慢性間歇性缺氧調(diào)控mTOR-自噬信號致小鼠焦慮和抑郁樣行為機制研究

趙振濤，程玉潔，梅金玉，陳 明

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea hyponea syndrome, OSAHS)是目前世界主要的公共衛(wèi)生難題之一，被認為是心腦血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)損傷、機體代謝功能損傷的獨立危險因素[1]，其神經(jīng)精神癥狀主要表現(xiàn)為焦慮、抑郁以及阿爾茲海默癥[2-3]。慢性間歇性缺氧(chronic intermittent hypoxia, CIH)是OSAHS的主要臨床特征之一[4]，海馬及前額葉皮層作為情感的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，易受到缺氧刺激的影響[5]。該課題組前期預(yù)實驗結(jié)果提示CIH可導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)焦慮及抑郁樣行為，由此推測小鼠出現(xiàn)焦慮和抑郁樣行為可能與其海馬或前額葉皮層的分子機制改變以及結(jié)構(gòu)損傷有關(guān)。但是關(guān)于OSAHS患者經(jīng)過治療后，其焦慮和抑郁癥狀的改善情況報道較少。因此，該研究擬通過CIH模擬OSAHS對小鼠焦慮和抑郁樣行為的影響，并探索其機制，為防治OSAHS患者出現(xiàn)焦慮和抑郁樣行為提供一定程度上的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 C57BL/6小鼠，雄性，體質(zhì)量(20±1)g，購自杭州子源實驗動物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(浙)2019-0004。

1.1.2試劑 Western blot 一抗NLRP1(1 ∶1 000, 美國Abcam公司)、NLRP3(1 ∶800, 美國Abcam公司)、Atg7(1 ∶1 000, 美國CST公司)、p62(1 ∶1 000, 美國Affinity公司)、mTOR(1 ∶1 000, 美國Affinity公司)、p-mTOR(1 ∶1 000, 美國Affinity公司)、β-actin(1 ∶5 000, 美國Affinity公司)，二抗(1 ∶10 000, 美國Affinity公司)，BCA蛋白濃度檢測試劑盒(美國Rockford Biotechnology Company公司)。

1.1.3主要儀器 全自動樣品冷凍研磨儀(上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司)、水平搖床(天津歐諾儀器股份有限公司)、電泳儀(美國Bio-Rad公司)、全波長酶標儀(美國Thermo Fisher公司)、電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)、KDC-120HR高速冷凍離心機(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)、Chemi Doc TMMP Imaging System(美國Bio-Rad公司)、TST-100懸尾視頻分析系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司)、曠場圖像采集及分析系統(tǒng)(上海欣軟信息科技有限公司)。

1.2 分組與動物模型建立小鼠常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機分為對照組(Ctrl組)和CIH組，每組7只。參照Zhang et al[6]的CIH造模方法，并根據(jù)本研究實際情況對造模方法進行適當(dāng)調(diào)整。Ctrl組在正常空氣環(huán)境中常規(guī)飼養(yǎng)。CIH組每天8:00—16:00 將小鼠置于動物間歇低氧艙中，艙內(nèi)氧濃度維持在6%～21%(艙內(nèi)氧氣濃度30 s內(nèi)由21%降低至6%并維持30 s，然后在12 s內(nèi)升高至21%并維持18 s，每個循環(huán)90 s)，持續(xù)8周，CIH組間歇性缺氧過程自由進食水。

1.3 小鼠行為評價試驗

1.3.1小鼠運動功能和焦慮狀態(tài)評價 使用曠場實驗進行小鼠焦慮狀態(tài)評價。測試箱(96 cm×96 cm×50 cm)分成9個相等的正方形。首先，將小鼠放置于測試箱中央?yún)^(qū)域，自由活動適應(yīng)2 min后，拍攝3 min內(nèi)小鼠在實驗箱內(nèi)的活動情況，分析運動軌跡，計算運動距離、平均速度、進入中央?yún)^(qū)域時間、穿線次數(shù)。每只小鼠實驗后，清潔測試箱的四周和底壁，以消除嗅覺信號，并擦干測試箱，以消除嗅覺信號。

1.3.2小鼠抑郁狀態(tài)評價 應(yīng)用懸尾實驗評價小鼠抑郁狀態(tài)。實驗時，從每組隨機選取3～4只小鼠，用夾子夾住尾尖1 cm處，隨后將小鼠倒立懸吊于實驗艙內(nèi)，小鼠腹部正對攝像機，測試時間為6 min，由監(jiān)控系統(tǒng)拍攝記錄小鼠實驗后4 min內(nèi)的活動情況，計算累積不動時間。

