下調lncRNA SPINT1-AS1通過靶向miR-211-5p對卵巢癌細胞生長和侵襲的影響

曾友玲，張 清，曾 潔，王 歡，侯 俐

卵巢癌是世界范圍內最常見的生殖系統腫瘤之一，惡性程度較高[1-2]。卵巢癌的治療在近十幾年中得到較大的發展，然而多數患者的預后仍不能滿足臨床需求[3]。高度的增殖性和侵襲性是卵巢癌預后較差的重要原因之一[4]。探討卵巢癌生長和轉移的分子發生機制，是卵巢癌有效分子治療靶點研究的重要方向。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是細胞內具有重要功能的單鏈RNA分子，其廣泛參與眾多疾病的進展[5-6]。近年的研究[7-9]證實，卵巢癌組織中存在lncRNA的異常表達，其表達水平與卵巢癌的耐藥性、放療敏感性密切相關。lncRNA在卵巢癌中的功能引起了研究們的廣泛關注。lncRNA SPINT1-AS1是目前發現的在惡性腫瘤中高表達的lncRNA，沉默lncRNA SPINT1-AS1的表達具有抑制細胞惡性侵襲和生長的作用[10-12]。該研究通過DIANA TOOLS數據庫發現lncRNA SPINT1-AS1和miR-211-5p可能互為靶向關系。miR-211-5p是一個在卵巢癌中表達下調的抑癌基因，恢復其表達可抑制卵巢癌的生長和進展[13]。該研究通過檢測卵巢癌組織和細胞系中lncRNA SPINT1-AS1的表達，旨在探究下調lncRNA SPINT1-AS1對卵巢癌SKOV-3細胞增殖和侵襲的影響，驗證lncRNA SPINT1-AS1在卵巢癌細胞中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞與試劑 永生化卵巢上皮細胞IOSE80、卵巢癌細胞系(SKOV-3、A2780、OC3、HO-8910)均購自中國科學院上海細胞庫。Lipofectamine 3000轉染試劑購自美國Thermo Fisher公司。胎牛血清和細胞培養基均購自美國Hyclone公司。lncRNA SPINT1-AS1 siRNA(CAGGATCGAAGA-GGGCGCA)、mimics control、miR-211-5p mimics、siRNA control均由武漢巴菲爾生物技術服務公司構建。熒光素酶報告載體SPINT1-AS1野生型(WT)、SPINT1-AS1突變型(MUT)載體由上海劍鈍生物科技有限公司構建。MTT試劑盒和Transwell小室購自大連美侖生物技術有限公司。山羊抗兔一抗β-Tubulin、PCNA、CyclinD1、MMP2、MMP9均購自美國Abcam公司(ab18207、ab29、ab16663、ab92536、ab76003)。

1.2 方法

1.2.1生物信息學方法 通過GEPIA數據庫分析卵巢癌組織和正常組織中lncRNA SPINT1-AS1的表達差異。通過DIANA TOOLS數據庫對lncRNA SPINT1-AS1的靶基因進行預測。

1.2.2細胞培養、分組與轉染 將OC3細胞接種在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基，將SKOV-3、A2780、HO-8910、IOSE80細胞接種在含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基。將對數生長期的SKOV-3細胞接種到12孔板，根據Lipofectamine 3000說明書將lncRNA SPINT1-AS1 siRNA或siRNA control分別轉染至SKOV-3細胞中，命名為si-SPINT1-AS1組和si-NC組。轉染48 h后，測定各組SKOV-3細胞中lncRNA SPINT1-AS1表達變化。

1.2.3熒光實時定量聚合酶鏈反應(fluorescence real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)測定lncRNA SPINT1-AS1和miR-211-5p表達 提取永生化卵巢上皮細胞IOSE80、卵巢癌細胞系(SKOV-3、A2780、OC3、HO-8910)的總RNA，逆轉錄反應得到cDNA。配制qRT-PCR反應體系，GAPDH作為lncRNA SPINT1-AS1表達量的參照，U6作為miR-211-5p表達量的參照。引物的序列如下，GAPDH F：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，R：5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3′；lncRNA SPINT1-AS1 F：5′-GCCCTGGAGGATGAGAG-3′，R：5′-CAGATGC-TGTTGGCTAAAGA-3′；U6 F：5′-CTCGCTTCGGCAG-CACA-3′，R：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-211-5p F：5′-CTCGAGTAACCGTATTGTTCGCGTCATGCCAGCA-3′，R：5′-GCGGCCGCCAGACCATGTGTCCCATTTG-3′。利用2-ΔΔCt法計算lncRNA SPINT1-AS1和miR-211-5p的相對表達水平。

1.2.4MTT方法檢測SKOV-3細胞的增殖活性 將SKOV-3細胞按照si-SPINT1-AS1組(轉染lncRNA SPINT1-AS1 siRNA)和si-NC組(轉染siRNA control)的分組方法接種于96孔板，每孔3 000個細胞。于第1、2、3、4、5 天，每孔加25 μl的MTT試劑，在培養箱內結合3 h。每孔加125 μl的二甲基亞砜試劑，震蕩30 min，酶標儀測定每孔SKOV-3細胞在450 nm波長的吸光度(A)值，代表各組SKOV-3細胞的增殖活性。

