA/HA復合水凝膠支架。見圖1。

圖1 GelMA/HA復合水凝膠支架制備過程示意圖

1.5 微觀表征將復合支架放入真空凍干機冷凍干燥24 h，于液氮中脆斷得到樣品。選擇斷面整齊的樣品，導電膠將其固定于樣品臺側面，于低真空度的蒸金室中蒸金30 s，通過掃描電鏡(scanning electron microscope，SEM)觀察其結構特征。取HA/乙醇稀釋溶液分散至透射銅網表面，完全干燥后，通過透射電鏡 (transmission electron microscope，TEM)觀察HA形態。

1.6 力學性能測試制備尺寸為10 mm×10 mm×5 mm 的純GelMA水凝膠支架和GelMA/HA復合水凝膠支架，通過萬能力學試驗機進行單向壓縮試驗，負載為10 N，壓縮速率為1 mm/min，測試樣品的彈性模量。

1.7 大鼠骨髓間充質干細胞 (bone marrow stem cells, BMSCs)的分離與培養選取2～4周齡、體質量20～25 g的SD大鼠，頸椎脫臼法處死，浸泡于75%乙醇中15 min。無菌條件下取股骨及脛骨內的骨髓，使用含雙抗 (105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素) 及20%胎牛血清的MEM-α培養基放置到溫度為37 ℃ 并含5%CO2的培養箱中進行培養，每3 d換液一次；待細胞數量達80%左右后，用0.25%胰酶消化液進行消化，按1 ∶2或1 ∶3比例傳代，用含10%胎牛血清的MEM-α培養基進行培養，每2 d更換培養基。重復以上操作，待細胞傳至2～4代后待用。

1.8 細胞相容性檢測通過Live/Dead熒光染色評估細胞活力：制備直徑為10 mm，厚度為1.5 mm的圓柱形GelMA/HA復合支架，浸泡于75%乙醇中30 min，紫外365 nm滅菌30 min。滅菌后加入到48孔板中，每孔加入 5×104個BMSCs，37 ℃ 分別培養1、3、7 d。PBS洗滌，加入配置好的Calcein-AM/PI染色試劑，在37 ℃和5%CO2的培養箱中孵育30 min后，PBS沖洗5次，每次5 min。倒置熒光顯微鏡下觀察，活細胞呈綠色，死細胞呈紅色。通過CCK-8試劑盒測定細胞增殖：將純GelMA、GelMA/HA復合支架制備成直徑為6 mm，厚度為1 mm的圓柱形樣品，每組12個。滅菌后4個每組分別置于3個96孔板中，BMSCs鋪板，每個時間點設3個復孔，空白組僅接種BMSCs，純GelMA水凝膠支架組接種純GelMA支架，GelMA/HA復合水凝膠支架組接種GelMA/HA復合支架。37 ℃ 分別培養1、3、7 d。將CCK-8試劑與MEM-α以1 ∶10的比例混合，每孔加入110 μl混合試劑，放入37 ℃ 培養箱繼續培養2 h，隨后取出用酶標儀測量其在450 nm處的吸光度值。

1.9 細胞SEM表征將細胞與復合支架共培養3 d后取出樣品，PBS洗滌，用 4%多聚甲醛固定30 min，并在去離子水中充分漂洗。吸凈水分，加入叔丁醇浸沒樣品2 h，使其脫水。最后，換新的叔丁醇，置于真空冷凍干燥器干燥。SEM下觀察復合支架上細胞的形態。

1.10 水凝膠支架的促成骨性向MEM-α培養基加入10%胎牛血清、10-4mol/L維生素C、10-8mol/L地塞米松和0.01 mol/L β-甘油磷酸鈉制備得到成骨誘導培養基。將純GelMA支架和GelMA/HA復合水凝膠支架在37 ℃ 下浸沒于成骨誘導培養基中24 h，制備浸提液。6孔板中每孔鋪入8×104個BMSCs，在生長培養基中培養1 d后，換浸提液繼續培養。培養基每3 d更換一次，空白組細胞在生長培養基中培養。經過7 d的成骨誘導，4%多聚甲醛固定細胞，PBS洗滌，采用BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒進行ALP染色并通過光學顯微鏡進行觀察。采用Image J軟件對染色面積進行數據分析。