1.4 Western blot 檢測小鼠海馬及前額葉皮層的炎性小體、自噬相關(guān)蛋白行為測試結(jié)束后，先麻醉兩組小鼠，然后斷頭處死動物，解剖腦組織，冰上取出海馬及前額葉皮層組織。根據(jù)BCA蛋白質(zhì)濃度檢測試劑盒操作說明測定海馬及前額葉皮層總蛋白濃度。根據(jù)總蛋白濃度確定上樣量，10% SDS-PAGE用于分離樣品。經(jīng)過上樣、電泳(75 V, 45 min；120 V, 1 h)、轉(zhuǎn)膜(200 mA, 1 h；300 mA, 30 min) 、封閉(5%脫脂奶粉)、一抗4 ℃過夜、TBST洗膜、二抗孵育、TBST洗膜，最后加入顯影液，使用Chemi Doc TMMP成像系統(tǒng)及專業(yè)分析軟件進行分析。以β-actin為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 CIH對小鼠曠場實驗中行為的影響與Ctrl組比較，CIH組小鼠在曠場實驗中的運動距離、穿線次數(shù)、平均運動速度降低(t=6.377、6.131、6.362，均P<0.001)，表明CIH可以一定程度上影響小鼠的運動功能；此外，與Ctrl組比較，CIH組小鼠在曠場實驗中的中央?yún)^(qū)域時間減少(t=9.295，P<0.001)，表明CIH可導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)焦慮樣行為。見圖1。

圖1 曠場實驗

2.2 CIH對小鼠懸尾不動時間的影響在懸尾實驗中，與Ctrl組比較，CIH組小鼠的不動時間增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義[(68.59±35.75) svs(161.93±38.76) s，t=4.684，P<0.001],提示經(jīng)過8周的CIH，小鼠出現(xiàn)抑郁樣行為。見圖2。

圖2 懸尾實驗

2.3 CIH對小鼠海馬區(qū)神經(jīng)炎癥的影響采用Western blot方法檢測兩組小鼠海馬及前額葉皮層組織中炎性小體含量，發(fā)現(xiàn)CIH組小鼠海馬中的NLRP3(t=15.320，P<0.001)水平上調(diào)，而NLRP1(t=1.159，P>0.05)保持不變；CIH組小鼠前額葉皮層中NLRP3(t=0.049 15，P>0.05)、NLRP1(t=1.656，P>0.05)均無明顯改變，表明CIH可誘導(dǎo)小鼠海馬區(qū)發(fā)生神經(jīng)炎癥。見圖3。

圖3 CIH對炎癥小體水平的影響

2.4 CIH對小鼠海馬區(qū)自噬水平的影響通過Western blot檢測了CIH后小鼠海馬及前額葉皮層組織中自噬相關(guān)蛋白的水平，發(fā)現(xiàn)CIH組小鼠海馬組織中Atg7水平下降(t=3.511，P<0.05)，而p62(t=2.059，P>0.05)水平無明顯改變；前額葉皮層中Atg7(t=0.170 3，P>0.05)、p62(t=0.813 3，P>0.05)水平均無明顯改變，提示CIH可降低小鼠海馬區(qū)自噬水平。見圖4。

圖4 CIH對自噬水平的影響

2.5 CIH對小鼠海馬區(qū)mTOR信號的影響同時，AMPK促進自噬啟動，m-TOR是自噬途徑的負調(diào)節(jié)因子。AMPK通過直接磷酸化和抑制m-TOR磷酸化來激活細胞自噬，m-TOR磷酸化水平增加可抑制機體自噬水平。為了探討CIH是否通過m-TOR途徑影響自噬，本研究同時檢測了CIH后小鼠海馬區(qū)及前額葉皮層中m-TOR途徑相關(guān)蛋白的水平，發(fā)現(xiàn)小鼠海馬組織中p-mTOR水平上調(diào)(p-mTOR/β-actin、p-mTOR/mTOR的t值分別是4.709、5.076，均P<0.05)，而前額葉皮層中mTOR(t=0.172，P>0.05)及p-mTOR(p-mTOR/β-actin、p-mTOR/mTOR的t值分別是0.623 3、0.907 7，P>0.05)水平均無明顯改變，表明CIH可通過激活mTOR磷酸化，產(chǎn)生過量p-mTOR，從而推測p-mTOR抑制上述小鼠海馬區(qū)的自噬水平。見圖5。

圖5 CIH對mTOR-自噬途徑蛋白水平的影響

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，CIH 8周后，小鼠出現(xiàn)焦慮抑郁樣行為。Western blot 結(jié)果提示CIH組小鼠海馬區(qū)NLRP3、p-mTOR增加，Atg7降低，由此推測，CIH通過激活mTOR磷酸化，從而抑制自噬水平，導(dǎo)致NLRP3累積增加，最終引起海馬區(qū)損傷，出現(xiàn)焦慮抑郁樣行為。這可能在一定程度上解釋OSAHS患者罹患焦慮抑郁癥的機制，為臨床防治提供基礎(chǔ)研究理論。