1.2.5Transwell小室實驗檢測SKOV-3細胞的侵襲能力 用無血清的培養基以1 ∶7稀釋基質膠，包被Transwell小室。用無血清的培養基重懸si-SPINT1-AS1組和si-NC組SKOV-3細胞，在Transwell底部加含10%血清的培養基，培養箱孵育24 h。棉簽擦出濾膜上層的細胞，用多聚甲醛固定35 min，在結晶紫中染色40 min。倒置顯微鏡下(100倍視野)觀察細胞，取5個視野，統計分析每組侵襲細胞數。

1.2.6雙熒光素酶報告基因實驗分析lncRNA SPINT1-AS1對miR-211-5p的靶向作用 DIANA TOOLS數據庫預測發現lncRNA SPINT1-AS1和miR-211-5p之間存在互補結合位點。把熒光素酶報告載體野生型WT以及突變型MUT分別和mimics control、miR-211-5p mimics共轉染至SKOV-3細胞。常規培養48 h，參照雙熒光素酶測定試劑盒說明書測定各組SKOV-3細胞中熒光素酶的活性。

1.2.7Western blot檢測PCNA、CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達 提取si-SPINT1-AS1組和si-NC組SKOV-3細胞總蛋白，電泳儀電壓為120 V，電泳100 min。轉膜電壓為110 V，轉膜110 min。將硝酸纖維素膜在6%的牛血清白蛋白中封閉，保證非特異性結合位點全部封閉。將硝酸纖維素膜在含有β-Tubulin、PCNA、CyclinD1、MMP2、MMP9抗體稀釋液(均按1 ∶1 000稀釋)的玻璃皿中結合13 h。將硝酸纖維素膜在含有二抗稀釋液的玻璃皿中結合3 h。滴加化學發光液，顯色和拍照，將β-Tubulin作為參照蛋白。

2 結果

2.1 lncRNA SPINT1-AS1在卵巢癌組織中的表達lncRNA SPINT1-AS1由250個核苷酸組成，其結構示意圖見圖1。GEPIA數據庫顯示(圖2)，lncRNA SPINT1-AS1在卵巢癌組織中的表達水平高于正常組織(P<0.01)。

圖1 lncRNA SPINT1-AS1的結構示意圖

圖2 lncRNA SPINT1-AS1在卵巢癌組織和正常組織中的表達

2.2 lncRNA SPINT1-AS1在卵巢癌細胞中的表達qRT-PCR結果顯示(圖3)，與永生化卵巢上皮IOSE80細胞比較，卵巢癌細胞系(SKOV-3、A2780、OC3、HO-8910)中lncRNA SPINT1-AS1的表達水平升高(P<0.05)，SKOV-3細胞中lncRNA SPINT1-AS1的表達水平最高(F=20.46，P<0.01)。

圖3 lncRNA SPINT1-AS1在永生化卵巢上皮細胞和卵巢癌細胞系中的表達

2.3 兩組SKOV-3細胞中lncRNA SPINT1-AS1的下調效率qRT-PCR結果顯示，lncRNA SPINT1-AS1在si-SPINT1-AS1組和si-NC組的SKOV-3細胞中相對表達量分別為(1.06 ± 0.36)和(6.38 ± 0.77)，si-SPINT1-AS1可有效下調SKOV-3細胞中lncRNA SPINT1-AS1的表達(t=6.24，P<0.01)。

2.4 下調lncRNA SPINT1-AS1表達對SKOV-3細胞增殖活性的影響MTT法檢測顯示(圖4)，與si-NC組比較，si-SPINT1-AS1組SKOV-3細胞接種2 d后，吸光度降低(P<0.05)，下調lncRNA SPINT1-AS1抑制了SKOV-3細胞的增殖活性。

圖4 下調lncRNA SPINT1-AS1表達對SKOV-3細胞增殖活性的影響

2.5 下調lncRNA SPINT1-AS1表達對SKOV-3細胞侵襲能力的影響Transwell小室實驗顯示(圖5)，si-NC組侵襲細胞數(113.90 ± 11.96)個/視野明顯多于si-SPINT1-AS1組侵襲細胞數(44.27 ± 10.95)個/視野(t=4.30，P<0.01)，下調lncRNA SPINT1-AS1抑制了SKOV-3細胞的侵襲能力。

圖5 下調lncRNA SPINT1-AS1對SKOV-3細胞侵襲能力的影響

2.6 lncRNA SPINT1-AS1和miR-211-5p互為靶向關系DIANA TOOLS數據庫預測lncRNA SPINT1-AS1的靶向基因結果顯示(圖6)，miR-211-5p和lncRNA SPINT1-AS1存在互補結合位點。雙熒光素酶報告系統鑒定顯示(圖7)，共轉染WT與miR-211-5p mimics后熒光素酶活性較WT與mimics control明顯降低(t=6.36，P<0.01)，定點突變后，共轉染MUT與miR-211-5p mimics較MUT與mimics control熒光素酶活性無明顯差異(t=0.40，P=0.71)，表明lncRNA SPINT1-AS1和miR-211-5p互為靶向關系。