2 結果

2.1 GelMA/HA復合水凝膠支架表征復合水凝膠支架是通過在低溫平臺上以層層疊加的方式沉積生物墨水，經過紫外光照射3 min 后制備而成(圖2A)。照片顯示復合水凝膠支架呈乳白色，多孔網格狀，結構清晰穩定(圖2B)。SEM可見復合水凝膠支架內部成層狀結構，支架柱上有大小不一的球形孔(圖2C)，HA顆粒分散于孔壁上(圖2D)。TEM顯示HA顆粒呈明顯的層片狀結構(圖2E)。

圖2 GelMA/HA復合水凝膠支架的結構表征

2.2 水凝膠支架的力學性能純GelMA水凝膠支架組的彈性模量為(47.0±4.7)kPa，而GelMA/HA復合水凝膠支架組彈性模量為(245.3±24.5)kPa，差異有統計學意義(P<0.05)，表明HA的引入提高了復合支架的抗壓縮性能。

2.3 水凝膠支架的生物相容性倒置熒光顯微鏡下觀察，培養1 d后可見BMSCs存活于GelMA/HA復合水凝膠支架內部，形態呈圓形；7 d后，可見復合支架上的BMSCs增殖，伸展呈梭形，表明GelMA/HA對BMSCs的生長無明顯影響(圖3A)。選取純GelMA支架和GelMA/HA支架進行細胞增殖實驗，與BMSCs共培養3、7 d的純GelMA水凝膠支架組及GelMA/HA復合水凝膠支架組的吸光度值均高于空白組(P<0.05)，表明復合支架有良好的生物相容性，并且可促進BMSCs的增殖(圖3B，表1)。與復合水凝膠支架共培養3 d后，BMSCs在支架上鋪展良好(圖3C)。

圖3 GelMA/HA復合水凝膠支架的生物相容性

表1 各組支架與BMSCs共培養不同時間后吸光度值的比較

2.4 水凝膠支架對BMSCs成骨分化的影響選擇純GelMA支架、GelMA/HA復合支架的浸提液進行ALP染色實驗，光鏡下顯示GelMA/HA復合水凝膠支架組ALP 染色陽性面積高于純GelMA水凝膠支架組和空白組，差異有統計學意義(P<0.05)，表明復合水凝膠支架對BMSCs的成骨分化具有促進作用。見圖4。

圖4 成骨誘導7 d的ALP染色觀察

3 討論

隨著組織工程的快速發展和深入研究，生物支架材料作為自體骨的替代物在骨修復研究領域越來越受到關注，尤其是3D打印水凝膠支架。與傳統的骨組織支架材料比較，水凝膠支架模擬了骨基質中的有機相，同時為細胞生長提供了機械支撐，并且多孔的結構有助于氣體和營養物質在支架內互相交換，有利于細胞的生長[5-6]。此外，增材制造技術的引入降低了制備過程的復雜性，可以快速制造出各種與骨缺損形狀適配的水凝膠支架，印刷效果好，為個體化修復提供了堅實基礎。

本課題組擬將GelMA和HA混合，通過超聲破碎，使HA在GelMA體系中充分分散，形成均勻的復合生物材料墨水,增加生物墨水的粘度，增強水凝膠細絲的可控性，提高制備水凝膠支架的印刷仿真性和機械性能，更好的適配于骨缺損。微觀結構表征顯示GelMA/HA復合水凝膠支架呈清晰的層層疊加的網狀結構，內部無塌陷，具有良好的穩定性。力學性能測試結果顯示添加了HA的復合水凝膠支架的彈性模量與純GelMA支架比較，增加了4倍，提升了抗壓縮性能，可見其有助于在骨缺損空間提供支撐作用。叔丁醇真空干燥法是制備SEM生物樣品的常用方法，其以叔丁醇作為升華介質，將樣品置于真空中進行干燥，既保留了冷凍干燥法的優點，又對樣品無冷凍損傷，操作簡單，且制備的生物樣品的各項指標均較理想[13]。經叔丁醇真空干燥法制備的樣品在SEM下清晰地展示了BMSCs在復合支架上呈鋪展的生長狀態。GelMA/HA復合水凝膠支架具有良好的生物相容性，并且促進了BMSCs的增殖，可能是由于GelMA保留了明膠中促進細胞黏附的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列[14]。復合支架的多孔結構有助于氣體和營養物質在支架內的運輸也可能是促進細胞生長的另一個重要原因。同時HA的加入賦予了支架生物活性，ALP染色實驗結果顯示GelMA/HA復合水凝膠支架組的ALP染色面積增加，表明可促進BMSCs成骨分化。