抑郁癥是一種以心境低落為核心的情感障礙，可有焦慮、精力減退等多方面表現(xiàn)。研究[7]表明，OSAHS患者的焦慮抑郁癥狀患病率遠高于非OSAHS人群，長期焦慮抑郁會導(dǎo)致睡眠質(zhì)量不佳等，加重OSAHS癥狀，形成惡性循環(huán)。

目前焦慮、抑郁的發(fā)病機制假說主要包括炎癥假說、細胞自噬假說等。炎癥假說指出過度激活的炎癥反應(yīng)在抑郁癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[8]。神經(jīng)炎癥是對組織損傷的一種先天免疫反應(yīng)，在許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用，其特點是小膠質(zhì)細胞的激活，伴炎癥因子和趨化因子水平的升高[9]。炎性小體是先天免疫反應(yīng)的重要組成部分，參與炎癥相關(guān)神經(jīng)疾病的發(fā)生與發(fā)展[10]，而NLRP3作為一種目前研究比較深入的炎性小體，由NLRP3蛋白、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白和Caspase-1組成，可被多種外源性及內(nèi)源性刺激激活，如感染、損傷、代謝產(chǎn)物等。應(yīng)激狀態(tài)下，免疫細胞被激活，凋亡相關(guān)斑點樣蛋白由胞核移位到胞漿，招募并活化Caspase-1前體蛋白，活化的Caspase-1能夠促進pro-IL-1β、pro-IL-18的成熟活化并釋放到胞外，引發(fā)炎癥反應(yīng)[11]。 炎癥反應(yīng)的發(fā)生又會進一步激活NLRP3，如此循環(huán)反復(fù)，進一步加重炎癥反應(yīng)，最終引起組織損傷，誘發(fā)疾病。另外，研究[12]表明，抑郁狀態(tài)下海馬區(qū)NLRP3水平呈過度激活狀態(tài)，而敲除NLRP3基因的小鼠，在慢性刺激下不會出現(xiàn)抑郁樣行為。本研究中，小鼠在CIH 8周后出現(xiàn)明顯的焦慮和抑郁樣行為，Western blot結(jié)果提示CIH組小鼠海馬區(qū)NLRP3顯著升高。這可能是由于CIH作為一種損害信號，能夠激活NLRP3，最終驅(qū)動炎癥反應(yīng)的發(fā)生。而中樞神經(jīng)系統(tǒng)中NLRP3主要表達于小膠質(zhì)細胞[13]，其過度激活，誘導(dǎo)產(chǎn)生神經(jīng)炎癥，最終引起海馬區(qū)損傷。

自噬是真核細胞通過溶酶體途徑降解和再利用細胞質(zhì)成分的過程，是細胞自我保護的重要機制。自噬受多種信號分子的調(diào)控，mTOR是其中最重要的信號分子之一，是自噬的負調(diào)節(jié)因子，在正常生理條件下，磷酸化mTOR能夠抑制細胞自噬[14]。機體處于穩(wěn)態(tài)時，自噬處于低水平狀態(tài)，但是在神經(jīng)元中自噬處于活躍狀態(tài)，有利于維持神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)、功能、存活。有研究[15]表明，抑制神經(jīng)元自噬水平，其存活率下降。本研究中，Western blot結(jié)果提示CIH 8周后，小鼠海馬區(qū)p-mTOR水平增加，Atg7水平降低，提示CIH可通過激活mTOR，誘導(dǎo)其磷酸化，產(chǎn)生p-mTOR，最終抑制海馬區(qū)自噬水平，從而引起海馬區(qū)神經(jīng)元的損傷。

本研究結(jié)果表明，CIH 8周后，小鼠海馬區(qū)NLRP3、p-mTOR水平增加，Atg7水平降低，可能是由于CIH激活mTOR，抑制小鼠海馬區(qū)自噬水平，導(dǎo)致神經(jīng)炎癥介質(zhì)累積，NLRP3水平升高，引起海馬區(qū)損傷。

綜上所述，CIH通過激活mTOR抑制海馬區(qū)自噬水平并累積過量的NLRP3，最終引起海馬區(qū)損傷，出現(xiàn)焦慮和抑郁樣行為。因此，提高海馬區(qū)自噬水平及降低海馬區(qū)NLRP3水平可能成為防治OSAHS患者出現(xiàn)焦慮及抑郁癥狀的新靶點。