圖6 lncRNA SPINT1-AS1互補結合miR-211-5p的序列區域

圖7 雙熒光素酶報告系統鑒定lncRNA SPINT1-AS1和miR-211-5p互為靶向關系

2.7 下調lncRNA SPINT1-AS1對SKOV-3細胞中miR-211-5p表達的情況qRT-PCR結果顯示，si-NC組SKOV-3細胞中miR-211-5p相對表達量(1.03 ± 0.43)明顯低于si-SPINT1-AS1組相對表達量(5.33 ± 0.69)，下調lncRNA SPINT1-AS1能夠增加miR-211-5p的表達(t=5.27，P<0.01)。

2.8 下調lncRNA SPINT1-AS1的SKOV-3細胞中PCNA、CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白的表達Western blot檢測發現(圖8)，下調lncRNA SPINT1-AS1后，增殖表型蛋白PCNA、CyclinD1表達水平降低，轉移表型蛋白MMP2、MMP9表達水平降低。

3 討論

lncRNA是一種在人體細胞中發揮廣泛調節功能的內源性RNA，與消化系統疾病、內分泌系統疾病、生殖系統疾病等密切相關[14-16]。lncRNA與卵巢癌的發病有關，TTN-AS1[17]等lncRNA能夠有效減少卵巢癌細胞的數量，阻礙卵巢癌的進展。MCM3AP-AS1[18]、LINC00176[19]等lncRNA能夠延緩卵巢癌細胞的凋亡，增強卵巢癌細胞抵御化療藥物的殺傷作用。lncRNA SPINT1-AS1是近年來新發現的與腫瘤發生相關的lncRNA。Zhou et al[10]研究發現，lncRNA SPINT1-AS1在乳腺癌患者血清和乳腺癌細胞系中上調，lncRNA SPINT1-AS1敲低后乳腺癌細胞的增殖和遷移能力降低，其可能通過結合let-7促進乳腺癌進展。Li et al[12]研究發現，lncRNA SPINT1-AS1在結直腸癌組織中高表達，其與區域淋巴結轉移、遠處轉移和較短的無復發生存時間相關，lncRNA SPINT1-AS1是結直腸癌患者的獨立預后因素，同時在手術切除后的lncRNA SPINT1-AS1患者血清外泌體中觀察到lncRNA SPINT1-AS1表達水平降低。lncRNA SPINT1-AS1是一種腫瘤促進因子。

本研究結果顯示，lncRNA SPINT1-AS1在卵巢癌組織中的表達水平高于正常組織，在卵巢癌細胞系中的表達水平高于正常卵巢上皮細胞，表明lncRNA SPINT1-AS1在卵巢癌中可能發揮促癌功能，與上述的研究報道一致。本研究在SKOV-3細胞中轉染si-SPINT1-AS1下調lncRNA SPINT1-AS1的表達水平，發現下調lncRNA SPINT1-AS1后SKOV-3細胞增殖活性和侵襲能力降低，同時SKOV-3細胞增殖表型蛋白PCNA、CyclinD1表達水平降低，SKOV-3細胞轉移表型蛋白MMP2、MMP9表達水平降低，提示下調lncRNA SPINT1-AS1具有改善卵巢癌惡性增殖和侵襲的作用。

lncRNA發揮調節作用的方式是通過與微小RNA(miRNA)以堿基互補配對的方式進行結合，特異性下調miRNA的表達，從而調節細胞的各方面功能[5]。例如，SDHAP1通過與miR-4465相互作用影響卵巢癌細胞對紫杉醇的抗性[7]。本研究通過DIANA TOOLS數據庫預測lncRNA SPINT1-AS1和miR-211-5p可能互為靶向關系，具有互補結合區域。miR-211-5p在乳頭狀甲狀腺癌、膀胱癌、口腔鱗狀細胞癌等很多惡性腫瘤中低表達，是一種腫瘤抑制因子[20]。miR-211-5p在卵巢癌中低表達，上調miR-211-5p能夠抑制卵巢癌SKOV3細胞的增殖、細胞周期和細胞轉移，促進SKOV3細胞凋亡，同時降低卵巢癌細胞對紫杉醇的耐藥[13]。本研究結果表明，lncRNA SPINT1-AS1能夠靶向結合miR-211-5p，且下調lncRNA SPINT1-AS1能夠促進miR-211-5p的表達，表明lncRNA SPINT1-AS1作用機制與miR-211-5p有關。

綜上所述，lncRNA SPINT1-AS1在卵巢癌組織和細胞系中高表達，下調lncRNA SPINT1-AS1可抑制卵巢癌SKOV-3細胞的增殖活性和侵襲能力，其機制與靶向促進miR-211-5p表達有關。本研究為lncRNA SPINT1-AS1在卵巢癌靶向治療的應用研究提供了參考。